2. 宁夏农林科学院固原分院, 固原 756000
2. Guyuan Branch of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Guyuan 756000, China
牛肉具有高蛋白、低脂肪和低胆固醇等特点[1]，其营养价值高于其它肉类[2]。随着人们生活水平的提高，消费者对肉类品质的要求也越来越高。肌内脂肪含量是影响肉类品质的主要因素之一，与肉的嫩度及多汁性密切相关[3]。前期研究表明，肌内脂肪含量除了受遗传、环境和营养水平等因素影响外，更多的取决于基因的控制[4-6]。因此，从基因层面探究调控肌内脂肪沉积的分子机制非常必要。IRX3基因是Iroquois同源盒基因家族的成员之一，在脊椎动物胚胎形成过程中起重要作用[7-8]。最新研究表明，IRX3是调控脂肪组织的重要因子，并对脂肪沉积有重要影响[9]。另外，一直以来人们都认为肥胖主要是由FTO基因突变导致的，但实际上是由FTO基因上游较远位置的IRX3基因与其相互作用而引起的[9]。因此，IRX3基因在个体脂肪组织形成过程中扮演着重要角色。
目前，有关牛IRX3基因的研究报道较少。本研究利用实时荧光定量技术检测IRX3基因在牛不同组织中的表达情况，同时，克隆IRX3基因启动子序列，利用双荧光素酶报告技术检测核心启动子区域，并结合在线网站预测、定点突变以及siRNA干扰技术鉴定影响牛IRX3基因的关键转录因子，初步阐明其转录调控机制，为牛的分子育种提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验样品采集3头成年公牛(20月龄)心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织，同时采集血液样本于液氮中备用。
1.2 主要试剂总DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和SYBR@ PrimixExTaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒、PMD19-T (simple)载体、T4DNA Ligase、高保真PCR扩增酶GXL、DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；限制性内切酶ScaⅠ、BglⅡ购自美国NEB公司；DNA胶快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pGL3-Basic质粒及双荧光素酶基因内参pRL-TK载体、Dual-Luciferase® Reporter Assay System双荧光素酶报告系统均购自Promega公司；PBS、DMEM培养基购自Hyclone公司；Lipofectamine 3000 Reagent脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；胎牛血清、OPTI-MEM培养基购自GIBCO公司；QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒购自Stratagene公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，干扰siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成。
1.3 牛IRX3表达量的实时荧光定量检测提取牛组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其RNA质量。使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒进行反转录组织总cDNA合成，保存于-20 ℃。设计IRX3定量引物，选用GAPDH作为内参基因，用SYBR@ PrimixExTaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒进行实时定量PCR，检测其在各待测组织中的表达情况。反应体系为20 μL：Primix ExTaq Ⅱ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反应在7500 Real Time PCR仪(ABI公司产品)上进行。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，循环40次，进行3个生物学重复试验，采用2－ΔΔCt法处理数据并分析相对表达量[10]，使用SPSS软件进行单因素方差分析。
1.4 牛IRX3基因启动子克隆及逐段缺失片段的PCR扩增提取牛外周血基因组DNA，置于4 ℃备用。根据GenBank中牛IRX3基因的启动子序列(NC_037345，22 618 410-22 620 410)，应用引物设计软件Primer 5.0设计1对用于扩增牛IRX3基因启动子区-1871/+100的引物(PF和PR，表 1)。以牛外周血基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为50 μL：1× PrimeSTAR GXL Buffer，200 μmol·L-1dNTP Mixture，上下游引物各0.25 μmol·L-1，模板100 ng，2.5 U PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。扩增条件：98 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，68 ℃ 2 min，35个循环。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化，连接于PMD19-T(Simple)载体转化到DH5α感受态细胞中进行单克隆筛选后测序，同时使用MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/)在线软件对获得的IRX3基因启动子区CpG岛等序列进行分析。进一步设计6条逐段缺失片段引物(IRX3-P1、IRX3-P2、IRX3-P3、IRX3-P4、IRX3-P5、和IRX3-P6)，并添加Sca Ⅰ、Bgl Ⅱ双酶切位点，引物信息见表 1，以测序正确的序列作为模板进行逐段缺失PCR扩增，扩增条件同上，将扩增片段进行测序鉴定。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers used in this study |
使用相同的内切酶Sca Ⅰ和Bgl Ⅱ在37 ℃酶切pGL3-Basic载体1 h，用T4连接酶在16 ℃恒温仪上连接纯化后的6个牛IRX3基因逐段缺失启动子目的片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑选阳性单克隆菌落，进一步测序鉴定。将测序正确的逐段缺失阳性单克隆过夜扩大培养，使用去内毒素试剂盒提取质粒，并进行质粒浓度和纯度鉴定。
1.6 细胞培养、转染及酶活测定培养生长状态良好的3T3-L1和C2C12细胞系(培养基含10% FBS+90% DMEM)，按每孔1×105个细胞的密度接种至24孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞单层长至70%~80%融合时进行质粒转染。为研究牛IRX3基因启动子不同区域的转录活性，分别转染构建好的牛IRX3基因启动子5′端缺失片段重组质粒800 ng和20 ng内参质粒pRL-TK共转染C2C12细胞，按照Lip3000转染试剂盒说明进行试验操作。pGL3-Basic质粒为阴性对照，pGL3-Control为阳性对照，每组试验重复3次。转染48 h后收集细胞。使用Promega公司双荧光检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性(F值)和海肾荧光素酶活性(R值)，通过计算其比值(Luc)确定IRX3基因核心启动子片段。
1.7 NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1关键转录因子鉴定通过在线软件Genomatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector)和TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/re-search/db/TFSEARCH.html)预测核心启动子潜在结合转录因子，设计点突变引物，使用QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒对潜在结合转录因子位点进行关键碱基突变，具体操作方式参考试剂盒说明。突变、未突变及阴性对照分别转染细胞并进行酶活测定，具体操作方法同上。合成目标转录因子siRNA干扰序列：核呼吸因子1(NRF1-CAACCUGCCUGUAGAAGAATT)[11]、Krüppel样因子4(KLF4-CCUUACACAUGAAGAGGCATT)[12]、同源框基因5(HOXA5，sc-38679，Santa Cruz)和环磷腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1-AAUACAGCUGGCUAACAAUGGTT)[13]及阴性对照(NC)(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)，与核心启动子双荧光素酶报告载体共转染细胞，24孔板中培养3T3-L细胞，800 ng的核心启动子区双荧光素酶报告载体和50 nmol·L-1的各siRNAs共转染，于转染24 h后裂解细胞并检测酶活变化，具体操作同上。
1.8 数据分析数据结果以“平均值±标准差”表示，显著性检验数据使用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(P＜0.05认为差异显著，用*表示；P＜0.01认为差异极显著，用**表示)。
2 结果 2.1 牛IRX3基因的组织表达规律定量结果显示，IRX3基因在牛不同组织中均有表达(图 1)。以脾中的表达量为参照，IRX3基因在牛13个不同组织中相对表达量见图 1。
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图 1 IRX3基因在牛不同组织中表达量分析 Fig. 1 Expression analysis of the bovine IRX3 in different tissues |
基因在肺、肾中表达量极显著高于其它各组织(P < 0.01)，其次, 在心、皮下脂肪、背最长肌中高表达(P < 0.05)；而在肝、大肠、网胃、小肠、瘤胃、睾丸、皱胃及脾中表达量较低。
2.2 牛IRX3基因结构分析及启动子克隆牛IRX3基因定位于牛18号染色体(NC_037345.1 22615021……22618410)，全长3 390 bp，包括4个外显子和3个内含子，编码502个氨基酸(图 2)。设计其5′侧翼区1.8 kb引物(PF和PR)，成功克隆到IRX3基因－1 871/+100 bp启动子区域(图 3)。通过在线软件分析发现，IRX3基因启动子区GC含量较高，且存在8个CpG岛(箭头所指深色区域为island 1~8，图 3)。
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图 2 牛IRX3基因结构示意图 Fig. 2 Schematic diagram of bovine IRX3 gene structure |
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图 3 牛IRX3基因启动子CpG岛预测 Fig. 3 The prediction of CpG islands in bovine IRX3 promoter |
用逐段缺失启动子引物进行PCR扩增，分别得到6个逐段缺失的启动子片段，连接pGL3-Basic载体构建重组质粒，将构建的重组质粒按照扩增片段位置分别命名为：pIRX3－1 871/+100、pIRX3－1 524/+100、pIRX3－1 152/+100、pIRX3-762/+100、pIRX3－372/+100和pIRX3－42/+100。重组质粒经Sca Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切及测序鉴定。使用Lip3000脂质体将6个正确的重组质粒和pGL3-Basic质粒分别转染3T3-L1及C2C12细胞系，检测启动子活性(图 4)。结果显示，逐段缺失启动子活性片段，发现当缺失IRX3基因启动子区－372/－42 bp序列后，双荧光素酶报告载体pIRX3－42/+100较pIRX3－372/ +100活性在3T3-L1及C2C12细胞系中极显著下降(P < 0.01)，分别下降了73.2%和67.8%(图 4)。这一结果说明，IRX3基因5′端上游1.8 kb序列是启动子区，具有调控基因转录活性功能，－372/－42 bp启动子区域为IRX3基因核心转录区，且IRX3基因在3T3-L1细胞系的转录活性高于C2C12，这也反映出3T3-L1细胞系更适合IRX3基因转录活性测定。
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*. P < 0.05, **. P < 0.01, n=3, the same as below 图 4 IRX3基因核心启动子鉴定 Fig. 4 Identification of core promoter of IRX3 gene |
用Genomatix和TFSEARCH软件对牛IRX3基因核心启动子区域－372/－42 bp的关键转录因子进行预测分析，结果显示，牛IRX3基因核心启动子区包含NRF1、KLF4、HOXA5及CREB1这4个重要转录因子结合位点(图 5)，且其全部位于CpG岛island 1内。设计NRF1、KLF4、HOXA5及CREB1转录因子定点突变引物，将突变后的目标载体转入3T3-L1细胞系酶活测定。结果显示，突变NRF1位点后酶活较对照组上升了23.8%(P < 0.05)，突变KLF4位点后酶活较对照组下降了16.9%(P < 0.05)，HOXA5位点突变后酶活较对照下降了29.1%(P < 0.01)，突变CREB1位点后酶活较对照组下降了10.2%(P < 0.05, 图 6)。进一步使用NRF1、KLF4、HOXA5及CREB1转录因子干扰siRNA与对照组共转染3T3-L1，结果显示，siRNA-NRF1、siRNA-KLF4及siRNA-HOXA5、siRNA-CREB1共转染pIRX3-372/+100分别较NC对照组上升了15.3%(P < 0.05)，下降了11.4%(P < 0.05)、25.9%(P < 0.01)和12.7%(P < 0.05，图 7)。结果说明NRF1、KLF4、HOXA5及CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。
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图 5 牛IRX3基因核心启动子区转录因子结合位点预测 Fig. 5 Prediction of transcription factor binding sites in the core promoter region of bovine IRX3 gene |
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Y坐标左侧为核心区－372/+100 bp目标转录因子示意图，其中不同形状的图形代表不同转录因子结合位点，黑色填充为野生型，空白填充为突变型 On the left side of Y-axis denotes the schematic diagram of target transcription factors in the core region －372/+100 bp. Black fill for wild type, blank fill for mutant type, respectively 图 6 定点突变关键转录因子酶活测定 Fig. 6 Determination of luciferase activities for site-directed mutant key transcription factors |
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X坐标下方为siNRF1、siKLF4、siHOXA5、siCREB1和siRNA-NC与核心区双荧光素酶报告载体共转染，“+”为共转染因素 Those under X-axis denotes the co-transfection luciferase reporter plasmids with siNRF1, siKLF4, siHOXA5, siCREB1 and siRNA-NC, respectively. "+" is the co-transfection factor 图 7 siRNA干扰关键转录因子酶活测定 Fig. 7 Determination of luciferase activities for key transcription factors interfering with siRNA |
Iroquois同源盒基因家族在脊索动物胚胎的形成过程中扮演重要角色[14-15]。IRX3基因作为Iroquois同源盒基因家族的成员之一，在调节脊索动物生长发育、脂肪沉积等方面具有重要作用[16-19]。本研究发现，牛IRX3基因在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达，因此推测该基因与个体胚胎早期器官发育有着密切联系。IRX3基因在牛背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高，与IRX3基因在其它物种如羊[20]、鸡[21]中不同组织表达谱相似，这一结果说明，IRX3基因在牛个体发育过程中与脂肪沉积有密切联系。
本研究获得牛IRX3基因启动子序列，利用在线软件分析发现其1.8 kb启动子内有8个CpG岛。研究表明，DNA甲基化通常发生在启动子及第一外显子CpG岛基因组序列上[22]。人的基因组大约有29 000个CpG岛(占基因组60%)[23]，DNA甲基化是组蛋白等调控的重要表观遗传修饰机制，主要参与基因和蛋白的表达和关闭。启动子区DNA甲基化可以降低并阻止转录因子(TF)与基因的启动子结合，从而在转录水平调控过程中抑制基因的正常表达[24-25]，牛IRX3基因启动子区具有连续的高频率GC序列，且有8个CpG岛，这一结果说明，IRX3基因可能在个体胚胎或者组织器官发育过程中参与重要的表观遗传修饰调控。
利用启动子逐段缺失双荧光素酶活方法检测IRX3基因核心区，发现其核心区位于－372/－42 bp，在线软件预测其核心区域存在NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子的结合位点。定点突变及siRNA干扰NRF1、KLF4、HOXA5及CREB1转录因子后，发现IRX3基因转录活性分别较对照组有显著升高或降低。核呼吸因子家族包括NRF1和NRF2，是细胞核转录调节因子。NRF1广泛表达于多种组织，其不仅介导适应性抗氧化反应，还参与调控组织发育、蛋白酶体稳态、线粒体呼吸、细胞凋亡、炎症反应、脂质代谢和细胞分化等多种生理过程[26]。成熟脂肪细胞中特异性敲除NRF1基因则导致严重的脂代谢紊乱[27-28]。进一步研究发现，NRF1基因可以调控脂肪生成基因的表达，进而影响脂肪细胞形成及分化的方向[29]。本试验突变或干扰NRF1后，IRX3基因转录活性显著上升，说明NRF1对牛IRX3基因转录活性具有重要的调控作用，且可能参与甲基化修饰作用。
KLF4基因在细胞增殖及胚胎发育过程中发挥重要作用，过表达KLF4基因可导致细胞周期停滞于G1/S和G2/S期，从而抑制细胞增殖[30]。另外，KLF4参与脂肪分化的早期程序，其在脂肪细胞分化的前24 h瞬时表达，并激活C/EBPb表达，进而促进脂肪细胞的分化[31]。另外，KLF4可以与锌指蛋白Krox20互作，Krox20也对脂肪分化有正向调控作用[32]。同源框基因(homeobox genes)是一类重要发育转录因子，在脂肪组织形成和脂肪细胞分化过程中发挥重要的调控作用[33-34]。其成员HOXA5基因对脂肪组织发育、白脂棕色化与产热及肥胖引起的慢性炎症均存在重要调控作用[34]。HOXA5基因已被鉴定出在不同脂肪组织中差异表达，且在内脏脂肪组织和棕色脂肪中的表达水平高于皮下脂肪。敲低HOXA5基因，3T3-L1细胞中脂质积累减少，并激活BMP4/Smad1通路，促进白色脂肪组织的棕色化[35]。本试验中，突变或干扰KLF4或HOXA5后，IRX3基因转录活性显著下降，说明KLF4和HOXA5对牛IRX3基因转录活性具有重要的正向调控作用。
CREB是调控cAMP/PKA信号通路的重要反应性元件结合蛋白，是一种真核生物细胞核内重要的调控因子，在调节基因转录、细胞发育及生存等方面具有重要调控作用[36-37]。cAMP/PKA信号通路在脂肪细胞分化早期程序中起关键性作用，通过CREB磷酸化激活其通路[36-37]。CREB磷酸化可以诱导C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ等重要转录因子的激活从而调控脂肪早期分化过程[37]。在脂肪细胞分化后期，CREB可调节磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、脂肪酸结合蛋白(FABP(aP2/422))、脂肪酸合成酶(FAS)和环氧合酶(COX)-2的表达。因此，CREB在脂肪形成过程中扮演重要角色，可以作为“脂肪细胞特异性”标记物[38]。在本研究中，CREB突变和敲除分别降低了IRX3基因的转录活性，说明CREB在调控牛IRX3基因在脂肪细胞中的表达中发挥重要作用。
4 结论本研究发现，牛IRX3基因在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达，且其核心区域在－372/－42 bp。结合在线软件预测、借助定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。以上结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积的分子调控过程中的作用奠定了理论基础。
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