2. 重庆三峡职业学院动物科技学院, 万州 404155
, XIONG Zibiao1, LI Longjiao2, TIAN Xu1, JIE Xiaodie1, CHENG Yating1, WAN Kun1, LIU Anfang1, XIANG Bangquan2, HE Hang2
2. School of Animal Science and Technology, Chongqing Three Gorges Vocational College, Wanzhou 404155, China
体重是衡量肉用畜禽动物生产性能的重要指标，也是判断动物是否达到屠宰的标准，始终是育种最主要的目标。动物体重的增长受到遗传、环境和饲料等因素的影响，其中提高饲料转化率是目前的主要策略之一，而肝是影响饲料营养物质转化并被机体吸收利用的重要因素[1]。肝是调节动物食欲和体重的重要器官之一，对动物生长发育和物质代谢过程起着关键作用[2]。胆固醇合成和脂肪酸氧化主要在肝中进行，并且肠道吸收的营养物质可经肝转化从而促进机体生长发育[3]。因此，对肝代谢过程的研究有助于对机体生长发育机制的理解。
目前，随着RNA-Seq技术的迅速发展及成熟，更多关于动物的研究利用此方法解析其肝脏转录组以筛选出影响其生长性能的潜在候选基因。前人利用RNA测序技术比较了具有极端脂肪沉积[4]、肌内脂肪酸组成[5]和背膘厚度[6]表型的猪肝脏转录组。Ye等[7]通过分析乳鸽肝脏转录组鉴定出了与肌内脂肪沉积和脂肪酸组成相关的候选基因。Wang等[8]对具有不同肌内脂肪含量的两个品种牛的肝脏转录组进行了分析。Gunewardena等[9]研究了小鼠胚胎晚期(出生前2 d)到成熟期(出生后60 d) 12个阶段的肝脏转录组发育动力学。Miranda等[10]对低出生重和正常出生重的老鼠肝脏转录组进行了比较分析。虽然前人通过肝脏转录组鉴定出了大量与动物生长性状相关的候选基因及通路，但迄今为止，对禽类肝脏转录组的研究还比较缺乏，尤其是鹅。
鹅在农业经济中发挥着重要作用，中国是主要饲养国，占到全球的94%[11]，2018年出栏量达5.47亿只，年产鹅肉153.8万吨。鹅具有独特的经济性状，比如鹅肝的脂肪堆积能力很强，但又不会发生肝纤维化或坏死。在生产中，鹅经短期(约2~3周)过量喂食后可引起脂肪肝，并且其肝大小可增加5~10倍[12]。因此，鹅肝独特的脂肪储存与代谢特征是研究动物或人脂质代谢的重要模型。在本研究中，使用RNA测序技术获得同一群体中体重差异显著的四川白鹅肝脏转录组，鉴定出差异表达的基因及其通路，这可能有助于了解鹅体重变化的机制。此外，鉴定出的候选基因可能对鹅的分子育种有重要作用。
1 材料与方法 1.1 试验动物选取200只1日龄健康、体重一致(85.81±1.73)g的四川白鹅(♀)分别饲养于单笼中(温度：(27.41±2.79)℃，湿度：(87.69±7.17)%)。采用常规免疫程序，自由采食饮水。试验日粮参照美国NRC(1994)[13]标准鹅的营养需求进行配制，每日饲喂4次(7：30、12：30、17：00、21：00)。
1.2 鹅体重和血清脂类指标测定每天早上第一次喂料前记录每只鹅的耗料量；70日龄时对所有鹅空腹称重(禁食8 h)，计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和平均日增重(average daily gain，ADG)。根据平均日增重将鹅分为高(H)、中(M)和低(L)体重组。采集颈静脉血液5 mL，3 500 r·min-1离心10 min后取上清液，通过标准酶法使用CL-8000临床化学分析仪(Shimadzu, Japan)测定其血清脂类指标。屠宰后，立即分离出肝组织并放入液氮中，带回实验室，保存于-80 ℃待用。
1.3 鹅肝脏mRNA文库构建及测序使用RNAiso Plus Total RNA extraction reagent(Takara, Japan)抽提肝组织总RNA，质检合格后对总RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3′端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序文库构建(浓度：(37.5±3.03) ng·μL-1；大小：411~442 bp)。文库质检合格后在Illumina测序仪配套的cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交，将携有Cluster的flow cell在Illumina HiSeq 2000平台上选用paired-end程序，进行双端测序。
1.4 测序数据处理应用Seqtk(https://github.com/lh3/seqtk)对不合格的reads进行过滤得到clean reads，主要步骤：1)去除reads中所含有的接头序列；2)去除3′端Q值低于20的碱基；3)去除长度小于25 bp的reads；4)去除所属物种的ribosome RNA reads。RNA测序数据已提交至NCBI Gene Expression Omnibus(登录号：GSE132921)。
1.5 基因组比对与基因定量应用Hisat2(version: 2.0.4)[14]的spliced mapping算法将clean reads与鹅参考基因组(Anser cygnoides, AnsCyg_PRJNA183603_v1.0, NCBI)[12]进行比对，并使用Stringtie(version:1.3.0)[15]对基因fragments计数，TMM(trimmed mean of M values)[16]法归一化，perl脚本计算基因FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值，即reads标准化后的基因表达量。
1.6 差异表达基因分析应用edgeR[17]分析差异表达基因，多重假设检验校正P值，通过控制FDR(false discovery rate)来决定P值的阈值[18]，校正后的P值即q值。差异表达基因筛选条件为：1)q≤0.05；2)Fold change≥2。利用DAVID(http://www.david.niaid.nih.gov)[19]对差异表达基因进行功能富集分析。由于鹅基因组注释不完整，故使用BioMart将鹅基因ID转换为人基因ID。参考前人报道的配对平均关联聚类法[20]对差异表达基因进行基因模块构建，设置显著配对的相关性r≥0.8，并仅对基因数量超过10个的基因模块进行后续分析。
1.7 q-PCR定量使用PrimeScript RT Master Mix kit (TaKaRa)合成cDNA，以猪GAPDH基因作为内参，利用SYBR Premix Ex Taq kit (TaKaRa, Japan)在CFX96 Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad, USA)上进行mRNA定量(引物序列略)，相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。
1.8 数据分析数据使用SPSS 22.0软件包(IBM，USA)的单因素方差分析并结合LSD多重比较检验进行差异显著性检验；相关性分析采用Pearson算法。
2 结果 2.1 鹅体重和血清脂类指标分析如表 1所示，不同体重组鹅之间平均日增重差异显著(P < 0.05)，而平均日采食量则差异不显著(P>0.05)。本试验群体是一个地方保守品种，未经广泛选择，也未与其他品种杂交，个体之间具有非常相似的遗传背景，说明不同体重组鹅在饲料转化率上存在显著差异，而肝是饲料营养物质在机体内吸收利用的重要器官[1]，故暗示了肝代谢上的差异。此外，对血清指标的检测指出，总胆固醇、甘油三酯和高、低密度脂蛋白在不同体重组鹅之间呈现显著差异(P < 0.05)，进一步印证了上述推测。
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表 1 不同体重组鹅表型性状比较 Table 1 Comparison of phenotypic traits of geese with different body weight |
由表 2可知，每个样本测序后得到大约6 G的数据量，每项碱基质量大于20(Q20)的比例均大于90%，说明数据质量高，可用于后续分析。经过碱基识别及误差过滤得到35.95~47.94 M原始序列，进一步过滤掉不合格序列并优化得到31.69~ 43.52 M序列，其中能定位于鹅基因组的序列为27.60~38.74 M，所占比例为83.51%~89.03%。区域分布统计分析可知，91.24%~94.52%的序列分布于基因区域，71.42%~77.99%的序列分布于编码区域，其中65.27%~72.53%的序列分布于外显子区域。
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表 2 测序数据统计 Table 2 Sequencing data statistics |
不同组之间表达的基因数量基本一致(H组为13 390~13 690个；M组为13 445~13 776个；L组为13 321~ 14 184个)。剔除平均FPKM值为零的基因后，H、M和L组分别有14 632、14 651和14 819个表达基因，其中有13 776个共表达基因。关联分析显示，组间平均基因表达量相关性非常高(H vs M=0.98；H vs L=0.91；M vs L=0.97)，表明肝脏转录组在组间的高保守性。基因表达量分布显示，约73%基因FPKM值小于10，约3%基因FPKM值大于100(图 1A)，说明大部分基因是看家基因，为维持肝细胞基本功能所必需。各组Top 100的基因表达量占到所有基因表达量的65.38%~70.37%(图 1B)，暗示了它们在肝代谢过程中可能发挥着重要的调控作用，其中有85个相同的基因(图 1C)，这些基因的功能主要富集于核转录的mRNA分解代谢、翻译启动、线粒体电子传递、蛋白质聚合、NADH脱氢酶活性、氧化磷酸化等过程(图 1D)。另外，有17个特异性表达的基因(表 3)，比如脂质代谢相关基因ACSL1和NDRG1，氧化应激相关基因CAT和SORD，细胞增殖相关基因PSPH和RPL13及免疫相关基因HSP90B1和CD74。
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A.基因表达量分布；B. Top 100基因表达量；C. Top 100基因Venn图；D. Top 100共表达基因功能富集分析 A. Gene expression distribution; B. Top 100 genes expression; C. Top 100 genes Venn map; D. Top 100 co-express genes functional enrichment analysis 图 1 基因表达分析 Fig. 1 Gene expression analysis |
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表 3 Top 100基因中特异性表达的基因 Table 3 The specifically expressed genes in top 100 genes |
为了准确反映组间基因表达的差异，需剔除掉13 776个共表达基因中FPKM值为零的基因，得到11 920个基因用于差异分析，分别鉴定出了199(H vs M)、175(H vs L)和187(M vs L)个差异表达基因(图 2A)。层级聚类分析显示，差异基因可以根据不同体重组分为3类(图 2B)，且生物学重复相互关联(平均r = 0.97)，提示试验结果准确、可靠，并进一步反映了不同个体基因表达谱具有较低的变异。功能富集分析发现，差异基因主要富集在细胞凋亡、蛋白重折叠、胰岛素分泌、营养反应、细胞增长、氨基酸转运、cAMP信号通路等过程(图 2C)。关联分析显示，q-PCR定量结果与高通量测序结果相关性较高(r ≈ 0.8，P＜0.05，图 2D)，表明测序数据可靠。
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A.差异表达基因的鉴定；B.样本间相关性分析；C.差异表达基因的功能富集分析；D. q-PCR验证 A. Identification of differentially expressed genes; B. Correlation analysis among samples; C. Functional enrichment analysis of differentially expressed genes; D. q-PCR validation 图 2 差异表达基因分析 Fig. 2 Differentially expressed gene analysis |
由于分析单个基因表达量提取的生物学信息有限，故为了从全基因组表达数据中提取出更多的生物学信息，在此构建了差异表达基因模块，并与表型性状进行了关联分析。如图 3A所示，由435个差异表达基因构建出5个基因模块，并且单个基因模块内部的基因之间具有较强相关性，而不同模块之间显示较低的相关性。关联分析显示，所有基因模块均与表型性状显著相关(图 3B)，比如平均日增重(模块1：r=-0.80, P=9.76×10-3；模块2：r=-0.75, P=0.02；模块4：r=0.97, P=1.23×10-5)，甘油三酯(模块2：r=-0.90, P=8.25×10-4；模块4：r=0.84, P=4.25×10-3；模块5：r=0.79, P=0.01)，进一步证实筛选出的差异表达基因是影响生长性状的潜在候选基因。
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A.差异表达基因的层级聚类分析；B.差异表达基因模块与表型性状的相关性分析 A. Hierarchical cluster analysis of differentially expressed genes; B. Correlations analysis between modules from differentially expressed genes and phenotypic traits 图 3 差异表达基因模块分析 Fig. 3 Modules analysis of differentially expressed gene |
肝对营养物质的吸收转化至关重要，尤其是禽类脂肪酸原料的90%由肝合成，其代谢能力对生产性能造成了极大的影响[38]。因此，分析具有不同表型的动物肝脏转录组可以有效地阐明其功能复杂性及分子作用机制。目前，RNA-Seq技术被广泛应用于动物基因组数据的挖掘，是分析转录组表征和基因表达谱的有力工具，与传统的基因芯片或基于PCR的定量方法相比，RNA-Seq提供更高的动态范围、特异性和敏感性[39]。本研究共得到59.5 G的数据量，约是鹅基因组大小的50倍，其中超过80%的序列可比对上鹅参考基因组，远高于前人对鹅转录组的研究：61%[40]、60.74%~64.49%[41]和69.5%[42]，表明从测序深度、覆盖率和质量足以全面探索肝脏转录组如何影响生长性状。此外，65.27%~ 72.53%的序列位于外显子区域，由于前人报道的鹅转录组未作此统计，故无法进行评比分析，但与其它动物转录组分析基本一致，比如猪[5]和牛[8]，说明该测序数据可充分体现表型的差异。
不同体重组鹅肝组织有13 776个共表达基因，且表达量之间的相关性系数达到了0.9以上，表明鹅肝脏转录组存在高度保守性，这可能是由于肝是合成脂质的重要场所，而其合成原料均来自于日粮，肝对相同配方日粮的反应是一致的。Ramayo-Caldas等[5]报道的猪肝脏转录组之间的相似性达到了0.99。Esteve-Codina等[43]研究指出，猪性腺转录组基因表达量相关性系数为0.72。Marioni等[39]研究也显示，人肝脏转录组基因表达量相关性系数为0.73，说明转录组基因表达模式与物种和组织紧密相关。此外，高表达基因与脂质代谢、翻译启动、信号转导、蛋白质聚合、氧化磷酸化等过程密切相关，进一步印证了上述说法，同时与Yu等[44]的报道基本一致。
基因表达分析显示，Top 100的基因中有17个特异性表达基因，如调节脂质代谢的ACSL1基因，其过表达可显著升高脂肪细胞甘油三酯含量，而沉默其表达后，脂肪细胞中的甘油三酯明显降低[45]。Han等[46]研究指出，鹅肝组织中ACSL1基因表达量与总脂质和甘油三酯含量呈显著正相关，本研究结果与之符合，H组ACSL1基因表达量和甘油三酯含量最高。NDRG1基因广泛参与细胞增殖和分化、应激和炎性反应、胞内蛋白质和脂质的合成[47]。Cai等[48]研究指出，NDRG1基因通过调控前体脂肪细胞来激活其受体的表达，从而参与到前体脂肪细胞的成熟和分化，最终影响前体脂肪细胞甘油三酯的合成和脂滴的形成。本研究中，NDRG1基因表达量在M组最高，与甘油三酯含量不一致，这可能是NDRG1基因表达受到其他因子的调控，比如miRNA或甲基化等，具体机制还有待进一步研究。但是，结合ACSL1和NDRG1基因的功能与鹅体重的差异，它们可能就是调控鹅体重的候选基因。
差异表达基因富集于cAMP信号通路和胰岛素分泌等过程。cAMP作为细胞内的信号分子，通过作用并调节多种细胞内的功能蛋白质，将细胞外的信息传递到细胞内引起相应的生物学效应。Costa等[49]研究指出，通过介导cAMP信号通路可加强糖原的合成与分解，并可增加牛卵母细胞脂肪、蛋白和总氨基酸含量，从而对牛胚胎孵化率产生积极影响。此外，胰岛素信号转导通路能控制动物肝脂类的合成与积累，若胰岛素抵抗则会导致甘油三酯沉积异常。从上述信号通路调控的具体代谢过程来看，推测正是这些信号通路对动物机体脂肪分解和合成调控的差异导致了鹅体重不一致的结果，说明后续可能通过介导这些通路来达到控制表型的目的。
为了进一步验证筛选出的差异表达基因是影响体重的候选基因，435个差异表达基因聚类成5个基因模块，并与平均日增重及脂质代谢相关生化指标显著相关(|r|≥0.75, P＜0.05)，进一步说明鹅体重的差异是由筛选出的差异表达基因所调控的，可对鹅的生产相关研究提供候选基因资源，为鹅的遗传育种等研究提供新思路。然而，对于筛选出的差异表达基因的具体调控方式及基因间的协同作用机制还未知，这将是后续研究所要解决的问题。
4 结论本研究利用RNA-Seq技术对70日龄不同体重的四川白鹅肝脏转录组进行测序分析，初步探讨了肝调节营养物质吸收转化影响鹅体重的分子机制。鉴定出了与表型差异相关的潜在候选基因和代谢通路，并且用模块分析的方法揭示了基因簇与表型之间的关系，以此更深入地了解肝代谢是如何影响鹅的体重及有助于设计新的选择策略来改善鹅的生产。
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