2. 西南民族大学 生命科学与技术学院, 成都 610041
2. College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
Krüppel样因子(Krüppel-like factors，KLFs)是一类在真核生物体内广泛分布的重要锌指蛋白[1-2]，这一类因子的基因结构高度保守，与SP-1样转录因子高度同源，被统称为SP/KLF家族[3]。目前共发现KLFs家族成员有18个，广泛存在于多个物种中[4]，其功能复杂多样，成员间存在直接或间接竞争，在不同研究、不同领域中都发挥重要调控功能[5]。已有研究证明，KLFs家族有多个成员可能在脂肪细胞分化中发挥重要作用[6-8]，基于此，畜牧工作者也对该家族成员进行了重点关注。
KLF11是KLFs的成员之一，Cook等[9]于1998年首先从人的胰腺细胞CFPAC1中克隆获得，KLF11基因锌指结构域与KLF10(又名为TIEG1，transforming growth factor-β induced early gene 1或TGF-β induced early gene 1)同源相似度高，所以又命名为TIEG2，KLF11在许多组织中都有表达，是一种在胰腺高表达的转录因子。Neve等[10]在对KLF11功能和遗传分析时，发现KLF11是葡萄糖诱导胰岛素基因的调节剂，但是KLF11仍可能参与脂肪形成和代谢调节[11]。Zhang等[12]对db/db、DIO及正常小鼠注射KLF11特异性shRNA(Ad-shKLF11)的腺病毒后，对小鼠脂肪肝表型的组织学分析和肝脏的血清甘油三酯(TG)水平的生化分析，发现KLF11是调节小鼠肝脏脂质代谢的重要因子。Yamamoto等[13]也发现，KLF11在人棕色脂肪组织中表达量明显高于白色肪组织，随后，Loft等[14]研究指出，KLF11是罗格列酮诱导人白色脂肪棕色化所必需的因子。上述研究暗示，KLF11在脂质代谢及白色脂肪细胞棕色化中具有重要的调控作用，但尚未见KLF11在动物脂肪细胞分化中直接作用的相关报道。
因此，本研究利用RT-PCR、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)等技术克隆得到简州大耳羊KLF11基因序列，并明确该基因的组织表达谱及在肌内前体脂肪细胞成脂诱导分化不同阶段细胞中的时序表达谱，进一步利用RNA干扰技术干扰KLF11基因，利用形态学方法观测干扰KLF11后对脂肪细胞脂滴积聚的影响，同时利用qPCR等方法检测脂肪分化相关基因的表达变化，明确KLF11对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及探讨其可能发挥作用的途径，为进一步揭示KLF11在山羊脂肪沉积中的分子机理提供重要的数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验样本及试剂 1.1.1 试验动物获得及组织样品采集本研究中的试验动物采自四川省简阳大哥大牧业有限公司，选择12月龄左右简州大耳羊(n=4)。清晨空腹屠宰后，当即剪取各个组织样品(背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、腹间脂肪、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、瘤胃、胰腺)，用DEPC水清洗后将各个组织样品用锡纸包好并分装在冻存管内并标好编号于液氮中保存。
1.1.2 主要试剂Trizol试剂、SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)和pMD-19T Vector载体购自TaKaRa(大连)公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自Thermog公司；DH5α感受态细胞、2× GC-rich PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒购自Axygen公司；双抗、PBS、Opti-MEM、胰蛋白酶和DEME/F12培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gemini公司；Lipo-fectamine® RNAIMAX Reagent转染试剂购自Invitrogen公司；Ⅱ型胶原酶和油酸购自Sigma公司；细胞培养皿等耗材购自依科赛生物制品有限公司；氯仿、异丙醇、DEPC等其他试剂均为国产生化试剂。
1.2 试验方法 1.2.1 山羊KLF11基因的克隆测序根据GenBank登录的山羊、绵羊、牛的KLF11基因预测序列，利用Primer Pemier5.0软件对其序列比对保守区域，设计得到PCR特异性扩增引物，所设计引物由擎科(成都)生物公司合成。
按照Trizol法提取12月龄简州大耳羊肝组织总RNA，测定OD值及浓度，符合试验要求。参照反转录试剂盒说明书，按2 μg反转录获得cDNA，并利用设计好的扩增引物克隆KLF11基因序列。PCR反应体系:Tap PCR Master Mix(2×)12.5 μL、上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并通过AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒回收目的条带，构建PMD-19T-KLF11连接载体，并在DH5α感受态细胞内转化，37 ℃培养13~16 h，挑取阳性克隆，并进行菌落PCR鉴定，最后送成都擎科(成都)公司进行序列测定。依照林亚秋等[15]的方法对所获得的序列进行生物信息学分析。
1.2.2 山羊KLF11基因组织表达差异分析依照“1.2.1”中的方法，对12月龄简州大耳羊(n=4)的各组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、腹间脂肪、瘤胃和胰腺)的总RNA进行提取并反转录获得cDNA。根据获得山羊KLF11序列(GenBank登录号：MF509878.1)，利用Primer Premier5.0软件设计特异性qPCR引物，以本实验室前期筛选的TBP基因[16]作为内参基因(表 1)，采用qPCR检测KLF11基因在各组织中的表达差异。引物序列见表 1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
取本实验保存的山羊肌内前体脂肪细胞[17]进行复苏培养，待传至F3代，生长至80%时开始转染，提前4 h弃掉完全培养液，并在每孔细胞中加入450 μL无双抗的10%胎牛血清培养液(12孔板)。转染时先取3 μL转染试剂及2 μL siRNA加到50 μL的Opti-MEM中(试验组加入KLF11-siRNA，对照组加入Negative control)，并设置空白对照组(只加入完全培养基)，轻微震荡混匀，然后室温孵化5 min[18]。将孵化好的预混液分别滴加至细胞中，轻轻震荡混匀，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养6 h，然后更换为终浓度为50 μmol·L-1油酸诱导液进行诱导分化，诱导分化2 d后收集细胞。试验设置3个生物学重复，两个平行对照。山羊KLF11-siRNA序列由InvitrogenTM公司合成，序列信息见表 2。
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表 2 山羊KLF11基因的siRNA序列 Table 2 Sequence of siRNA for goat KLF11 |
利用油红O染色法[19]观察干扰KLF11后山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的脂滴积聚变化情况。利用24孔板培养肌内前体脂肪细胞，干扰KLF11基因2 d后弃去完全培养基，用PBS缓慢清洗培养细胞2~3次，利用10%甲醛固定细胞30 min，弃去甲醛后PBS清洗2~3次，然后将适量配制好的油红O工作液加入至24孔细胞中，染色20 min后弃去油红O工作液，并使用PBS多次清洗后在显微镜下观察并拍照。
1.2.5 qPCR检测干扰效率及相关基因的表达利用qPCR技术检测干扰效率及脂肪分化相关基因和KLFs的表达水平。所使用引物为实验室设计并检测合格[20]。qPCR反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。每个待测样品设置3个技术重复。
1.2.6 数据统计与分析数据结果用“平均值±标准差”表示，用2-ΔΔCt法对qPCR数据均一化处理，组织表达以TBP为内参基因，细胞试验以UXT[21]为内参基因。显著性检验利用SPSS22.0软件中One-way ANOVA分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 山羊KLF11基因克隆、序列分析及生物信息学分析本试验以简州大耳羊肝组织cDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增获得与预期目的片段相符的特异条带。经测序获得核苷酸序列总长为1 752 bp(GenBank登录号：MF509878.1)，其中包含CDS区1 518 bp，5′UTR序列112 bp，3′UTR序列122 bp，编码505个氨基酸残基(图 1)。利用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0在线软件分析发现，KLF11蛋白潜在的磷酸化位点共58个，其中酪氨酸(Tyr)、丝氨酸(Ser)及苏氨酸(Thr)磷酸化位点的个数分别为1、35和22个，有16个O-糖基化位点，不存在N-糖基化位点(图 1)。通过NCBI数据库ORF工具将本研究获得的cDNA序列与GenBank上预测的山羊序列(XM_018055669.1)比较有2个潜在SNPs位点，即737位的G-C及1 510位的G-A，导致氨基酸由甘氨酸更替为丙氨酸及丙氨酸更替为苏氨酸(图 2C)；利用ExPASY-ProtParam Tool分析发现，山羊KLF11蛋白MW为53 926.81 u，其pI为8.71。
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图中下划线为克隆引物，方框表示简单结构域，阴影表示C端结构域(C2H2)，加粗为磷酸化位点，斜体加粗为糖基化位点；ATG为起始密码子，*表示终止密码子。(GenBank登录号：MF509878.1) In the figure, primers for cloning are underlined, box indicates the simple domain, shade indicates the C-terminal domain (C2H2), coarsening are phosphorylation sites, italic thickening are glycosylation sites, ATG is the start codon, * indicates the terminal code TGA. (GenBank No.:MF509878.1) 图 1 山羊KLF11基因生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of KLF11 gene of goats |
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A.山羊KLF11氨基酸序列生物学功能预测; B. KLF11氨基酸序列二级结构预测；C. KLF11部分核苷酸序列(XM-018055669.1)与本研究推导氨基酸的比较，潜在的多态位点(G737C、G1510A)显示在方框中，推导出的氨基酸相应变换 A. Prediction of biological function of goat KLF11 amino acid sequence; B. The predicted secondary structure of the KLF11 amino acid sequence; C. Comparison of the nucleotide (XM_018055669.1) and deduced amino acid (the present study) sequences of complete KLF11 ORF in goats, the two potential polymorphic sites(G737C, G1510A) are showed in the shadow boxes 图 2 山羊KLF11蛋白结构特征分析及其潜在多态性 Fig. 2 Structural characteristics and potential polymorphism of KLF11 protein in goats |
利用NCBI保守域结构检索工具对KLF11蛋白进行BLAST分析，如图 2A所示，KLF11蛋白含有典型的锌指(C2H2)结构域。KLF11锌指结构域由3个锌指残基构成，分别在385~409、415~439和445~467 aa，利用NPS在线软件预测KLF11蛋白二级结构显示，其蛋白结构组成的α-螺旋、延伸链及无规则卷曲可能占氨基酸总数的19.41%(98个氨基酸)、14.46%(73个氨基酸)和66.14%(334个氨基酸，图 2B)。
利用NCBI在线比对程序BLAST，将获得的山羊KLF11氨基酸序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和大鼠等动物的氨基酸序列进行比对，发现与绵羊的同源性最高，为98.61%，其次是牛，为93.66%，人、小鼠、猪及大鼠则较低，分别为74.06%、65.71%、68.45%和51.34% (图 3A)，并利用MEGA7.0软件将各物种的氨基酸序列构建了系统进化树(图 3B)。
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A.不同物种KLF11基因氨基酸序列同源比对；B.KLF11基因氨基酸物种同源进化树；所引用的序列均来自GenBank数据库 A. Homology comparison of KLF11 amino acid sequence; B. Homology evolutionary tree of KLF11 amino acid sequence of different species. The referenced sequences are all from the GenBank database 图 3 山羊KLF11基因氨基酸序列比对及物种同源进化树 Fig. 3 Amino acid sequence alignment of goat KLF11 gene and species homologous evolutionary tree among different species |
本研究检测了山羊的14个组织中KLF11基因的mRNA表达情况，结果发现(图 4A)，KLF11基因在山羊组织中广泛表达，并在山羊肝脏、背最长肌和腹部脂肪中表达水平较高，与其他组织相比，达到极显著和显著水平(P < 0.01或P < 0.05)，而在脾脏中表达水平最低。
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A.山羊KLF11组织表达谱；B.山羊KLF11时序表达谱。不同大写字母为差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母为差异显著(P < 0.05)；下同 A. Tissue expression profile of goat KLF11; B. Temporal expression profile of goat KLF11. The different uppercase letters indicate extremely significant difference (P < 0.01), and the different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05); The same as below 图 4 山羊KLF11基因组织及肌内脂肪细胞不同分化阶段的相对表达水平 Fig. 4 Relative expression level of goat KLF11 gene in different tissues and in different differentiation stages of intramuscular adipocytes |
qPCR检测结果发现，以0 d为对照，在前体脂肪细胞分化中KLF11的相对表达量呈显著上升的趋势(图 4B)，其中在诱导分化48 h时，KLF11的相对表达量达到峰值，极显著高于在前体脂肪细胞中的表达水平(P < 0.01)，在96 h开始呈下降趋势。
2.5 干扰KLF11对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响 2.5.1 干扰效果检测及形态学观察干扰KLF11对肌内前体脂肪细胞分化的影响qPCR检测结果显示，以UXT为内参，阴性对照组表达水平为参照，结果显示，KLF11-siRNA1下调KLF11表达量63.58%，KLF11-siRNA2下调28.52%，KLF11-siRNA1对目的基因表达水平干扰效果更佳，达到极显著水平(P < 0.01，图 5A)，后续试验均用KLF11-siRNA1。油红O染色结果显示，与对照组比较，干扰KLF11后明显促进了山羊肌内前体脂肪细胞中脂滴的积聚(图 5B、C)。
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A.KLF11-siRNA效率筛选；B、C.油红O染色形态学观察(200×)，B为对照组，C为干扰组 A. KLF11-siRNA efficiency screening; B, C. Morphological observation of Oil Red O staining (200×), B is the control group, C is the interference group 图 5 KLF11-siRNA效率筛选及油红O染色 Fig. 5 KLF11-siRNA efficiency screening and Oil Red O staining |
为深入探讨KLF11基因在山羊肌内前体脂肪细胞分化中的调控机制，本研究分别检测了脂肪分化相关基因[17]的相对表达情况。结果显示(图 6A)，PPARγ和C/EBPβ的相对表达水平极显著上调(P < 0.01)，分别上调2.21倍和2.04倍，Pref-1相对表达水平下调了61.48%(P < 0.01)，AP2的相对表达水平显著下调(P < 0.05)，而 C/EBPα、LPL及SREBP1的变化不显著(P>0.05)。
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A.干扰KLF11对脂肪细胞分化标志基因表达的影响；B.干扰KLF11基因对KLFs成员表达的的影响。不同的大写字母表示对照组与干扰组差异极显著(P < 0.01)，不同的小写字母表示对照组与干扰组差异显著(P < 0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05) A. The effects of interfering KLF11 on adipocyte differentiation marker genes; B. The effects of interfering KLF11 on KLFs expression. The different capital letters indicate the extremely significant difference between control group and interference group (P < 0.01), the different lowercase letters indicate significant differences between control group and interference group (P < 0.05), no letter indicate no significant difference (P>0.05) 图 6 干扰KLF11基因对脂肪细胞分化标志基因及KLFs表达的影响 Fig. 6 The effects of interfering KLF11 on the expression of adipocyte differentiation marker genes and KLFs |
为明确在山羊肌内前体脂肪细胞分化中KLF11基因的调控可能与哪些KLFs成员有关，本研究检测了KLFs成员的mRNA表达水平，检测结果发现，在山羊肌内前体脂肪细胞中干扰KLF11基因后，KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、KLF8、KLF10、KLF14、KLF16的mRNA相对表达水平分别下调了46.33%(P < 0.01)、62.68%(P < 0.01)、46.7%(P < 0.01)、65.03%(P < 0.01)、51.67%(P < 0.01)、70%(P < 0.01)、75.15%(P < 0.01)和64.35%(P < 0.01)，KLF6的相对表达水平显著降低(P < 0.05)；而KLF7和KLF15的相对表达水平则分别上调1.76(P < 0.05)和2.51倍(P < 0.01，图 6B)，其他KLFs成员的表达变化不显著(P>0.05)。
3 讨论KLF11基因作为KLFs的一员，最初被鉴定为是由转化生长因子b(TGF-b)介导的控制细胞生长和分化的诱导基因[9]，在哺乳动物中，KLF11也被确定为负责脂肪分化、脂肪形成和肥胖转录网络的关键组成部分[22]。且本实验室前期转录组测序发现，山羊KLF11是山羊肌内前体脂肪细胞分化前后的主要差异基因之一。因此，本研究首先克隆获得带有KLFs家族典型锌指结构的山羊KLF11基因序列，分析氨基酸序列发现其具有多个磷酸化位点和糖基化位点，Gupta和Brunak[23]的研究表明，蛋白质翻译后修饰有磷酸化和糖基化等方式，本研究推测，这些位点可能是调控山羊KLF11蛋白功能的关键位点。而且分析发现，山羊KLF11蛋白属于无跨膜结构的非分泌蛋白，含有3个锌指结构残基，分别定位在385~409、415~439和445~467 aa，这与KLFs蛋白具有3个高度同源的C-端锌指(C2H2)结构的报道一致[24]。而同源性分析发现，山羊KLF11氨基酸序列与绵羊的同源性最高，其次是牛，人、小鼠、猪及大鼠则较低，这符合物种进化规律。
明确基因的组织表达规律是研究其功能的基础，因此，本研究利用qPCR技术对该基因在山羊各个组织中的差异表达进行了定量分析，并构建其组织差异表达谱，结果发现，KLF11基因在山羊各个组织中均有表达，但在肝、背最长肌及腹部脂肪中均存在较高水平的表达，而在脾脏表达水平最低。Cook等[9]研究发现，KLF11基因在人的胰腺及肌肉中富集。Jiang等[25]研究发现，处于胚胎时期小鼠在肌肉中有相对高的表达，而在成熟后则在心和肾中相对高表达，这与本研究存在差异，推测该基因的组织表达具有物种特异性。为揭示KLF11基因在山羊肌内前体脂肪细胞分化中的调控作用，本研究对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中KLF11基因的表达水平进行了定量分析，发现在成脂分化中其mRNA相对表达呈先上升后下降的趋势，并在48 h达到峰值，且极显著高于未诱导前，推测KLF11可能参与脂肪细胞前期分化调控，而Loft等[14]发现，KLF11参与白色脂肪棕色化，推测该基因可能通过影响脂肪细胞的来源和去向对白色脂肪组织进行调控。
为阐明KLF11基因在山羊肌内前体脂肪细胞中的作用，本试验发现，在体外培养的肌内前体脂肪细胞中干扰KLF11后显著促进了脂滴的积聚，同时发现，脂肪细胞分化标志基因PPARγ和C/EBPβ的表达水平显著增加，Pref-1的表达水平显著降低。其中在脂肪分化早期C/EBPs诱导激活PPARγ来促进脂肪细胞分化[26]，C/EBPβ通过诱导PPARγ的表达来促进脂肪细胞的分化[27]，而PPARγ是脂肪形成的重要因子[28]，Pref-1是脂肪细胞分化早期具有分化抑制作用的蛋白分子，在调节营养代谢、脂代谢及脂肪保护中有重要作用[29]，有研究表明，Pref-1通过抑制p42/p44 MAPK通路进而抑制前体脂肪细胞分化[30]。结合本试验结果推测，干扰KLF11基因后可能通过促进PPARγ和C/EBPβ，同时抑制Pref-1来促进脂肪细胞分化，其具体机制还需要更深入的研究。
KLFs转录因子家族比较特殊，各个成员的表达水平可以影响其他成员的表达[31]，Guo等[32]在牛脂肪生成中过表达及敲除KLF15后检测KLF3，发现KLF3也有相应的表达升高及降低，佐证了这一说法。本研究在干扰KLF11后检测了KLFs的其他16个成员的表达变化，发现KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF10、KLF14、KLF16的mRNA表达量均受到抑制，而KLF7和KLF15的mRNA表达水平则上调。本实验室前期确定KLF6、KLF7、KLF8、KLF10及KLF15对脂肪细胞分化起促进作用(数据未发表)，而KLF2和KLF4(数据未发表)则对脂肪细胞分化起抑制作用，结合本研究的结果，可以推测KLF11可能通过协同KLF2、KLF4、KLF10，拮抗KLF7和KLF15来通过调控PPARγ、C/EBPβ和Pref-1的表达，进而发挥作用。根据目前的报道表明，KLFs对脂肪细胞分化的调控作用可能具有物种特异性[33]，拟构建KLFs对山羊脂肪细胞分化的调控网络，则需对所有成员的作用进行逐一确定，目前有几个成员的作用尚未明确，因此，KLF11的调控网络需要进一步研究完成。
4 结论本研究克隆得到具有3个典型锌指结构的山羊KLF11基因序列1 752 bp(GenBank登录号：MF509878.1)。KLF11基因在山羊各个组织中均有表达，并且在肝、背最长肌及腹部脂肪中存在较高水平表达，其在前体脂肪细胞分化过程中呈先上升后下降的趋势，且在48 h达到峰值。干扰KLF11基因可促进山羊肌内前体脂肪细胞分化，并且这种作用可能是通过协同KLF2、KLF4、KLF10，拮抗KLF7和KLF15，进而调控PPARγ、C/EBPβ和Pref-1的表达来完成的。
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