2. 山西农业大学实验教学中心, 太谷 030801;
3. 山西农业大学生命科学学院, 太谷 030801
2. Centre of Experiment Teaching, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;
3. College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
c-Myc在细胞增殖等方面发挥着关键作用[1-3]，通过调节与细胞周期控制相关的基因来刺激细胞周期发展和细胞增殖[4]。细胞周期蛋白依赖性激酶Cdks以及细胞周期蛋白cyclins是细胞周期的主要调节因子[5-7]。在整个细胞周期中，Cdks的活性受到严格控制以确保细胞成功分裂[8]，而cyclins则以循环的方式被合成和破坏[9-11]。E2F1和cdc25A在细胞周期的转换中同样发挥着关键作用[12-13]。Yap等[14]在大鼠成纤维细胞的基因表达谱分析研究中发现，过表达大鼠c-Myc上调了Cdk4、Cdk6、cyclin E1和cdc25A等细胞周期相关基因。Qi等[15]在低内源性c-Myc富集的S期人胚胎肺成纤维细胞中过表达人c-Myc时，cyclin D3、cyclin E、cyclin A、Cdk2和Cdk4的表达相应增加。另外，有报道表明，大鼠和小鼠c-Myc也可以分别促进cyclin D2[16]和E2F1[17]的表达。然而，有关绵羊c-Myc对细胞增殖的影响及对相关基因表达的调控作用尚未见报道。
c-Myc作为干细胞转录因子可促进其他重编程因子进入目标基因座，提高体细胞重编程效率[18]。已有研究使用自身或异源c-Myc等转录因子将人[19]和小鼠[20]、绵羊[21]、山羊[22]、牛[23]等物种的体细胞诱导为iPSCs。其中，绵羊的iPSCs目前是使用人或鼠异源干细胞转录因子获得的。然而，使用异源性转录因子获得iPSCs会不可避免地存在一些问题。Li等[24]使用人源c-Myc等转录因子诱导猪耳成纤维细胞为iPSCs时，内源性转录因子被成功激活以及高表达的同时，还检测到异源外源基因整合，严重影响了iPSCs的进一步研究和应用。因此，获得绵羊自身的c-Myc等转录因子用于诱导形成绵羊iPSCs具有重要的意义。在诱导形成iPSCs的后期阶段，保证外源性干细胞转录因子沉默对于能否获得高质量和高安全性iPSCs是非常重要的[25]。如果将EGFP与干细胞转录因子融合表达，可以很直观地监测基因的转染效率以及干细胞诱导过程中外源基因的沉默情况。
鉴于以上研究背景和意义，本试验构建了c-Myc和EGFP基因融合表达的载体，研究了其对绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblasts, SEF)增殖及相关基因表达的影响，为进一步深入研究c-Myc的作用机制以及用于诱导制备绵羊iPSCs并探讨外源基因沉默的机制奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料载体pEGFP-N1(Clontech公司产品)和SEF(由本实验室分离)为本实验室保存的资源。DL5000 DNA Marker(3428A)、QuickCutTM EcoR Ⅰ(1611)、QuickCutTM BamH Ⅰ(1605)、QuickCutTM Not Ⅰ(1623)、PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒(RR036A)、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus，RR820A)、RNAiso Plus(9109，TaKaRa公司)；Plasmid Mini Kit Ⅰ(D6943-01)、Gel Extraction Kit(D2500-01)、E.coli DH5α(G6016，山西赛奥公司)；DMEM/F12细胞培养基干粉(12400024)、转染试剂Lipofectamine® 3000(L3000015)、新生牛血清(NBCS)(16010159，Thermo公司)；双抗(P1400)、胰蛋白酶-EDTA消化液(T1320)等常规试剂(北京索莱宝公司)。
1.2 方法 1.2.1 绵羊c-Myc-(G4S)3序列合成及克隆载体的构建与鉴定在绵羊c-Myc基因(NM_001009426)CDS区(去终止密码子)的起始密码子前添加GAATTCGCCACC (斜体为EcoR Ⅰ酶切位点，加粗为kozak序列)；羧基端添加GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTG-GCGGATCGGCGGATCC(下划线为linker肽(G4S)3，加粗GC为避免移码突变所加，斜体为BamH Ⅰ酶切位点)，由上海生工生物工程公司合成，并构建到克隆载体pUC57上。然后提取质粒进行双酶切鉴定。
1.2.2 c-Myc-(G4S)3-EGFP融合基因表达载体的构建与鉴定对克隆载体pUC57-c-Myc- (G4S)3以及pEGFP-N1载体进行EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后胶回收以构建融合表达载体pc-Myc-EGFP。连接体系和反应条件：载体pEGFP-N1 50 ng，目的基因c-Myc-(G4S)345 ng，T4 DNA连接酶1 μL，10× T4 DNA连接酶缓冲液2 μL，RNase-free water补至20 μL；16 ℃过夜连接。将连接产物转化DH5α后提取质粒，EcoRⅠ-BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ-Not Ⅰ双酶切鉴定并测序。双酶切体系及反应条件：pc-Myc-EGFP 0.3 μg，10×Green Buffer 1 μL，EcoR Ⅰ 0.3 μL，BamH Ⅰ (Not Ⅰ) 0.3 μL，RNase-free water补至10 μL；37 ℃酶切15 min。
1.2.3 绵羊c-Myc蛋白以及c-Myc-(G4S)3-EGFP融合蛋白结构特征的生物信息学分析利用表 1中的生物信息学在线网站和软件，对绵羊c-Myc蛋白以及c-Myc-(G4S)3-EGFP融合蛋白的结构特征进行分析。
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表 1 蛋白结构特征的生物信息学分析网站和软件 Table 1 Websites and softwares for bioinformatics analysis of the protein′s structure and characteristics |
以(5~8)×104个·mL-1的细胞密度接种SEF到12孔板，用无抗生素含有10% NBCS的培养基培养24 h后进行转染。试验组转染pc-Myc-EGFP、空载体组转染pEGFP-N1、对照组不做任何处理。首先，分别稀释脂质体和质粒：2.25 μL Lipofectamine® 3000与50 μL Opti-MEM混匀；1.8 μg质粒、3.6 μL P3000与50 μL Opti-MEM混匀。将稀释好的脂质体与质粒混匀，室温孵育15 min。每孔细胞加入400 μL新鲜培养基，然后将孵育好的上述混合液均匀滴加到每孔中。在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养6 h后，补加含有20% NBCS的培养基500 μL，继续培养12~48 h后，通过对比同视野下暗场和明场细胞数量观察质粒的转染效率，并在明场下观察细胞的增殖情况。
1.2.5 qRT-PCR检测c-Myc以及细胞周期相关基因的表达水平转染48 h后用Trizol法提取SEF的RNA，PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒反转录形成cDNA。使用NCBI网站的Primer-BLAST程序设计引物(表 2)，由北京华大基因科技公司合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系10 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ (2×) 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 3.2 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火34 s，共40个循环；熔解曲线以每5 s增加0.5 ℃的速率从65 ℃升温至95 ℃。以4个细胞孔重复进行试验，以2-△△Ct法分析数据。利用SPSS 22和GraphPad Prism 7.0软件进行单因素方差分析和作图。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
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表 2 内参和目的基因引物序列 Table 2 Primer sequences of reference and target genes |
NCBI查找拟分析的基因序列，对其翻译起始位点上游2 000 bp的5′调控区，利用Genomatix-MatInspector (https://www.genomatix.de/)软件分析c-Myc和E2F转录因子的结合元件及位点。
2 结果 2.1 载体的双酶切鉴定与测序分析EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ双酶切pUC57-c-Myc-(G4S)3，得到约2 710与1 382 bp(c-Myc-(G4S)3)两条带(图 1A)。EcoRⅠ-BamHⅠ双酶切pc-Myc-EGFP，得到约4 700与1 382 bp(c-Myc-(G4S)3)两条带；EcoR Ⅰ-Not Ⅰ双酶切pc-Myc-EGFP，得到约4 000与2 115 bp(c-Myc-(G4S)3-EGFP)两条带(图 1B)。初步表明载体构建正确。
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M. DNA相对分子质量标准；1~2. EcoRⅠ-BamHⅠ双酶切；3~4. EcoRⅠ-NotⅠ双酶切 M. 5 000 bp DNA marker; 1-2. Digested by EcoRⅠ and BamHⅠ; 3-4. Digested by EcoRⅠ and Not Ⅰ 图 1 载体的双酶切鉴定结果 Fig. 1 Identification results of double enzymes digestion for the vectors |
pc-Myc-EGFP测序结果显示，绵羊c-Myc CDS序列正确，并在其氨基端增加了kozak序列；羧基端去除了终止密码子，增加了linker序列。表明融合表达载体构建成功。
2.2 c-Myc及其融合蛋白的生物信息学分析 2.2.1 绵羊c-Myc蛋白的理化性质利用ProtParam在线网站对绵羊c-Myc蛋白进行分析，计算出氨基酸为439个，分子式为C2093H3311N603O694S14，分子量为48 474.78 u，原子总数为6 715。带负电荷的残基数(Asp+Glu)为65，带正电荷的残基数(Arg+Lys)为54。消光系数(280 nm)为29 505，等电点为5.47，不稳定系数为88.22，脂肪系数为65.38，亲水性平均系数为－0.78。
2.2.2 绵羊c-Myc蛋白的亚细胞定位和结构分析应用在线网站PredictProtein预测绵羊c-Myc蛋白的亚细胞定位，结果显示，绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核(图 2A)。通过SOPMA在线网站对绵羊c-Myc蛋白进行二级结构预测，结果显示，α-螺旋有150个，占34.17%；β-折叠有49个，占11.16%；β-转角有25个，占5.69%；无规卷曲有215个，占48.97%(图 2B)。可推断α-螺旋和无规卷曲是绵羊c-Myc基因编码蛋白质主要的二级结构元件，β-折叠和β-转角分散在整个蛋白中。通过SMART在线网站预测发现，绵羊c-Myc蛋白在360~412氨基酸位置存在一个HLH结构域(图 2C)。应用在线网站SWISS-MODEL预测绵羊c-Myc结构域区的三级结构，结果显示，c-Myc结构域区构成HLH的结构(图 2D)，与二级结构以及结构域的预测结果相一致。
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A.亚细胞定位；B.二级结构；C.结构域；D.三级结构。图A中箭头所指为细胞核；图B中h为α-螺旋、e为β-折叠、t为β-转角、c为无规卷曲 A. Subcellular localization; B. Secondary structure; C. Domain; D. Tertiary structure. In figure A, the arrow refers to the cell nucleus; In figure B, h is α-helix, e is extended strand, t is β-turn and c is random coil 图 2 绵羊c-Myc蛋白的亚细胞定位和结构分析 Fig. 2 Subcellular localization and structural analysis of sheep c-Myc protein |
应用在线网站SynLinker搜索到合适的linker序列为(G4S)3，其中，Gly分子量小，结构简单，柔性好；Ser亲水性强，能增加融合蛋白的亲水性。(G4S)3的距离为20.294 Å，且灵活度为9.848 5，柔软易弯折，空间位阻小(图 3A)。三级结构分析发现，融合蛋白中c-Myc和EGFP都保持各自独立的结构且互不影响(图 3B)。利用SAVES在线网站评估模拟融合蛋白结构的质量，结果显示，残基在红色区域[A、B、L]的比例为87.4%，在黄色区域[a、b、l、p]的比例为10.2%，在浅黄区域[~a、~b、~l、~p]的比例为1.4%，在白色区域的比例为1%。其中红色区域中残基的原子之间空间位阻最小。残基在红色区域的比例接近90%，说明模拟的蛋白质三级结构正确，质量较好(图 3C)。
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图A中左侧为氨基酸组成雷达图，右侧为(G4S)3结构；图B中左边红色部分为c-Myc，中间黑色部分为(G4S)3，右边蓝色部分为EGFP；图C中，黑色小斑点表示残基，红色区域为最佳合理区、黄色区域为较合适区、浅黄色区域为勉强接受区、白色区域为不合理区[26] In figure A, the left is amino acid composition radar chart and the right is (G4S)3 structure; In figure B, the red part on the left is c-Myc, the black part in the middle is (G4S)3 and the blue part on the right is EGFP; In figure C, the small black spots are residues, the red regions are the most favoured regions, the yellow regions are the appropriate regions, the light yellow regions are the barely permitted regions and the white regions are disallowed regions 图 3 (G4S)3(A)和c-Myc-(G4S)3-EGFP(B)的三级结构及融合蛋白结构的拉式构象图(C) Fig. 3 Tertiary structure of (G4S)3 (A) and c-Myc-(G4S)3-EGFP (B) and ramachandran plot of the structure for the fusion protein (C) |
使用ProtScale在线网站分析融合蛋白的疏水性(图 4A)，结果显示，第474位氨基酸(缬氨酸)处疏水指数最大为2.333，第257位氨基酸(谷氨酸)处疏水指数最小为－3.5，从整体来看该融合蛋白有明显的亲水性区域，其中c-Myc序列(1~439位氨基酸残基)主要为亲水区，这与理化性质分析的绵羊c-Myc蛋白亲水性平均系数为－0.78的结果相吻合。linker肽(G4S)3序列(440~454位氨基酸残基)为亲水区以及柔性区：亲水性linker序列与水分子形成的氢键增加了linker肽的稳定性且降低了linker肽与两端蛋白的不良反应；柔性区的linker序列柔软易折叠使得两侧的目的蛋白可以折叠为正确的空间结构并发挥相应的功能。由KinasePhos分析结果得知，该融合蛋白的潜在磷酸化位点为19个丝氨酸激酶、5个苏氨酸激酶和7个酪氨酸激酶作用位点(图 4B)。其中c-Myc蛋白的潜在磷酸化位点为17个丝氨酸激酶、5个苏氨酸激酶和3个酪氨酸激酶作用位点，可见融合蛋白中丝氨酸激酶作用的磷酸化位点主要存在于绵羊c-Myc蛋白，而苏氨酸激酶作用的磷酸化位点则全部存在于绵羊c-Myc蛋白。
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图 4 融合蛋白疏水性(A)和磷酸化位点(B)分析 Fig. 4 Hydrophobic (A) and phosphorylation site (B) analysis of the fusion protein |
荧光观察发现，对照组无绿色荧光，空载体组全细胞呈现荧光，试验组则只在核内呈现荧光(图 5A)。因为c-Myc-(G4S)3-EGFP融合蛋白是由c-Myc核定位信号引导入核，所以细胞核呈现荧光的结果说明重组融合蛋白表达正确。qRT-PCR检测结果表明，与对照组相比，空载体组c-Myc mRNA的表达水平无显著变化，而试验组 c-Myc mRNA的表达水平是对照组的12 966.26倍，达极显著水平(P < 0.01，图 5B)。
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A.融合蛋白表达的荧光观察；B. c-Myc mRNA的表达水平。图B中**表示差异极显著(P < 0.01)，下同 A. Fluorescence observation of fusion protein expression; B. Expression level of c-Myc mRNA. In figure B, ** indicates extremely significant difference (P < 0.01), the same as below 图 5 转染24 h后SEF中融合蛋白表达的荧光观察及c-Myc mRNA的表达水平 Fig. 5 Fluorescence observation of fusion protein expression and expression level of c-Myc mRNA in SEF for 24 h after transfection |
转染c-Myc 24 h后各组之间SEF数量差异不显著；而48 h时，与对照组相比，空载体组的细胞数量没有差异，但与空载体组相比，试验组的细胞数量增加到1.71倍，达显著水平(P < 0.05，图 6A、B)。
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A. SEF增殖的观察；B. SEF数量的比较。图B中*表示差异显著(P < 0.05)，下同 A. Observation of SEF proliferation; B. Comparison of SEF number. In figure B, * indicates significant difference (P < 0.05), the same as below 图 6 过表达绵羊c-Myc对SEF增殖的影响 Fig. 6 Effect of overexpressing sheep c-Myc on SEF proliferation |
过表达绵羊c-Myc 48 h后，与空载体组相比，cyclin D2、Cdk4、Cdk6、cyclin E1、cyclin A2、cdc25A mRNA的表达水平分别升高至5.20、3.10、6.54、6.52、23.37、8.22倍，达极显著水平(P < 0.01)；E2F1 mRNA的表达水平升高至1.83倍，达显著水平(P < 0.05，图 7)。
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图 7 细胞周期相关基因mRNA的表达水平 Fig. 7 Expression level of the cell cycle-related genes mRNA |
利用Genomatix-MatInspector软件分析结果表明，cyclin D2、Cdk4、Cdk6、E2F1、cyclin E1和cdc25A的5′调控区分别存在3、2、1、3、9和1个c-Myc转录因子的结合元件E-box(核心序列包括CACGTG、CATGTG、CACGCG和CACGAG等)，cyclin A2的5′调控区没有c-Myc转录因子的结合元件。而上述基因的5′调控区均预测到E2F因子的结合元件E2FF，包括E2F、E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F6、E2F7等。其中，各基因与E2F1转录因子结合的元件分别有4、3、3、2、7、3和2个(核心序列主要为GGCGGG，图 8)。
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图 8 绵羊细胞周期相关基因5′调控区与c-Myc和E2F1因子的结合元件及位置 Fig. 8 Elements and their positions binded to c-Myc and E2F1 in the 5′ regulatory region of the cell cycle-related genes in sheep |
王子竹等[27]利用PSORT网站分析出绵羊c-Myc有94.1%的概率位于细胞核，本试验利用PredictProtein网站分析和荧光标记表达定位进一步证实了绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核(图 2A，图 5A)，这可能与在320~328氨基酸的位置含有核定位信号(PAAKRAKLD)有关[28]。有研究表明，(G4S)3在融合蛋白中能够最小化两种融合组分的潜在折叠干扰并保持各自的活性[29]。本试验构建的融合蛋白能够折叠形成正确的结构(图 3B，3C)，表明(G4S)3是适用于绵羊c-Myc和EGFP融合表达所需的linker肽。本试验使用EGFP作为报告基因，成功实现了直观判断绵羊c-Myc在SEF细胞核中正常表达和定位的目的(图 5A)，为进一步在诱导重编程产生绵羊iPSCs中实时监测外源性转录因子c-Myc的沉默状况提供了方便，这将对后期判定绵羊iPSCs的成功建立有重要意义[25]。
本试验在SEF中过表达绵羊c-Myc后促进了细胞的分裂和增殖(图 6)，这可能是由于绵羊c-Myc通过上调细胞周期相关基因cyclin D2、Cdk4、Cdk6、E2F1、cyclin E1、cyclin A2和cdc25A的表达(图 7)，促进了静息期细胞进入细胞周期而导致的[11]。绵羊c-Myc蛋白含有HLH结构域(图 2C，2D)，这对于其作为转录因子识别并结合DNA靶序列以及与不同蛋白质之间的互作有非常重要的作用[30-32]。绵羊cyclin D2、Cdk4、Cdk6、E2F1、cyclin E1和cdc25A 5′调控区存在绵羊c-Myc结合的E-box元件(图 8)，这些分析结果说明，绵羊c-Myc与其他动物类似，作为螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(helix-loop-helix-leucine zipper, HLH-LZ)家族的转录因子，通过与Max蛋白形成异二聚体复合物结合于相应靶基因调控区域中E-box特定DNA序列而调控靶基因的转录[33-35]。c-Myc除了可与经典的E-box核心序列CACGTG结合外[36-37]，也能与其他几种非经典E-box基序结合，如CATGTG、CATGCG、CACGCG、CACGAG和CAACGTG[38]。在人cyclin D2翻译起始位点上游含有两个高度保守的可与c-Myc结合的E-box元件CACGTG[16]。c-Myc诱导人Cdk4 mRNA水平的增加是通过结合于其转录起始位点上游4个高度保守的E-box元件CACGTG实现的[39]。Kim等[40]在HeLa细胞中鉴定出1 469个c-Myc的直接靶基因，包括Cdk4、Cdk6、cyclin A2和cdc25A等，并表明E-box经典序列CACGTG和非经典序列CACGCG是c-Myc在体内结合其靶基因启动子时的主要基序。尽管本试验中对绵羊细胞周期相关基因5′调控区预测分析的c-Myc结合元件位置或序列与小鼠或人的不尽相同，但其各种核心序列是类似的。Kim等[40]在人的HeLa细胞中检测到c-Myc可结合于cyclin A2的启动子，本试验同样分析出小鼠cyclin A2启动子区存在c-Myc的结合元件(结果未显示)，但并没有在绵羊cyclin A2启动子区分析出与c-Myc结合的元件，意味着绵羊c-Myc可能通过间接方式调控cyclin A2的表达。进一步分析发现，在绵羊cyclin D2、Cdk4、Cdk6、E2F1、cyclin E1、cyclin A2和cdc25A的5′调控区均存在E2F1的结合元件(图 8)，说明绵羊c-Myc在上调E2F1表达后，进而又可能通过E2F1上调cyclin A2以及其他相关基因的表达。因此，绵羊c-Myc能够上调上述细胞周期相关基因表达的机制，一方面可能是绵羊c-Myc通过与各靶基因5′调控区的相应E-box元件结合而直接调控了其转录；另一方面则可能是受绵羊c-Myc直接调控的靶基因E2F1又作为转录因子以同样的方式作用于其相应的靶基因而实现转录调控作用。
4 结论本试验构建了以EGFP为报告基因的绵羊c-Myc基因真核表达载体pc-Myc-EGFP，同时对c-Myc蛋白和c-Myc-(G4S)3-EGFP融合蛋白的结构特征进行了生物信息学分析。过表达c-Myc通过上调细胞周期相关基因cyclin D2、Cdk4、Cdk6、E2F1、cyclin E1、cyclin A2和cdc25A mRNA的表达而促进SEF的增殖。而绵羊c-Myc上调这些相关基因表达的机制一方面可能是通过直接作用于靶基因5′调控区的E-box元件而促进其转录，另一方面则可能是通过其他相关转录因子(如E2F1)的间接调控作用而实现。
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