畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (5): 952-964. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.05.007    PDF    
引用本文
张伟, 王世银, 高莉, 徐梦思, 王新华, 甘尚权. 绵羊Fsp27基因组织表达、多态性及其与不同绵羊品种尾脂沉积能力的关联性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(5): 952-964.  
ZHANG Wei, WANG Shiyin, GAO Li, XU Mengsi, WANG Xinhua, GAN Shangquan. Tissue Expression Profiles and Polymorphism of Fsp27 Gene in Sheep (Ovis aries) and Their Association with Deposition of Tail Fat[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(5): 952-964.  
绵羊Fsp27基因组织表达、多态性及其与不同绵羊品种尾脂沉积能力的关联性分析
张伟1,2, 王世银2, 高莉2, 徐梦思1, 王新华1, 甘尚权1     
1. 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所, 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室, 石河子 832000;
2. 新疆农业职业技术学院, 昌吉 831100
收稿日期：2019-10-24
基金项目：省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室开放课题(MYSKLKF201801);国家自然科学基金地区基金(31860298)
作者简介：张伟(1978-), 男, 甘肃武威人, 博士, 副教授, 主要从事畜禽功能基因研究, E-mail:zhangweigsau@163.com.
通信作者：王新华, 主要从事绵羊分子遗传相关研究, E-mail:wangxinhua5751@163.com; 甘尚权, 主要从事绵羊分子育种设计相关研究, E-mail:shangquangan@163.com.
摘要：旨在研究绵羊Fsp27基因的组织表达/多态性及其与不同绵羊品种尾脂沉积能力的关联性。本研究采用qRT-PCR检测了营养充足期阿勒泰羊不同组织中Fsp27基因的表达情况，同时对营养充足期和营养匮乏期阿勒泰羊尾脂组织中Fsp27基因的表达情况进行了定量分析，采用PCR-SSCP结合测序技术检测了5个不同尾脂沉积能力绵羊品种Fsp27基因的突变情况，并分析了相关突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性。结果表明，Fsp27基因在营养充足期阿勒泰羊尾脂中高表达，其表达量极显著高于其他组织（P < 0.01），在肾周脂肪和皮下脂肪组织中的表达量也较高，极显著高于心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌组织（P < 0.01）。在心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌组织中呈微量表达，且各组织间差异不显著（P>0.05）。另外，营养充足期阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量极显著高于营养匮乏期（P < 0.01）。绵羊Fsp27基因在不同尾脂沉积能力品种群体中共检测到25个突变位点，其中位于第3外显子g.16771741的G/A突变以及第5外显子g.16774969的C/T突变均为错义突变，且与绵羊尾脂沉积能力高度相关。g.16771741的G/A突变在尾脂沉积能力较强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中以G等位基因为主，分别占到86.8%、83.7%和85.7%，而尾脂沉积能力较差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中G等位基因分别仅占30.3%和11.1%。g.16774969的C/T突变在阿勒泰羊群体中以T等位基因为主，TT基因型占84.7%，CT基因型占15.3%，没有检测到CC基因型；在短脂尾型的小尾寒羊和湖羊群体中，TT和CT基因型也分别占到65.9%、50.4%和22.7%、41.1%，而在长瘦尾的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以CC基因型为主，分别占到97.4%和69.4%，没有检测到TT基因型。以上研究结果表明，Fsp27基因在阿勒泰羊尾脂中高表达，且其在尾脂中的表达量与阿勒泰羊的营养状态密切相关，Fsp27基因第3外显子g.16771741的G/A突变以及第5外显子g.16774969的C/T突变与绵羊尾脂沉积能力高度相关，可以作为理想的分子标记用于低脂肪绵羊品种的选育。
关键词：绵羊    Fsp27    尾脂    SNP    
Tissue Expression Profiles and Polymorphism of Fsp27 Gene in Sheep (Ovis aries) and Their Association with Deposition of Tail Fat
ZHANG Wei1,2, WANG Shiyin2, GAO Li2, XU Mengsi1, WANG Xinhua1, GAN Shangquan1     
1. State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production, Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, China;
2. Xinjiang Agricultural Professional Technological College, Changji 831100, China
Corresponding author: WANG Xinhu, E-mail:wangxinhua5751@163.com; GAN Shangquan, E-mail:shangquangan@163.com.
Abstract: The aim of this study was to investigate tissue expression profiles and polymorphism of Fsp27 gene in sheep (Ovis aries) and their association with tail fat deposition of different sheep breeds. The qRT-PCR was applied to detect the expression level of Fsp27 gene in different tissues of Altay sheep in adequate nutrition stage, and its expression levels in tail fat of Altay sheep in adequate and deficient nutrition stages, then the PCR-SSCP combined with sequencing were used to detect polymorphism of Fsp27 gene in 5 sheep breeds with different tail fat deposition ability and their association with tail fat deposition in sheep were analyzed. The results showed that Fsp27 gene was expressed at a high level in tail fat of Altay sheep in adequate nutrition stage and extremely higher than those in the other tissues (P < 0.01), and expressed at a relatively high level in perirenal fat and subcutaneous fat which was extremely higher than those in heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, intestine, skin and skeletal muscle tissues (P < 0.01), but expressed at a very low level in heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, intestine, skin and skeletal muscle tissues, and there were no significant difference among them (P>0.05). In addition, the expression level of Fsp27 gene in tail fat tissue of Altay sheep in adequate nutrition stage was significantly higher than that in deficient nutrition stage (P < 0.01). Twenty-five SNPs were detected in Fsp27 gene sequence of sheep with different tail fat deposition ability, G/A mutation at g. 16771741 site in exon3 and C/T at g. 16774969 site in exon5 were missense mutations, and they were significantly associated with tail fat deposition ability of sheep. G was dominant allele in Altay sheep, Small Tail Han sheep and Hu sheep at g. 16771741 site, the allele frequency was 86.8%, 83.7% individuals and 85.7%, respectively, but only 30.3% and 11.1% individuals of Chinese Merino and Suffolk sheep were G allele at this site. T was dominant allele in Altay sheep at g. 16774969 site, 84.7% were TT genotype, 15.3% individuals were CT genotype, and no CC genotype was detected, and the genotype frequency of TT and CT in Small Tail Han sheep and Hu sheep were 65.9%, 50.4% and 22.7%, 41.1%, respectively, but CC was dominant genotype in Chinese Merino and Suffolk sheep, their frequency were 97.4% and 69.4%, and no TT genotype was detected. These results indicated that Fsp27 gene expressed at a high level in tail fat tissue of Altay sheep, and its expression level was closely related with nutrition state of Altay sheep. The G/A mutation at g. 16771741 site in exon3 and C/T mutation at g. 16774969 site in exon5 of Fsp27 gene were highly correlated with tail fat deposition ability of sheep, so could be used to help selecting low fat sheep breed.
Key words: sheep    Fsp27    tail fat    SNP    

生活在地球高纬度地区的绵羊，为了适应冬季严酷的自然环境而逐渐演化出一些尾部脂肪沉积能力很强的群体[1-2]，其中尤以生活在我国西北部阿勒泰地区的阿勒泰羊最为出名。阿勒泰羊俗称“大尾羊”，可以利用夏秋牧草丰茂的季节迅速在尾部储积大量的脂肪，到冬季牧草匮乏的时候即可通过分解尾部脂肪组织为机体提供能量[3]。本课题组前期在构建阿勒泰羊饥饿模型过程中发现，在供给充足饮水的条件下，阿勒泰羊禁饲1个月仍可健康存活，但其脂尾体积由于脂肪消耗而明显减小[4]。近年来，高脂肪肉食品的摄入对人们健康所造成的威胁已日益引起公众的关注，阿勒泰羊等脂尾型绵羊品种所产羊肉由于脂肪含量高而越来越无法适应市场需求的变化[5]。适当降低其脂肪沉积水平、提高瘦肉率、改善肉质已成为脂尾型绵羊品种后期选育的重要方向，所以需要对其尾脂沉积的调控机制做出深入阐释。

动物的脂肪组织主要分布在皮下、内脏周围和肌肉等组织中，可分为白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)和褐色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)，但BAT多见于幼龄动物中，成年动物体内主要是WAT[6]。WAT的脂肪细胞中有一个巨大的脂滴(lipid droplets, LD)，是由磷脂单分子层包裹中性脂肪核心而构成的球形细胞器，磷脂单分子层中嵌合着很多蛋白质[7-8]。已有的研究结果表明，大脂滴是通过小脂滴的聚集和融合而形成的[9-11]，CIDE(cell death-inducing DEF45-like effector)家族成员——脂肪特异性27 kDa蛋白(fat specific protein 27, Fsp27)在该过程中发挥着重要作用[12-13]。Fsp27基因最早在鼠脂肪细胞系TA1中筛选特殊基因表达时被发现[14]，定位在脂滴表面和内质网[15-16]，在脂肪组织中高表达。小鼠敲除Fsp27基因后WAT脂肪水解速率显著升高，脂肪细胞中的大脂滴转变成为很多分散均匀的小脂滴[17]。3T3-L1细胞中Fsp27基因的表达量若下调，细胞中甘油三酯含量下降，甘油含量显著升高，同时出现大量小脂滴，但是未见明显大脂滴[18]。进一步的研究结果表明，Fsp27蛋白可在脂滴-脂滴接触点上(LD contact site, LDCS)介导小脂滴中的中性脂肪经LDCS向大脂滴转移，进而形成一个更大的脂滴，若Fsp27基因被敲除，则上述过程无法完成[19]。另外，Fsp27可以特异性抑制激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)在脂滴表面的定位，进而抑制脂肪的水解[20]。

基于以上分析，Fsp27基因在调控动物脂肪沉积过程中的重要性已毋庸置疑，该基因也成为瘦肉型肉用家畜培育过程中需要重点关注的功能基因。因此，深入研究Fsp27基因在绵羊尾脂沉积中作用机制，将为脂尾型绵羊品种改良工作提供可靠的理论基础，但目前相关的研究鲜有报道。本试验拟在研究Fsp27基因在阿勒泰羊不同组织中表达情况的基础上，对Fsp27基因上下游约1 000 bp序列和5个外显子区域在不同尾脂沉积能力绵羊品种中的突变情况及其多态性进行深入分析，以期为进一步阐明Fsp27基因在绵羊尾脂沉积中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 样品采集

分别于2018年10月份(营养充足期)和2019年2月份(营养匮乏期)采集3头年龄在1.5~2.0岁，健康状况良好的阿勒泰羊母羊的心、肝、脾、肺、肾、胃、空肠、背侧皮肤、背最长肌、肾周脂肪、背侧皮下脂肪和尾脂组织，液氮速冻后置于－80 ℃冰箱中保存备用。分别采集200份湖羊(短脂尾型，新疆生产建设兵团农六师鑫宝种羊场)，210份萨福克羊(长瘦尾型，新疆奇台农场种羊场)、200份中国美利奴细毛羊(长瘦尾型, 新疆吉木萨尔县三台镇细毛羊养殖基地)、215份阿勒泰羊(脂尾型)耳组织样品，165份小尾寒羊基因组样品由新疆农垦科学院甘尚权研究员课题组馈赠，所有耳组织均保存于－20 ℃冰箱中备用。

1.2 核酸提取

阿勒泰羊不同组织(n=6)总RNA的提取参照Trizol(Ambion, USA)操作要求完成，采用琼脂糖凝胶电泳和ND2000超微量分光光度计(Thermo, USA)对提取的总RNA质量进行检测，合格的样品置于－80 ℃冰箱保存备用。不同绵羊品种耳组织样品基因组DNA采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(索莱宝，中国)提取，琼脂糖凝胶电泳检测合格后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物设计

检索Ensemble网站(http://asia.ensembl.org/index.html)，获得绵羊Fsp27基因序列(Transcript ID: ENSOART00000006399.1)，然后与UCSC中(http://genome.ucsc.edu/)收录的绵羊基因组序列(Oar_v4.0, Nov. 2015)比对，使用FirstEF(http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/)预测启动子序列，截取包含上游启动子及下游序列各1 500 bp序列设计引物，分别扩增包括上游和下游序列，以及5个外显子区域序列，要求扩增片段控制在300 bp左右，以利于后续进行SSCP(single-strand conformation polymorphism，SSCP)检测。另设计Fsp27基因表达引物，以绵羊β-actin(Transcript ID: ENSOART00000003275.1)作为内参基因设计引物，对不同营养状态下Fsp27基因在阿勒羊不同组织中的表达情况进行相对定量检测。引物使用Oligo 6.0软件设计，并由生工生物工程(上海)有限公司合成，以上引物详细信息见表 1。

表 1 绵羊Fsp27基因及内参基因β-actin实时荧光定量和PCR-SSCP引物 Table 1 Primers of Fsp27 and β-actin genes for qRT-PCR and PCR-SSCP
1.4 Fsp27基因表达量定量分析

参照PrimeScript反转录试剂(TaKaRa)说明将不同营养状态下阿勒泰羊不同组织总RNA反转录为cDNA。以绵羊β-actin作为内参基因，采用qRT-PCR对营养充足期阿勒泰羊不同组织和不同营养状态阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量进行定量分析。qRT-PCR反应采用20 μL体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(2×)(TaKaRa)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。扩增反应结束后以0.1 ℃·s-1的速度进行熔解曲线分析。

1.5 Fsp27基因突变情况检测与其绵羊尾脂沉积能力关联性

以阿勒泰羊、湖羊、中国美利奴细毛羊和萨福克羊基因组(每品种随机检测21份)为模板，以表 1中所列引物对Fsp27基因不同区域进行PCR扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后参照文献[21]所述方法对各PCR产物进行SSCP检测，选择不同带型的PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，以确定相应区域的基因突变情况。

根据测序结果，对上述存在SNP位点的区域扩大检测样本进行PCR-SSCP检测，以分析其与不同绵羊品种尾脂沉积能力的关联性，初步找到有关联的突变位点，为后续进一步研究其功能奠定基础。

1.6 数据分析

Fsp27基因表达定量分析通过2-△△Ct法计算，每个样品做3次重复，结果用“平均值±标准差”表示。以营养充足期阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量为参照，对其他组织和营养匮乏期阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量进行相对定量。使用SPSS13.0进行单因素方差分析，以比较各相对表达量的差异显著水平。采用SPSS软件计算不同群体中Fsp27基因SNP位点的基因型频率及等位基因频率，并使用卡方检验的方法分析各群体中基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡。

2 结果 2.1 Fsp27基因在阿勒泰羊不同组织中的表达分析

以营养充足期阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量为参照，采用qRT-PCR技术对其他组织中Fsp27基因的表达量进行相对定量(图 1)，结果表明，Fsp27基因在营养充足期阿勒泰羊尾脂中高表达，其表达量极显著高于其他组织(P < 0.01)，在肾周脂肪和皮下脂肪组织中的表达量也较高，极显著高于心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌组织(P < 0.01)。在心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌组织中呈微量表达，且各组织间差异不显著(P>0.05)。

相同大写字母表示差异不显著(P>0.05);不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，下同 The same capital letter represents no significant difference (P>0.05), the different capital letters represent extremely significant difference (P < 0.01), the same as below 图 1 Fsp27基因在营养充足期阿勒泰羊不同组织中的表达 Fig. 1 Expression of Fsp27 gene in different tissues of Altay sheep in adequate nutrition stage

以营养充足期阿勒泰羊尾脂中Fsp27基因的表达量为参照，采用qRT-PCR技术对不同营养状态阿勒泰羊尾脂组织中Fsp27基因的表达量进行相对定量(图 2)，结果表明，当阿勒泰羊处于牧草丰茂、营养充足的季节，其尾脂中Fsp27基因呈高丰度表达，有利于尾脂组织中脂肪的沉积和能量的储备。但是当冬季来临，牧草枯黄且被大雪覆盖，阿勒泰羊的饲草摄入无法保障，面临长期营养匮乏时，其尾脂中Fsp27基因的表达量显著下调，极显著低于营养充足期(P < 0.01)，进而促进尾脂组织中脂肪的分解，为机体基本的生命活动提供必须的能量。

图 2 Fsp27基因在营养充足期和营养匮乏期阿勒泰羊尾脂中的表达情况 Fig. 2 Expression of Fsp27 gene in tail fat of Altay sheep in adequate and deficient nutrition stages
2.2 Fsp27基因在不同尾脂沉积能力绵羊品种中的突变情况

用表 1中的10对引物扩增绵羊Fsp27基因不同区域，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测(图 3)，可见各引物均有很好的扩增效率和特异性，满足后续SSCP检测和测序的要求。

M.DNA相对分子质量标准；1~10. Fsp27基因不同区域PCR扩增产物 M.DNA marker; 1-10. PCR products of Fsp27 gene different regions 图 3 Fsp27基因不同区域PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis result of PCR products of Fsp27 gene different regions

采用上述10对引物检测了不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中Fsp27基因的突变情况(表 2)。共检测到25个突变位点，其中，上游区域7个，5′UTR区9个，外显子区域3个，内含子区域3个，3′UTR区3个。

表 2 Fsp27基因在不同绵羊品种中的突变情况 Table 2 SNPs of Fsp27 gene in different sheep breeds

从小样本(每个品种21头)检测结果来看，上游区域的g.16766712、g.16767126和g.16767305位点，5′UTR区的g.16767779-16767780和g.16768019位点，以及外显子区的g.16771741和g.16774969位点在不同绵羊品种群体中的分布存在差异，需要进一步开展大样本检测，以确认其与绵羊尾脂沉积能力的关联性。

2.3 Fsp27基因g.16771741位点G/A突变与绵羊尾脂沉积能力关联性分析

进一步分析Fsp27基因CDS区的3个突变位点(表 3)，位于第二外显子g.16769004的A/G突变属于同义突变，突变前的密码子UCA和突变后的密码子UCG均编码丝氨酸(Ser)，位于第3外显子g.16771741的G/A突变为错义突变，原密码子GAU编码天门冬氨酸(Asp)，突变后的密码子AAU编码天门冬酰胺(Asn)，位于第5外显子g.16774969的C/T突变也为错义突变，原密码子AUC编码异亮氨酸(Ile)，突变后的密码子ACC编码苏氨酸(Thr)。

表 3 绵羊Fsp27基因CDS区突变对氨基酸的影响 Table 3 The effect of mutation in CDS region of Fsp27 gene in different sheep breeds on amino acids

对第3外显子g.16771741的G/A突变在5个不同尾脂沉积能力绵羊品种群体共计854份基因组做进一步的检测(图 4和表 4)，发现该突变位点在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体均可检测到，但其分布存在明显的差异。在尾脂沉积能力较强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中，G等位基因分别占到86.8%、83.7%和85.7%，而尾脂沉积能力较差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中G等位基因分别仅占30.3%和11.1%。卡方检验结果表明，湖羊和中国美利奴细毛羊该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，而阿勒泰羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P < 0.05)、小尾寒羊和萨福克羊该位点处于Hardy-Weinberg极不平衡状态(P < 0.01)。

A.SSCP检测结果；B. Fsp27野生型(a)和突变型(b)蛋白三级结构预测结果；C.不同基因型片段测序结果 A.The result of SSCP; B. The protein tertiary structure prediction results of Fsp27 wild type (a) and mutant type (b); C. Sequence of different genotype 图 4 绵羊Fsp27基因g.16771741位点G/A突变检测及分析 Fig. 4 Detection and analysis of g. 16771741 locus G/A SNP of sheep Fsp27
表 4 g.16771741位点G/A突变等位基因和基因型频率在不同品种绵羊中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方检验 Table 4 Genotype and allele frequency distributions of g.16771741 locus G/A SNP in different sheep breeds and Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium

由于该突变为错义突变，使多肽链一级结构中氨基酸的种类发生了改变。采用蛋白质三级结构在线预测软件3DligandSite(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/tools.html)预测野生型和突变型蛋白的三级结构，发现该突变对Fsp27蛋白的三级结构具有明显的影响(图 4)。图中白色箭头和圆圈所示区域野生型中为无规卷曲(图 4B-a)，而突变型中为一个β折叠(图 4B-b)。

2.4 Fsp27基因g.16774969位点C/T突变与绵羊尾脂沉积能力关联性分析

进一步研究结果表明，Fsp27基因g.16774969位点C/T突变与绵羊的尾脂沉积能力高度相关，在已检测的脂尾型阿勒泰羊群体中，TT基因型占84.7%，CT基因型占15.3%，没有检测到CC基因型；在短脂尾型的小尾寒羊和湖羊群体中，TT和CT基因型也分别占到65.9%、50.4%和22.7%、41.1%。而在长瘦尾的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以CC基因型为主，分别占到97.4%和69.4%，没有检测到TT基因型(图 5和表 5)。

A.SSCP检测结果；B. Fsp27野生型(a)和突变型(b)蛋白三级结构预测结果；C.不同基因型片段测序结果 A.The result of SSCP; B. The protein tertiary structure prediction results of Fsp27 wild type (a) and mutant type (b); C. Sequence of different genotype 图 5 绵羊Fsp27基因g.16774969位点C/T突变检测及分析 Fig. 5 Detection and analysis of g. 16774969 locus C/T SNP of sheep Fsp27
表 5 g.16774969位点C/T突变等位基因和基因型频率在不同品种绵羊中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方检验 Table 5 Genotype and allele frequency distributions of g.16774969 locus C/T SNP in different sheep breeds and Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium

蛋白三级结构预测结果表明，该突变对Fsp27蛋白的三级结构具有影响(图 5)。图中白色箭头和椭圆所示区域野生型(图 5B-a)和突变型(图 5B-b)β折叠的长度以及末端的无规卷曲均有较明显的变化。由于该位点与绵羊尾脂沉积能力有强关联性，且对其蛋白质三级结构有明显的影响，推测该位点可能对Fsp27的功能有影响，需要后期进行功能试验验证。

3 讨论

Fsp27为CIDE(cell death-inducing DEF45-like effector)家族成员，目前已发现，CIDE家族包括CIDEA、CIDEB和Fsp27/CIDEC三种蛋白质，且均含有CIDE-N和CIDE-C两个结构域[22]。Fsp27定位在脂滴表面和内质网[15]，其C端的保守区可能在Fsp27定位在脂滴表面以及抑制激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)在脂滴表面的定位过程中发挥着重要作用[22]。Fsp27通过两条途径促进脂肪沉积：1)通过LDCS介导小脂滴中的中性脂肪向大脂滴转移，进而形成一个更大的脂滴[19]；2)Fsp27可以特异性抑制HSL在脂滴表面的定位，HSL是脂肪水解过程中的关键水解酶，若HSL无法结合到脂滴上，则不能参与脂肪水解，进而使脂肪的水解受到影响[20]。Fsp27在细胞中的表达量与脂肪酸含量密切相关，且Fsp27不稳定，其半衰期只有1 h左右，所以其蛋白水平可以快速响应细胞内脂肪酸含量变化[23]。当脂肪酸水平升高时，Fsp27表达量上调，脂肪水解被抑制；当脂肪酸不足时，Fsp27表达量下调，脂肪水解速率加快，从而使机体的脂肪酸水平和能量供应保持动态平衡[15]。

正是由于Fsp27在脂肪代谢调控中发挥的重要作用，其在猪、牛和大鼠等动物脂肪组织中均呈高表达[24-26]，这与本研究在阿勒泰羊中的检测结果相一致。但是Fsp27基因在其他组织中的表达可能会由于物种不同而存在一些差异。本研究结果表明，Fsp27基因在阿勒泰羊心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、皮肤和骨骼肌等组织中呈微量表达，但Wang等[25]的研究结果表明，在初生和成年牛的肺和肠组织中Fsp27基因的表达量亦较高，Li等[24]在猪的肝、脑、肺、小肠和淋巴组织中亦检测到了Fsp27基因的高水平表达。另外，Fsp27基因作为动物脂肪代谢的关键调控基因，其表达量应与动物的代谢状态相适应，所以在不同的营养状态下，其表达量会出现相应的调整。本研究结果表明，阿勒泰羊在营养充足的状态下尾脂中Fsp27基因的表达量极显著高于营养匮乏状态下(P < 0.01)，小鼠中的研究结果亦表明，正常状态下Fsp27基因在肝中的表达量较低，但在持续摄入高脂日粮时，其在肝中的表达量显著上升[27-28]，在人中的研究也表明，肥胖病人肝中Fsp27基因的表达量会出现上调[29-30]。

基因突变常对该基因的功能及其参与调控的性状产生不同程度的影响。高迁移率族蛋白(high mobility group protein, HMG)家族成员HMGA1为猪背膘厚的重要候选基因，巩建飞等[31]在其编码区检测到1个错义突变g.3261G/A，并证实该位点与猪的背膘厚显著关联(P < 0.01)。安清明等[32]对8个不同绵羊品种群体中脂联素基因(adiponetin, ADIPOQ)的突变情况进行了研究，共检测到13个突变位点，并发现A1和B1等位基因与绵羊的生长性状和胴体性状显著相关。在其他物种中有关Fsp27基因SNP及其与脂肪沉积关联性的研究已有相关文献报道。惠嫣婷等[33]对3个贵州地方猪种Fsp27基因第4~5外显子区域的SNP进行了筛查，共检测出4个SNPs位点，其中第5外显子的一处C/G突变为错义突变，使Fsp27蛋白的三级结构发生了明显变化。对一例脂肪代谢障碍和胰岛素耐受病人的基因诊断结果显示，其Fsp27基因第6外显子的一处G/T突变使该处形成了一个终止密码子UAA，进而使mRNA的翻译在此处终止，形成一个没有功能的Fsp27蛋白[34]。Wang等[35]在南阳牛Fsp27基因启动子区域检测到了10个突变位点，有9个位于22个转录因子潜在结合区域，其中单倍型H8-H8个体18月龄的体重和增重速度极显著高于单倍型为H1~H8的个体(P < 0.01)。本课题组前期亦在绵羊X染色体中检测到一些与绵羊尾脂沉积能力高度相关的SNPs位点[21, 36]。本研究对不同尾脂沉积能力绵羊品种Fsp27基因的检测结果表明，位于第3外显子g. 16771741的G/A突变以及第5外显子g. 16774969的C/T突变均为错义突变，对蛋白质的三级结构有明显影响，并在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的分布存在显著差异，可以作为良好的分子标记用于低脂肪绵羊品种的选育。当然，上述突变对Fsp27蛋白功能是否有影响有待后续试验做出进一步的验证。

另外，本研究在Fsp27基因上游包含启动子区域的1 400 bp范围内检测到了多达16个突变位点，尤其是其5′UTR区的600多个碱基中检测到了9个突变位点。Wang等[35]在南阳牛Fsp27基因启动子区域也检测到了大量突变。基因的5 ′UTR区是启动翻译的重要控制区域，核糖体需要识别并结合mRNA的5′UTR区，这是翻译启动的关键事件[37-38]，如果该区域的碱基突变影响到了上述过程，则可能对mRNA的翻译产生影响，进而影响该基因的蛋白水平及其功能[39-40]。当然，本研究发现的Fsp27基因启动子及5′UTR区的高突变性是否与该基因的表达调控相关还有待后续研究确认。

4 结论

本研究证实，Fsp27基因在营养充足期阿勒泰羊尾脂中高丰度表达，在营养充足期尾脂中的表达量极显著高于营养匮乏期，推测Fsp27基因在阿勒泰羊尾脂沉积过程中可能发挥着重要的调控作用。通过对Fsp27基因编码区2个SNPs位点与绵羊尾脂沉积能力的关联性分析发现，位于第3外显子g. 16771741的G/A突变以及第5外显子g. 16774969的C/T突变与绵羊的尾脂沉积能力高度相关，可以作为理想的分子标记用于低脂肪绵羊品种的选育。

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