规律成簇的间隔短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)广泛存在于古细菌和细菌中，是细菌为了保护自己免受噬菌体攻击进化而来的获得性免疫系统[1]；CRISPR基因编辑技术以其易于操作、高效和经济等优点迅速替代了原来的锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)和类转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术成为基因编辑技术的新生力量[2]，在疾病治疗[3-4]、品种改良[5]、疾病模型构建[6-7]等方面提供了更广阔的科研前景。其组成主要包括一系列Cas蛋白基因、前导序列以及由长度相似的间隔序列与不连续重复序列间隔排列的CRISPR簇[8]。Makarova等[9]基于其共同的特征和进化相似性将该系统分为两个不同的类别，包括6个基因型(Ⅰ型~Ⅵ型)和34种亚型[9-12]，目前, 应用较为成熟的效应蛋白Cas9属于第二大类中的Ⅱ型。
1 CRISPR/Cas9基因编辑技术概况 1.1 CRISPR/Cas9系统概述1987年，日本大阪大学微生物病研究所首次发现在大肠杆菌中负责碱性磷酸酶同工酶转化的iap基因下游存在串联间隔重复序列[13]。随后, 发现其广泛存在于古细菌和细菌中，直至2002年，正式将其命名为规律成簇的间隔短回文重复序列，即CRISPR[14]。2005年，Bolotin等[15]证实了CRISPR的间隔序列与宿主菌染色体外的遗传物质具有同源性，提出间隔序列来源于外源噬菌体或质粒；并假设通过编码反义RNA，CRISPR间隔序列不仅可以保护细菌抵抗噬菌体感染，还可以抵抗其他外来遗传物质的侵袭，抑制它们携带基因的表达。但在2007年Barrangou等[16]才阐明细菌可以利用CRISPR与相关的Cas基因抵抗噬菌体的入侵。在2008年首次试验验证了CRISPR系统的功能，证明表皮葡萄球菌的CRISPR系统可以阻止外源质粒的结合与转移[17]。
CRISPR/Cas9获得性免疫的原理主要包括间隔序列的获得、表达并加工CRISPR、干扰外源基因的入侵这三个阶段[18-20](图 1A)。当有外源病毒或噬菌体侵入时，CRISPR/Cas9系统会识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，将临近PAM的序列作为候选的前间隔序列，该候选间隔序列剪切后插入到CRISPR簇5′端两个重复序列之间，修复后获得新的间隔序列。含有新间隔序列的CRISPR基因座转录成为前体RNA(pre-RNA)，在Cas蛋白作用下被剪切成为成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)，同时，tracrRNA(trans-activating RNA)也会被转录并和crRNA通过碱基互补配对方式形成一条双链的RNA结构，再与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的tracrRNA/crRNA复合物。复合物将在crRNA的引导下，由核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切外源双链DNA，形成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)。利用此原理，改造后的CRISPR/Cas9系统可以用于编辑真核细胞中相应的目的基因，达到编辑基因的作用。
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A. CRISPR/Cas9技术的基本原理：CRISPR/Cas9系统抵御外源遗传物质入侵过程主要分为新间隔序列获得、CRISPR簇表达并加工以及靶向DNA序列DSB并修复3个步骤；B. CRISPR/Cas9基因编辑技术重要研究进展：图中概述了CRISPR/Cas9的主要发展历程，包括其首次发现、正式命名、功能验证以及重要应用等关键时间点；C. PubMed关于CRISPR相关文章计数：CRISPR技术问世后，自2012年后文章发表量呈快速增长，截至2019年10月，PubMed上已有超过4 000篇文章发表(更新至2019年10月7日) A. Basic principles of CRISPR/Cas9 technology:The process of resisting the invasion of exogenous genetic material in CRISPR/Cas9 system can be divided into three steps, obtaining new spacer sequences, CRISPR array expression and processing, and targeting DNA sequence DSB and repair; B. Important research progress of CRISPR/Cas9 gene editing technology:The figure outlines the main developments of CRISPR/Cas9, including the key points in its first discovery, formal naming, functional verification, and critical applications; C. Count of PubMed related articles on CRISPR:Since the advent of CRISPR technology, the number of articles published has increased rapidly since 2012. As of October 2019, more than 4 000 articles have been published on Pubmed (Updated to 7 Oct. 2019) 图 1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 Fig. 1 CRISPR/Cas9 gene editing technology |
根据CRISPR/Cas9系统编辑基因的原理，Jinek等[21]于2012年首次证明CRISPR/Cas9可以通过引导RNA(guide RNA, gRNA)作为单一转录本进行编程用于体外靶向DNA切割。在Cas9裂解外源DNA形成缺口后，靶基因位点通常经历DNA损伤修复的两个主要途径之一，即易出错的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和高保真同源介导修复(homology-directed repair, HDR)。在没有修复模板的情况下，通过NHEJ过程重新连接DSB，造成碱基的随机插入或缺失，导致基因组重要结构破坏或发生移码突变，使基因组元件失效或者发生基因敲除[22]。在存在外源引入的修复模板的情况下，可以利用HDR在靶位点生成精准明确的改造，即以同源重组的方式在DSB处对基因组进行定点缺失、插入或突变[23]。
此后，CRISPR系统的研究一直处于快速发展状态，如对斑马鱼[24]和果蝇[25]基因组的编辑，并逐渐被广泛应用(图 1C)。2013年初，麻省理工学院的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠细胞Th基因实现了定点突变[26]；同期Mali等[27]利用CRISPR/Cas9在人293T细胞、慢性粒细胞白血病K562细胞以及PGP1-iPS细胞的靶位点形成切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因的插入。最近中国科研人员首次利用CRISPR/Cas9对干细胞进行编辑，治疗艾滋病(AIDS)和白血病患者，研究表明编辑后的人造血干细胞在动物模型中长期稳定重建人的造血系统，其产生的外周血细胞具有抵御艾滋病病毒(HIV)感染的能力[28](图 1B)。
2 CRISPR/Cas9技术在重要猪病毒病防控中的应用由于国际生猪和猪产品贸易持续增长，养猪业已经成为全球畜牧业的第一大支柱产业，猪肉是人类最主要的动物蛋白来源之一。在追求大规模饲养扩大和密集化养殖的同时，新发和再发疫病也随之涌现，一些重要猪病如猪瘟(classical swine fever, CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)、非洲猪瘟(African swine fever, ASF)等成为全球养猪业发展的主要障碍之一。而CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用为猪病的研究与防控提供了新思路，主要体现在改造宿主和病毒两方面(表 1)。
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表 1 CRISPR/Cas9技术在重要猪病防控中的应用 Table 1 Application of CRISPR/Cas9 technology in prevention and control of important swine diseases |
随着世界人口的日益增长，将来动物性蛋白的产量无法满足世界人口的需求，根据世界粮农组织的估算，在2030年世界对动物蛋白的需求量将达到135.3 kg·人-1，其中猪肉的需求量将达到15.1 kg·人-1[29]。为了提高动物蛋白的产量，科学家们进行了诸多探索，其中就包括进行转基因动物的构建。转基因猪的研究最早见于1985年[30]，而伴随基因编辑技术的出现，利用该技术构建转基因猪也迎来一个热潮，尤其是用于疾病模型[31-33]、器官移植[34]等方面的研究。在抗疫病方面，由于病毒感染宿主细胞需要通过相应的受体，因此，通过编辑宿主的受体可以达到抵抗病毒感染的效果，另外一个思路是将抑制病毒增殖的干扰RNA插入到宿主基因组中。早前，科学家主要利用ZFNs和TALENs两种基因编辑工具对猪特定基因进行编辑[35-36]。相对于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9技术具有构建简单、转染方便和编辑高效的特点。因此，CRISPR/Cas9技术的出现加速了科研学者通过改造猪相应受体基因以达到抗病毒方面的研究。
2.1.1 在动物水平进行改造目前，研究团队利用CRISPR/Cas9技术成功构建抗特定疫病的基因编辑猪，主要原理是通过敲除宿主上某个病毒感染所必需的受体，或在宿主基因中插入可以直接靶定病毒基因的小RNA序列。例如CD163已被多个研究团队证实是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)进入宿主细胞的必需受体，通过CRISPR/Cas9技术诱导CD163基因缺失，结合显微注射技术获得敲除CD163的单等位基因缺失猪[37]以及双等位基因敲除猪[38]；或者对CD163部分基因定向缺失[39]或替换[40]，造成CD163蛋白部分缺失，由于缺少进入宿主细胞的CD163受体，PRRSV无法感染猪相关嗜性细胞，从而保护猪不受高致病性PRRSV感染。
干扰RNA已经被证实可以对多种病毒的增殖起到抑制作用。因此，通过基因编辑技术将抗病毒的干扰RNA插入到宿主细胞基因组中可以提高宿主的抗病毒能力。基于此思路，Xie等[41]筛选出两个针对猪瘟病毒(CSF virus, CSFV)的高效干扰RNA，再通过CRISPR/Cas9介导插入猪Rosa26(pRosa26)位点，通过体细胞核移植技术产生抗CSFV转基因猪，使其有效地限制CSFV在基因编辑猪体内的复制，并减轻CSFV造成相关的临床体征和降低死亡率。
2.1.2 在细胞水平进行改造解析病毒与宿主之间的关系是研究病毒致病力的重要途径。CRISPR/Cas9技术可以高效编辑细胞中的基因，为猪相关病毒与宿主基因之间关系的研究提供了有效的途径。目前，通过此技术在细胞方面进行研究的猪病毒主要包括猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)、塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)等，开展类似的探索。为构建新型疫苗、寻找抗病毒药物提供了新的思路。
例如，p53是诱导细胞凋亡中的一个关键蛋白，p53信号通路在PCV2感染过程中的具有调控作用。利用CRISPR/Cas9建立p53基因敲除PK-15细胞系，感染PCV2后可阻止S期细胞增多，抑制病毒自身复制[42]。这对于研究p53基因在影响PCV2的复制以及PK-15细胞生长周期中具有重要意义，不仅揭示了PCV2的感染机制，同时也可作为减毒疫苗开发的工具。视黄酸诱导基因Ⅰ (retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)是模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)的一种，能识别入侵细胞的病毒RNA，激活Ⅰ型干扰素，在宿主抗病毒先天免疫中发挥重要作用；构建缺失RIG-Ⅰ基因的PK15细胞使SVV的增殖能力显著增强，可用于SVV疫苗开发过程以提高病毒产量[43]。阐明了SVV感染后RIG-Ⅰ在Ⅰ型干扰素诱导的细胞先天性免疫应答中的作用，同时为SVV疫苗开发提供了更利于提高疫苗产量的新型细胞。有研究表明，不论是野生型还是减毒PRV，在猪核糖核酸酶L(swine ribonuclease L, sRNase L)敲除型PK-15细胞中比在正常PK-15细胞更有效地复制，可作为研究sRNase L的功能以及生产PRV减毒疫苗的工具[44]。通过比较sRNase L敲除前后不同毒力PRV感染后病毒的繁殖特性，有望阐明PRV感染后sRNase L的功能，并应用于新型疫苗的开发。
除此之外，CRISPR/Cas9技术可以被整合到宿主基因组中用于直接剪切DNA病毒。比如非洲猪瘟病毒(ASF virus, ASFV)。通过构建识别ASFV磷酸化蛋白p30基因(CP204L)的CRISPR质粒，然后, 将此CRISPR质粒整合到野猪肺(WSL)细胞基因组中，研究结果表明，由于靶向Cas9裂解病毒基因组，ASFV的空斑形成被完全消除，病毒产量降低了4个数量级，从而建立了抗ASFV细胞[45]。
2.2 应用CRISPR/Cas9技术改造病毒CRISPR/Cas9技术可以直接用来编辑DNA病毒基因。利用此原理可以敲除病毒的致病基因，筛选弱毒株疫苗。Liang等[46]结合CRISPR/Cas9系统和Cre/Lox系统高效地敲除了PRV的gE和TK基因。该方法整合不同系统的优势，能够高效、精确地筛选出纯净的基因缺失毒株，为疫苗的研发提供了新的途径。美国梅岛动物疫病中心也利用CRISPR/Cas9系统，敲除ASFV野毒株Georgia07的基因组中的非必需基因8-DR，高效地开发了8-DR基因缺失ASFV株[47]，该研究为构建稳定的ASFV弱毒疫苗奠定了基础。
CRISPR/Cas9可以通过敲除病毒繁殖的主要基因以达到抑制病毒增殖的作用。并且相对于之前的ZFNs和TALENs等基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术可以同时高效敲除多个基因。例如Tang等[48]针对PRV基因组不同的位置设计了75个sgRNA构建sgRNA库，经反向遗传技术后筛选到的8个靶向区域的关键sgRNAs，这些靶点的联合敲除不仅可以有效抑制PRV，且由于是多个位置的敲除，在一定程度上降低脱靶和病毒逃逸的可能性；这些发现可能有助于新一代PRV靶向治疗药物的设计。此外，为多基因敲除提供了模型，并且为降低脱靶效应提供了一个可行的思路。
CRISPR/Cas9可以用来快速操纵RNA病毒感染性克隆。相对于先前构建和连接一组连续cDNA片段操纵的策略，该方法在重组RNA病毒构建的质量和效率方面具有明显的优势。如Peng等[49]利用该系统将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制时非必需的ORF3基因缺失并替换为增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)，获得了与亲本毒株具有相似复制特性的PEDV重组病毒株，为PEDV基因组操作和疫苗开发提供有效平台，也为其他RNA病毒的操纵提供了方向。
3 结语与展望我国是养猪大国，养殖方式多样，疫病流行情况也相对复杂。比如2006年高致病性PRRS[50]的暴发，近年来PRV[51]、PEDV[52]的变异，PCV3[53]、SVV[54]、APPV[55]新型疫病病原的出现，以及2018年ASF[56]的传入。这些状况都给我国养猪产业带来了巨大的挑战。因此，利用最新的科研技术进行抗病毒的研究具有重要的意义。
CRISPR/Cas9技术自2013年诞生以来，被广泛应用于病原微生物及宿主细胞基因的改造。CRISPR/Cas9系统作为新型靶向基因编辑工具有着巨大潜力，对比复杂费时的ZFNs和TALENs技术，CRISPR/Cas9系统不仅提高了工作效率，而且加速了对疾病的研究，因此，该技术在人类疾病防控方面已成为有前景的新型防控手段，如针对重大人类疾病病毒(包括丙型肝炎病毒、登革热病毒[57]以及寨卡病毒[58]等)已开始使用CRISPR/Cas9系统对功能性基因进行筛选，以鉴定对病毒复制很重要的宿主因子，从而进一步理解病毒发病机制和抗病毒治疗方法；同时也可以与其他技术结合以开发更复杂的筛选方法以完善和扩展其应用[59]。鉴于此，在重要猪病的防控中，应用CRISPR/Cas9系统筛选关键基因也将成为未来的研究方向之一，通过筛选揭示病毒如何利用和破坏宿主功能方面的共性与差异，并为抗病毒治疗提供潜在靶点。而CRISPR/Cas9技术目前在应用中最大的障碍就是仍需解决脱靶效应以及造成多余突变等问题[60-61]，同时，多基因敲除也有待进一步发展，目前，也有越来越多的Cas蛋白系统[62-64]被发现，这些都将使其系统逐渐趋于完善，更加利于在临床实践中的应用。
总的来说，该系统的发展与应用加快了基因水平研究的步伐，为研究病毒致病机制、新型疫苗研发以及抗病毒药物研发等领域提供了强有力的工具，有着深远的影响，但是目前CRISPR/Cas9技术在猪病方面的研究还只是局限在宿主与病毒的相互作用方面，过度依赖于复杂而竞争的细胞过程，使基因编辑的效率和精准度有所受限，因此，未来该技术更好的应用将对猪病研究有重要意义。
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