动物采食棘豆属(Oxytropis sp.)和黄芪属(Astragalus sp.)中某些植物后可引起以神经机能紊乱为主要特征的慢性中毒性疾病，即疯草病(locodisease)或疯草中毒(locoism)，这些植物的主要毒性成分为吲哚哩西啶生物碱——苦马豆素(swainsonine，SW)[1-2]。
大量研究表明，苦马豆素能显著抑制动物组织细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶的活性，使部分合成的低聚糖在溶酶体内聚积[3]，造成脑、肝、脾、胰、肾等多个实质器官发生组织细胞空泡化，进而引起组织器官功能紊乱，甚至丧失，最终导致动物中毒或死亡[4]。同时苦马豆素也是一种较好的免疫调节剂，可以维持血液中各细胞系的动态平衡[5]。此外，苦马豆素具有明显抗癌抗肿瘤作用[6-8]，所以其医用前景十分广阔。
然而，苦马豆素人工合成困难[9]，从疯草类植物中提取苦马豆素效率很低[10]，因而真菌发酵培养是目前国内外苦马豆素来源的最主要方式，鉴于此，有学者对部分真菌的苦马豆素生物合成通路及可能的催化酶基因进行了研究[11-14]。2016年，Lu等[15]通过高通量测序技术对疯草棘豆蠕孢菌进行了全基因组测序，发现有5个催化酶共164个基因被注释可能参与苦马豆素合成的5步反应。随后，Alhawatema等[13]采用RNA干扰技术敲除PKS基因，结果显示突变菌发酵液中苦马豆素的含量显著降低，说明PKS基因在豆类丝核菌苦马豆素生物合成中具有重要调控作用。同时，Cook等[14]对豆类丝核菌、罗伯茨绿僵菌和疯草棘豆蠕孢菌等进行全基因测序、数据库比对，推测这些产苦马豆素内生真菌都有一个共同的基因簇—“Swn”，包括SwnA、SwnH1、SwnH2、SwnK、SwnN、SwnR和SwnT基因，这些基因参与编码苦马豆素生物合成过程中的关键催化酶。本试验旨在探讨金龟子绿僵菌发酵液中相关催化酶基因mRNA表达与苦马豆素产量之间的关系，为苦马豆素微生物发酵工艺优化及其生物合成通路的研究奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 菌株、培养基与主要试剂金龟子绿僵菌(BNCC114445，中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)，苦马豆素标准品(Sigma)。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar Medium, PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌20 min；察氏培养基(Czapek-Dox Medium)：K2HPO4 1.3 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.5 g，NaNO3 3 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30 g，酵母膏3 g，定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 金龟子绿僵菌发酵培养将获得的金龟子绿僵菌菌株采用“菌饼法”进行发酵。将菌株饼块接种于350 mL的察氏培养基进行发酵培养，每批发酵12瓶，发酵时间为7 d，发酵条件为28 ℃、摇床转速175 r·min-1，共发酵3批，取第1、3、5、7天发酵液，每次3瓶，采用循环水式多用真空泵进行减压抽滤获得发酵液。
1.3 金龟子绿僵菌发酵产物分析前准备将发酵液浓缩至糖浆样，随后与甲醇以体积比1:1混合并在4 ℃条件下沉淀24 h以除去其中的糖分，之后将上清液过滤并在水浴箱(40 ℃)上挥干其中的水分和甲醇，得到总浸膏。精确称取20 mg浸膏，加入1.6 mL甲醇和400 μL DMSO溶解浸膏，再用甲醇10倍稀释溶解好的样品，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，之后将上清液用甲醇稀释10倍，涡旋混匀后进样分析。
1.4 金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素的高分辨质谱仪检测使用分辨率为70 000和17 500(AIF)的Q Exactive高分辨质谱仪进行检测。将电喷雾电压设定为3.0 kV(Negative)，毛细管温度设定为300 ℃，以高纯氩气(纯度≥99.999%)为碰撞气，高纯氮气(纯度≥99.999%)作为鞘气和辅助气，使用Hypersil GOLDHILIC(购自Thermo)色谱柱，将柱温箱温度和自动进样器温度分别设定为35和10 ℃，进样前使用200.0 μL甲醇清洗进样针，浸泡时间为3.0 ms；进样体积为5.0 μL，0.1%甲酸水溶液(水相)和0.1%甲酸乙腈(有机相)以0.3 mL·min-1的速度冲样，第10.0分钟开始采集数据。以苦马豆素和相关中间产物浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标，以加权系数(1/X2)进行回归得到单点标准曲线，将测定结果代入建立的线性回归方程，计算样品中各种物质的浓度。
1.5 金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路催化酶基因的qRT-PCR检测采用Sigma公司的RNA试剂盒提取菌株总RNA，用TaKaRa公司的反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，保存于-80 ℃。利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)，引物由热默尔生物技术有限公司合成。以上述cDNA为模板，配制10 μL qRT-PCR反应体系：NovoStart®SYBR PCR SuperMix plus 5.0 μL，上、下游引物和模板cDNA各1.0 μL，ddH2O 2.0 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；40个循环；4 ℃保存。每个检测样本设3个重复。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 qRT-PCR primers sequence |
采用SPSS 20.0软件对所得数据进行单样本t检验分析，结果表示为x±sx。对每个样品进行单向方差分析，P>0.05，表示差异不显著，P < 0.05，表示差异显著，P < 0.01，表示差异极显著。所有试验均重复3次。
2 结果 2.1 金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量测定将金龟子绿僵菌发酵液浓缩后运用Q Exactive高分辨质谱仪检测，苦马豆素检测品和苦马豆素标准品的出峰时间均为4.4 min(图 1A~E)，根据计算的回归方程绘制标准曲线：y=31 302.5x-45 910.5(R2=0.996 7)(图 1F)，根据苦马豆素质量浓度-峰面积线性回归方程，计算得金龟子绿僵菌发酵液在第1、3、5、7天时苦马豆素的含量分别为(169.666±50.775)、(174.014±45.793)、(116.720±45.736)和(104.851±40.352)μg·mg-1(图 1A~D)，并绘制不同时间发酵液苦马豆素含量变化折线图(图 1G)，由图 1G可知，第3天发酵液中苦马豆素含量最高。
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A.第1天发酵液中苦马豆素的峰值时间和峰面积；B.第3天发酵液中苦马豆素的峰值时间和峰面积；C.第5天发酵液中苦马豆素的峰值时间和峰面积；D.第7天发酵液中苦马豆素的峰值时间和峰面积；E：苦马豆素标准品的峰值时间和峰面积；F.苦马豆素质量浓度-峰面积标准曲线；G.不同发酵时间苦马豆素含量变化折线图 A. Peak time and peak area of SW at day 1 of fermentation of M. anisopliae; B. Peak time and peak area of SW at day 3 of fermentation of M. anisopliae; C. Peak time and peak area of SW at day 5 of fermentation of M. anisopliae; D. Peak time and peak area of SW at day 7 of fermentation of M. anisopliae; E. Peak time and peak area of SW standard; F. Mass concentration of swainsonine-peak area standard curve; G. Line diagram of variation of SW content in different fermentation time 图 1 不同时间发酵液中苦马豆素的峰值时间和峰面积 Fig. 1 Peak time and peak area of swainsonine in fermentation broth at different time |
采用qRT-PCR检测金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路上的催化酶基因的mRNA表达水平，以确定它们在不同时间点的相对表达量。从图 2中可以看出，SwnN基因的mRNA表达水平在第3天开始下降，与第1天相比差异显著(P < 0.05)，之后持续低水平表达；SwnT和SwnK的mRNA表达水平在第3、5天时显著降低，与第1天相比，差异显著(P < 0.05或P < 0.01)，第7天时两者与第3、5天相比均显著回升(P < 0.05)；SwnH1和SwnH2的mRNA表达水平在整个试验过程中无显著变化；SwnR基因的mRNA表达水平在第3天显著上调，与第5、7天时相比差异极显著(P < 0.01)。
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*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 2 不同发酵时间金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路催化酶基因mRNA表达分析 Fig. 2 mRNA expression analysis on catalyzing enzyme genes in the swainsonine biosynthesis pathway of M. anisopliae at different fermentation time |
1993年，Patrick等[16]首次从金龟子绿僵菌中分离得到苦马豆素。随后，张黎等[17]将豆类丝核菌接种于改良察氏液体培养基，于温箱中发酵14 d，气相色谱仪检测得发酵液中苦马豆素最高含量为1 199.64 mg·L-1。宋向东等[18]等将疯草棘豆蠕孢菌接种于改良察氏液体培养基，于28 ℃恒温培养，经α-甘露糖苷酶检测，12 d后发酵液中的苦马豆素含量显著增加，直到28 d时趋于稳定，为5.318 1 mg·L-1。此外，Song等[19]采用分段萃取法，将疯草棘豆蠕孢菌的发酵液用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇等萃取，甲醇溶解提取物通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测，发现发酵液中除苦马豆素外还有2-羟基吲哚唑烷、扁豆苷、5, 6-二氢麦角固醇、齿孔醇、羊毛甾醇和L-苯丙氨酰基-L-脯氨酸内酰胺等化合物。本试验将金龟子绿僵菌经改良察氏液体培养基发酵，通过Q Exactive高分辨质谱仪检测，得第3天时发酵液中的苦马豆素含量最高，为2 429.24 mg·L-1。以上试验均采用改良察氏培养基进行发酵，与豆类丝核菌和棘豆蠕孢菌相比，金龟子绿僵菌发酵时间短，发酵液中苦马豆素含量高，因此金龟子绿僵菌更适用于苦马豆素的工业化生产，有望解决苦马豆素药源不足的问题。
此外，国内外学者也开展了大量关于内生真菌苦马豆素生物合成通路及相关催化酶研究。在豆类丝核菌中，苦马豆素的生物合成通路为L-赖氨酸在酵母氨酸脱氢酶的作用下形成酵母氨酸，酵母氨酸经酵母氨酸还原酶的作用生成L-2-氨基己二酸半醛，通过构型改变生成6-羧基-哌啶酸(δ1-piperidine-6-carboxylate，P6C)，P6C在6-羧基-哌啶酸还原酶的催化下生成哌啶酸(哌可酸)，哌可酸和丙二酸反应生成乙酸哌啶，经过还原环化作用生成1-酮基-吲哚里西啶，之后在其还原酶的作用下生成(1S, 8aS)-吲哚里西啶和(1R, 8aS)-羟基7吲哚里西啶，经过两次羟化反应后分别生成根霉菌胺和苦马豆素[12, 20-22]。1997年，Sim和Perry[22]研究了金龟子绿僵菌的苦马豆素生物合成通路，结果显示L-赖氨酸和α-酮戊二酸分别为两条合成途径的起始物质，而6-羧基-哌啶酸为两条途径的共同中间产物，之后转化生成哌可酸，最终生成苦马豆素。由上述研究可以看出，豆类丝核菌通过P6C途径合成苦马豆素的直接前体物质是1-酮基-吲哚里西啶，最终形成两种不同的产物，而金龟子绿僵菌通过P6C途径合成苦马豆素的过程中有两种不同的起始物质，但最终只生成一种终产物。2017年，Cook等[14]通过对豆类丝核菌、疯草棘豆蠕孢菌、罗伯茨绿僵菌和牵牛属内生真菌等进行全基因组测序，结果显示这些真菌含有共同的合成苦马豆素的同源基因簇——“Swn”，该基因簇包括7个基因，即SwnA、SwnH1、SwnH2、SwnK、SwnN、SwnR和SwnT，为了探讨这些基因与苦马豆素产量之间的关系，本试验通过Q Exactive高分辨质谱仪检测发酵液中苦马豆素含量、qRT-PCR检测发酵过程中第1、3、5、7天上述基因mRNA表达水平的变化，结果发现SwnR基因mRNA表达水平在第3天时相对表达量最高，发酵液中苦马豆素含量在第3天时最高，SwnR基因mRNA表达水平与苦马豆素产量变化均为倒“U”字形，变化趋势一致，由此推测SwnR基因是金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中的关键催化酶基因；而SwnH2基因mRNA表达水平变化趋势呈正“U”字型，与苦马豆素产量变化相反，但其表达量的变化不显著，推测该基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中起负调控作用；SwnT和SwnK基因mRNA表达水平在第3天时显著下降，在第7天时又显著上升，这与发酵液中苦马豆素产量变化相反；SwnN mRNA表达水平在第3天时显著下降，并且在之后的4 d内没有明显变化，由此推测，苦马豆素可能会抑制SwnT、SwnK和SwnN的表达；SwnH1mRNA表达水平在7 d内没有明显变化，表明该基因在金龟子绿僵菌苦马豆素合成过程中调控作用不明显。
4 结论通过对不同发酵时间金龟子绿僵菌发酵液中参与苦马豆素生物合成的催化酶基因mRNA表达水平的检测，发现SwnA、SwnH1、SwnH2、SwnK、SwnN、SwnR和SwnT基因在不同发酵时间其表达量差异较大，SwnR基因mRNA表达水平与发酵液中苦马豆素产量变化一致，而SwnH2基因mRNA表达水平与发酵液中苦马豆素产量变化相反。试验结果可为深入探讨金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路及其关键催化酶基因功能提供重要理论参考。
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