2. 南开大学, 天津 300071;
3. 河北农业大学, 保定 071000
2. Nankai University, Tianjin 300071, China;
3. Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China
羊奶营养均衡，较牛奶营养价值更高。研究数据表明羊奶中总脂肪含量较高，脂肪酸种类丰富，短、中链脂肪酸、不饱和脂肪酸和共轭亚油酸等含量均显著高于牛奶[1]。羊奶中富含的单不饱和脂肪酸有益于人体的心血管系统健康，能够降低胆固醇含量，改善高血脂症状，抑制肿瘤的生长，具有保健功能[2]。因此，羊乳品质与脂肪酸组成之间的内在联系已逐渐成为学术界和消费者关注的热点[3]。研究表明，乳中不饱和脂肪酸的合成在很大程度上受激素和日粮结构的影响，进而从转录水平调控基因的表达，这为羊奶乳脂合成调控提供了一个可操控的途径[4]。
PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)是一个同时具有抑癌作用和磷酸酶活性的肿瘤抑制因子，它参与调节细胞生长、增殖、生存及转移，因而其研究主要集中在癌症和炎症方面[5]。癌细胞的扩散与脂质代谢异常有着密不可分的关系。目前，PTEN调节脂类代谢的研究主要集中在肝疾病方面[6]，Horie等[7]报道小鼠肝特异性敲除PTEN 显著影响了肝细胞中棕榈油酸和油酸的含量。PTEN也能够通过一系列信号通路调控乳腺脂质代谢[8]。PTEN 转基因小鼠不能正常泌乳，其幼鼠的死亡率达到30%，而由野生型小鼠喂养后，可恢复正常的生长速度，表明PTEN在小鼠乳腺发育和泌乳过程中发挥重要作用[9]。然而，该基因在反刍动物乳腺脂质代谢中的作用鲜有研究。
本研究首次从奶山羊乳腺组织中克隆出PTEN基因的CDS区，并对该基因在不同泌乳时期的转录量进行分析。利用RNA干扰技术，合成并筛选到靶向PTEN基因的有效siRNA后，研究干扰该基因后对奶山羊乳腺上皮细胞中乳脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成的影响，为进一步阐明奶山羊乳脂质代谢的调控机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集奶山羊乳腺组织由西北农林科技大学萨能羊原种场提供，实验羊为体况相似且分别处于泌乳盛期和干奶期的奶山羊各6只(n=6)。泌乳盛期奶山羊乳腺上皮细胞与赛百慷(上海)生物技术股份有限公司合作培养。采用手术法对乳腺腺泡组织进行分离，避开乳导管以及大血管，分离出大约5 g的组织块，放置于添加有3倍双抗的D-Hank’s液中迅速带回无菌细胞培养间，用D-Hank’s液将组织样中杂质及血液清洗至清洗液清亮。在超净工作台中对组织块进行分离修剪，去掉脂肪、结缔组织等后，将乳腺腺泡组织修剪成1 mm3大小，置于液氮中保存。
1.1.2 主要试剂RNA提取Trizol试剂盒、PrimeScript® RT Reagent Kit试剂盒、荧光定量试剂SYBR®Premix Ex TaqTM、LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ均购自宝生物工程大连有限公司(TaKaRa)。DNA MarkerⅢ相对分子质量标准、pMD19-T载体连接试剂盒、质粒提取试剂盒DNA凝胶纯化回收试剂盒、DNA片段快速回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司(北京)。DEPC水购自索莱宝生物科技有限公司(北京)。DMEM/F-12培养基、转染试剂Lipofectamine®RNAiMAX、胎牛血清购自赛默飞公司(北京)。
1.2 方法 1.2.1 PTEN基因CDS区的克隆根据GenBank提供的山羊(NC_030833.1)基因组序列中PTEN基因与牛(NM_001319898)、猪(NM_001143696)和人(NM_000314)的PTEN基因核苷酸序列进行同源性比对，并利用Premier 5.0软件对其CDS区设计特异性扩增引物：F: 5′-AGCCGTTCCGAGGATTAT-3′；R: 5′-TCTGTTGCCACAAGTGCA-3′。引物由生工生物工程公司(上海)合成。
以泌乳盛期奶山羊乳腺组织cDNA为模板，对PTEN基因CDS区进行PCR扩增，PCR反应体系及反应程序参照Yao等[10]的方法进行设计。延伸时间为2 min，退火温度为60 ℃，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确后，回收并纯化目的产物，与pMD19-T载体进行连接，构建克隆载体pMD19-T-PTEN，并在E. coli Top10大肠杆菌感受态细胞内转化，37 ℃培养13~16 h，挑取阳性克隆，提质粒进行SalⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定正确后，送测序。
1.2.2 PTEN基因生物信息学分析利用NCBI中的Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行奶山羊与其他物种PTEN基因核苷酸序列的同源性比对。通过Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行不同物种间PTEN基因的氨基酸序列多重比对，利用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)、ExPASy Proteomics Server(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对奶山羊PTEN蛋白的相对分子质量、理论等电点、蛋白疏水性预测、跨膜结构域及三级结构进行预测。
1.2.3 不同泌乳时期PTEN基因差异转录分析分别提取处于干奶期和泌乳盛期奶山羊乳腺组织中的TotalRNA，检测纯度和浓度后参照PrimeScript®RT Regent Kit(TaKaRa)操作说明反转录成cDNA，用gDNA Easer去除基因组DNA，防止对后续试验的影响。分别将两个时期3个重复个体的乳腺组织的cDNA作为模板，为保证RT-qPCR结果的稳定性和准确性，线粒体核糖体蛋白39基因(MRPL39)和广泛表达转录蛋白基因(UXT)为内参基因检测这两个时期PTEN基因的转录差异(荧光定量引物见表 1)。最后采用2-△△Ct法进行相对定量分析，双内参的Ct值为两个内参的几何平均值。每个时期加样3次。其中△△Ct=[(Ctgene－CtUXT、MRPL39)]试验组－[(Ctgene－CtUXT、MRPL39)]对照组。
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表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for RT-qPCR |
siRNA为双链RNA，通常为19 nt+dTdT 3′悬垂结构，即正义链(非作用链)为19碱基的靶序列转换为RNA加上dTdT，反义链(作用链)为与靶序列互补的RNA加上dTdT悬垂。根据Invitrogen公司BLOCK-iTTM RNAi Express软件(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)针对本试验克隆的奶山羊PTEN基因CDS区在线设计3对siRNA和对照siRNA(表 2)，并进行合成。通过检测相对分子质量确认其准确性后，进行后续转染试验。
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表 2 针对山羊PTEN基因的siRNA序列 Table 2 Sequence of siRNA for goat PTEN |
采用组织块法对奶山羊乳腺上皮细胞进行体外培养, 经形态学与特异性β-酪蛋白表达量鉴定为乳腺上皮细胞，具体步骤参照Shi等[11]将泌乳盛期乳腺上皮细胞(GMEC)置于37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养，培养基成分为D-MEM/F-12+10% FBS+1%双抗生素(双抗生素：1万单位的青霉素和1万单位的链霉素溶液)+氢化可的松(5 μg·L-1，无水乙醇溶解)表皮生长因子(1 μg·L-1)+牛胰岛素(5 μg·L-1)，每隔24 h进行换液处理。siRNA转染时，根据Lipofectamine®RNAiMAX转染说明书配制转染复合物，避光孵育20 min，同时转染对照组和试验组siRNA至乳腺上皮细胞中，细胞密度以80%~90%为宜，每组重复3次。
1.2.6 PTEN基因的干扰效果检测及有效siRNA的筛选转染期间每隔24 h进行换液，48 h后用PBS润洗三遍，采用Trizol法提取总RNA，检测纯度和浓度后反转录为cDNA，并以此为模板，通过RT-qPCR检测PTEN基因的转录量，PTEN基因的定量引物见表 1，采用2-△△Ct法进行相对定量法计算各组siRNA的干扰效率，筛选出干扰效率最佳的siRNA。
1.2.7 RT-qPCR检测干扰PTEN基因对乳腺脂代谢关键基因的影响将干扰效率最佳siRNA转染至泌乳盛期乳腺上皮细胞中，48 h后提取总RNA并制备cDNA用于RT-qPCR。利用Primer Premier5.0软件根据NCBI已公布的基因序列跨越内含子设计PTEN基因RT-qPCR引物，其他脂质代谢相关基因的RT-qPCR引物参照Yao等[12](详见表 1)，反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)PCR 5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL，模板0.6 μL，ddH2O补充至10 μL。反应步骤：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。具体操作步骤参照Bionaz和Loor[13]的研究。每个样品设置3个重复。选择UXT、MRPL39为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。
1.2.8 脂肪酸的提取与检测将奶山羊乳腺上皮细胞接种于60 mm细胞培养皿中，siRNA转染48 h后，细胞浓度为3×106，弃去培养基并用PBS润洗3次，用于脂肪酸的提取和甲酯化。脂肪酸提取方法参照Yao等[12]，最后将溶于正己烷的脂肪酸置于玻璃进样瓶中封口以备后续气相色谱分析，条件设置参照Shi等[14]。脂肪酸含量分析为相对值，即根据每种脂肪酸的峰值面积占检测出的所有脂肪酸峰值面积总和的比例。
2 结果 2.1 奶山羊PTEN基因CDS区的克隆提取奶山羊乳腺组织中总RNA，以反转录的cDNA为模板进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为约1 900 bp的单一条带，符合预期结果(图 1A)，与pMD19-T载体进行连接，经双酶切鉴定(图 1B)连接正确后送测序，结果经Blast比对分析，确认克隆到西农萨能奶山羊PTEN基因的CDS区，全长共1 212 bp，编码403个氨基酸，提交至GenBank，登录号为158074.1。通过序列比对与牛、猪和人的相似度分别为99%、98%和97%，氨基酸编码序列相似性为99%以上。PTEN蛋白相对分子质量为47.15 ku，理论等电点为5.94。
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M.DNA相对分子质量标准；1.PTEN基因CDS区PCR扩增产物；2.pMD19-T-PTEN经SalⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 M. DNA marker Ⅲ; 1.Amplification product of PTEN CDS region by PCR; 2.pMD19-T-PTEN vector digested by SalⅠ and EcoRⅠ 图 1 PTEN基因的克隆(A)与鉴定(B) Fig. 1 Cloning(A) and identification(B) of PTEN gene |
经NCBI中Blast进行同源性分析后发现，奶山羊PTEN基因的CDS区核苷酸序列与牛(NM_001319898)、猪(NM_00143698)和人(NM_000314)相似度分别为99%、98%和97%，氨基酸编码序列相似性均为99%以上(图 2)。PTEN蛋白相对分子质量为47.15 ku，理论等电点为5.94。经蛋白疏水性预测发现，该蛋白的疏水最大值为2.311，最小值为-3.633，具有较强的疏水性。主要定位于细胞质中，且不存在跨膜结构。利用SWISS-MODEL对该蛋白质三级结构进行同源模型预测，由预测结果发现，该蛋白与PDB数据库提供的氨基酸序列相似性达到99.69%，三级结构图比较完整，N端第7—186位氨基酸为保守的磷酸酶结构域，两端存在较多二级结构及超二级结构，如βαβ、βββ和α/β桶等(图 3)。
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gPTEN为山羊(Capra hircus)PTEN基因氨基酸序列，bPTEN为牛(Bos taurus)PTEN基因氨基酸序列，sPTEN为猪(Sus scrofa)PTEN基因氨基酸序列，hPTEN为人(Homo sapiens)PTEN基因氨基酸序列；蓝色部分表示所比对的氨基酸序列完全一致，紫色部分表示所比对的氨基酸中出现了非保守替换，红线框内为磷酸酶结构域 gPTEN is the amino acids sequence of Capra hircus PTEN gene, bPTEN is the amino acids sequence of Bos taurus PTEN gene, sPTEN is the amino acids sequence of Sus scrofa PTEN gene, hPTEN is the amino acids sequence of Homo sapiens PTEN gene; The black part indicates the aligned amino acids, the gray portion indicates a conservative substitution in the aligned amino acids and the Phosphatase domain is in the red line 图 2 奶山羊与牛、猪、人的PTEN 基因氨基酸序列比对结果 Fig. 2 Comparison of amino acid sequences between dairy goats, cattle, pig and human PTEN sequences |
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图 3 山羊PTEN蛋白的三级结构预测 Fig. 3 Prediction of tertiary structure of goat PTEN protein |
以UXT和MRPL39作为内参基因，通过RT-qPCR检测奶山羊在泌乳盛期和干奶期乳腺组织中PTEN基因的mRNA转录量。结果表明，PTEN基因在泌乳盛期的转录量显著低于干奶期，降低51.5%且差异显著(P < 0.05), 见图 4。
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*.与对照组相比差异显著P < 0.05；下同 *. P < 0.05 compared with control group; The same as below 图 4 奶山羊不同泌乳时期的转录分析 Fig. 4 Analysis of transcription in different lactation stages in dairy goat |
将3条siRNA分别转染乳腺上皮细胞中，转染48 h后，采用Trizol法提取总RNA，经纯度和浓度检测后反转录为cDNA进行荧光定量PCR，结果表明：3对siRNA均有极显著的干扰效果(P < 0.01)，其中3号干扰效率最高，降低94%(图 5)。
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**.与对照组相比差异极显著P < 0.01;下同 **. P < 0.01 compared with control group; The same as below 图 5 奶山羊PTEN基因的siRNA序列的筛选及干扰效率检测 Fig. 5 Screening of siRNA sequences of PTEN gene and detection of interference efficiency in dairy goats |
利用“2.1”中获得的RNA样品，经RT-qPCR检测脂质合成相关基因的转录情况。干扰PTEN基因后，转录因子SREBP1及其调控的两个参与脂肪酸从头合成及去饱和过程的关键基因FASN、ACACA和SCD1的mRNA转录量均显著上调(图 6A)；参与脂肪酸摄取和转运的关键基因LPL和FABP3的转录量受到显著抑制(P < 0.01或P < 0.05，图 6B)；参与脂肪酸氧化的ACOX1和CPT1B基因的转录量极显著下调(P < 0.01，图 6C)；参与三酰甘油代谢的关键基因GPAM、DGAT2和HSL均被显著抑制(P < 0.01)，而AGPAT6和LIPIN1基因的转录量没有显著变化(图 6D)。
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A.脂肪酸从头合成及去饱和；B.脂肪酸摄取和转运；C.脂肪酸氧化；D.三酰甘油合成与水解 A. Fatty acid de novo synthesis and desaturation; B. Fatty acid uptake and transport; C. Fatty acid oxidation; D. Synthesis and hydrolysis of triglycerides 图 6 干扰PTEN基因后对脂质合成相关基因mRNA转录量的影响 Fig. 6 Interfering with PTEN on the mRNA transcription of lipid synthesis related genes |
PTEN基因的siRNA转染至乳腺上皮细胞培养48 h后，提取细胞总脂肪酸，GC检测分析细胞内脂肪酸的组成变化。与对照组相比，干扰PTEN能够显著下调棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的含量(图 7A)，显著上调C16:1(图 7B)的去饱和指数，对C18:1的去饱和指数影响不明显(图 7C)。
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A. C16-18在不同处理下的含量比例；B. C16:1的去饱和指数；C. C18:1的去饱和指数 A. Composition of C16-18 in cells. Data are reported as percentage of total fatty acids; B. Desaturation index of C16:1;C. Desaturation index of C18:1. Values are means ± SEM for three individual experiments 图 7 干扰PTEN对脂肪酸组成的影响 Fig. 7 Interfering with PTEN on fatty acid composition |
本研究首次从奶山羊乳腺组织中克隆到PTEN基因CDS区，与牛、猪和人PTEN基因(登录号分别为NM_001319898、NM_00143698、NM_000314)的核苷酸相似性分为99%、98%和97%，氨基酸序列相似性为99%以上。其蛋白产物主要包括N端的酪蛋白磷酸酶的功能区和C端约175个氨基酸左右的与骨架蛋白同源的区域。且具有高度保守性[15]，三级结构预测结果显示蛋白N端具有保守的磷酸酶功能区，且两端存在较多的超二级结构，如α/β桶等。大量研究表明，靠近α/β桶一端的袋状空穴常常是酶的活性位点，且其周围有较多的无规则柔性区域[16]。而PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一，具有双特异性磷酸酶活性，这也为进一步研究PTEN发挥磷酸酶作用位点提供了一定参考。PTEN蛋白在体内主要通过磷酸化负向调控多条参与细胞代谢的重要信号通路如PI3K-AKT通路、MAPK通路和FAK信号通路等。大量研究表明多种转移性癌症的PTEN基因出现突变或缺失，并伴随着脂代谢紊乱的现象[17]。Chen等[18]在非转移性PTEN-null小鼠CaP模型中研究表明，激活MAPK信号途径，小鼠发生致死性转移，且诱导脂肪生成的重要转录因子SREBP信号出现高度富集。同样，特异性敲除PTEN的小鼠能够激活PI3K-Akt通路，诱导加速终末乳腺上皮细胞分化使催乳素自分泌增加从而驱动泌乳[19]。乳腺组织是奶山羊泌乳时期进行脂质合成的重要场所。本研究通过检测PTEN基因在乳腺组织中不同泌乳时期的差异转录，发现其在泌乳盛期的转录量较干奶期下降51.5%，这与Wang等[9]在奶牛乳腺组织中检测该基因在不同泌乳期的差异表达结果是一致的，且高乳品质泌乳期低于低乳品质时期，说明该基因很可能参与调节奶山羊的乳腺发育和泌乳。为进一步阐明PTEN基因在奶山羊泌乳高峰时期在乳脂代谢中具体调控机制，本研究利用RNA干扰技术在线设计并合成靶向该基因的siRNA，成功转染至奶山羊乳腺上皮细胞中，并通过RT-qPCR检测PTEN基因的转录量筛选到干扰效果最佳的siRNA，干扰效率达到94%，为后续研究该基因在乳腺上皮细胞中的功能提供理想的实验材料。
奶山羊乳腺上皮细胞中的乳脂代谢调控主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸的摄取和转运、以及转录因子调控等[20]。SREBP1是乳脂合成调控中的重要转录因子。本研究在乳腺上皮细胞中干扰PTEN基因后，SREBP1基因转录量出现极显著上调。研究表明，SREBP1前期以无活性的前体蛋白形式锚定在内质网上，主要通过AKT的活化激活SCAP/SREBP蛋白复合物，促进SREBP1从内质网转运至高尔基体的成熟过程[21]。并且在细胞核中通过结合在靶基因(如FASN、SCD1、ACACA)的启动子(如SRE位点)直接或间接调控参与调控与脂肪酸从头合成及去饱和等相关过程[22]。本研究同时对SREBP1调控的下游参与脂肪酸从头合成的靶基因FASN、ACACA及SCD1的转录量进行检测，均有显著上调。这与Hao等[23]在糖尿病大鼠肾近端小管细胞中上调PTEN的表达能够通过抑制PI3K-AKT通路下调脂肪生成相关基因(包括SREBP1、FASN和ACACA)表达的研究结果对应。而Oliner等[24]的研究证实SREBP1的转录活性可通过与 CREB结合蛋白相互作用而激活，且不依赖于PI3K/AKT信号通路。因此，本研究中PTEN对SREBP1转录因子的具体调控机制有待进一步研究。从头合成的脂肪酸是构成乳腺上皮细胞中脂肪酸库的主要来源之一，其余部分来源于从外周循环血液中摄取的脂肪酸[25]，包括游离的以及和脂蛋白结合形式的长链脂肪酸，被脂蛋白包被的长链脂肪酸只有在被脂蛋白酯酶(LPL)消化之后才被乳腺上皮细胞吸收，这些脂肪酸需要由跨膜转运蛋白转运到特定的细胞器上参与代谢，如到线粒体进行氧化供能[26]，或者到内质网参与三酰甘油的合成，最后由单层磷脂单分子层包被组装成脂滴，释放到细胞外。本研究发现，干扰乳腺上皮细胞中PTEN基因后，参与脂肪酸摄取和转运的关键基因LPL和FABP3的转录量和参与脂肪酸氧化的关键基因ACOX1和CPT1B的转录量均受到显著抑制，同时，进行三酰甘油代谢的关键基因GPAM、DGAT2和HSL均出现极显著下调，而对AGPAT6和LIPIN1基因的转录量没有显著影响。以上结果表明在乳腺上皮细胞中干扰该基因后很可能通过抑制脂肪酸的摄取和转运，降低细胞内游离脂肪酸的氧化且减少供能，使大量从头合成的脂肪酸积累，同时，三酰甘油合成与水解受阻，不能及时释放到细胞外，导致细胞内脂代谢紊乱。Yue等[16]在前列腺癌细胞中缺失PTEN基因激活PI3K/AKT通路导致细胞内脂质的异常积累，并且证实这种积累是由于外源性脂蛋白的摄取显著增加的结果，此研究结论在一定程度上为本研究结果提供参考，但PTEN-PI3K-AKT介导的信号转导通路对乳脂代谢调控的具体机制有待深进一步研究。
Ran等[27]在敲低PTEN基因的结直肠癌细胞(CRC)中发现SCD1基因的高表达能够增加细胞内MUFA水平，并对PTEN产生反馈抑制作用，从而增强CRC侵润能力。Bernard等[28]的研究表明SCD1的mRNA和蛋白表达水平在处于泌乳期的反刍动物的乳腺中均有较高表达，且SCD1催化的主要产物MUFA是合成乳腺组织中三酰甘油的重要底物，这与本研究在乳腺上皮细胞中干扰PTEN基因后显著上调SCD1的转录量及C16:1去饱和指数的结果一致，表明干扰PTEN基因很可能通过增加去饱和酶基因的表达对脂肪酸组成有重要影响，为进一步提高羊奶品质提供了新的思路。
4 结论首次对奶山羊PTEN基因进行克隆及生物信息学分析，并在不同泌乳时期的乳腺组织中对其进行差异转录分析。RT-qPCR结果表明，PTEN基因在泌乳盛期乳腺组织的转录量较干奶期下降51.5%，并且应用RNA干扰技术发现在奶山羊乳腺上皮细胞中干扰该基因能够显著调控乳脂合成相关基因的转录及脂肪酸的组成，研究结果为PTEN基因在奶山羊泌乳时期乳腺组织中的乳脂合成及脂肪酸组成的调控机制奠定了理论基础。
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