2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Animal Genetic Resource and Utilization, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人和动物主要的临床致病菌之一，30%左右的成年人鼻腔中携带金黄色葡萄球菌[1]，它是导致皮肤、软组织和血液感染的重要因素[2-3]。目前，金黄色葡萄球菌仍然是社区和医院获得性感染的主要原因之一，它具有不同的毒力因子和毒素，可导致多种疾病的发生[4]。人类通过接触动物或其产品感染金黄色葡萄球菌[5]，已有报道显示，家畜相关的金黄色葡萄球菌可造成人类感染[6]。面对由细菌造成的感染，人们更多地是使用抗菌药物来杀死病原菌从而达到治疗目的。然而，由于抗菌药物的大量使用，造成了细菌耐药性的增强，使得临床治疗变得困难甚至无效[7]。如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的出现。MRSA菌株除对β-内酰胺类抗菌药物耐药外，还对许多非β-内酰胺类抗菌药物耐药[8-9]。因此，预防或减少耐药菌的出现是维持现有抗菌药物效力的关键[10]。
金属离子是许多酶的重要辅助因子，是生命中必不可少的微量元素[11]。在畜牧业中，许多重金属作为一种安全的抗菌剂发挥着重要作用[12]。如汞、铋、锑等金属化合物用于感染、寄生虫和溃疡等治疗[13]；锌是哺乳动物的必需元素，在许多欧洲国家用锌治疗或预防断奶后疾病[11]；铜则用于促进动物生长及治疗禽类腹泻[14]。然而，细菌暴露于重金属环境中，使得某些耐药菌株同时表现出对重金属的抗性。早有报道显示，已从人和家畜来源的细菌中分离出重金属-耐药基因的共抗质粒[10, 15-16]，且饲料中重金属的存在与多重耐药菌株的产生有关[17-19]。这些报道表明，重金属可能会驱动细菌耐药性的发展[20]。在金黄色葡萄球菌中，铜稳态主要由ATPase CopA维持，编码CopA的基因高度保守。最近的报道强调了与牲畜有关的金黄色葡萄球菌对铜的抗性[21]。为了进一步了解重金属Cu2+和MRSA菌株耐药性之间的关系，本研究通过对不同来源的MRSA菌株进行硫酸铜溶液连续诱导，探究Cu2+对MRSA菌株耐药性及抗重金属铜基因copA和抗生素耐药基因表达的影响，进而警示人们重金属离子与抗菌药物抗性之间存在协同效应。
1 材料与方法 1.1 菌株的来源及基因携带情况本研究试验菌株为牦牛养殖环节菌株MR-YB1224(SCCⅣa+ST59型)、牦牛屠宰环节菌株MR-YS3(SCCⅣc+ST9型)和猪肉流通环节菌株MR-P318(SCCⅣa+ST88型)；MRSA菌株ATCC43300、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。所用菌株均为西南民族大学生命科学与技术学院食品安全与微生物实验室保存。前期对受试菌株的耐药基因及抗重金属基因已进行常规PCR检测，受试菌株携带的相关抗性基因见表 1。
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表 1 MRSA菌株抗重金属基因及耐药基因携带情况 Table 1 The anti-heavy metal genes and antibiotic resistance genes in MRSA strains |
Baird-Parker(BP)琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购自青岛海博生物技术有限公司；1×TSINGKE Master Mix、DL2000 Marker、Gel view核酸染料购自成都擎科梓熙生物技术有限公司；柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒、M-Mulv第一链cDNA合成试剂盒、Taq PCR Master Mix购自上海生工股份有限公司；溶菌酶购自北京博奥拓达科技有限公司；五水硫酸铜(分子质量249.69)购自西亚化工股份有限公司；抗菌药物(氨苄青霉素钠、苯唑西林钠、氧氟沙星、头孢西丁、罗红霉素、链霉素)购自上海源叶生物科技有限公司。
1.3 仪器BioSpec-nano230V核酸测定仪、CFX96荧光定量PCR仪、PTC-200 PCR仪、Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；UV-6100分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；WD800B型微波炉(顺德市格兰仕微波炉电器有限公司)；5804R型Eppendorf冷冻离心机(Eppendorf中国有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；GHP-9080水式恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；HZQ-F160全温振荡培养箱(江苏省太仓市实验设备厂)。
1.4 方法 1.4.1 MRSA菌株对硫酸铜溶液最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的测定参考美国临床实验室标准化委员会指南(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)[22]推荐使用的硫酸铜溶液浓度范围1~28 mmol·L-1，用去离子水将其分别配制成6、8、10、12、14、16 mmol·L-1的受试液。参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南[23]和吴生根[24]的方法，采用营养肉汤稀释法测定MRSA菌株对硫酸铜溶液的MIC值，具体操作如下：取各稀释度硫酸铜溶液2.5 mL分别加入到等体积TSB的试管中，取100 μL含菌量约为108CFU·mL－1的菌悬液接种于不同浓度的硫酸铜-TSB中，37 ℃，恒温培养18~24 h，使培养后菌悬液的作用浓度在5×105~5×106 CFU·mL－1，硫酸铜溶液的作用浓度为配制浓度的1/2，每组试验重复3次。阳性对照：100 μL菌悬液+5 mL TSB；阴性对照：100 μL去离子水+2.5 mL TSB+2.5 mL硫酸铜溶液。结果判定：阳性对照混浊，阴性对照清澈透明，试验组无菌生长所对应的最低硫酸铜溶液工作浓度，即为受试MRSA菌株的MIC。
1.4.2 亚抑制剂量(1/4MIC)硫酸铜溶液连续诱导MRSA菌株根据“1.4.1”的结果，选择1/4 MIC的硫酸铜溶液对MRSA菌株进行连续诱导。具体操作：取1/2 MIC硫酸铜溶液2.5 mL与TSB等体积混合，接入50 μL菌液，37 ℃，150 r·min-1培养。间隔24 h，取培养后菌液50 μL接入新的1/2 MIC硫酸铜-TSB中，连续培养7 d(168 h)，每组3个平行。
1.4.3 诱导后MRSA菌株对硫酸铜溶液MIC值测定根据“1.4.1”的方法得到各菌株对硫酸铜溶液的MIC值。按“1.4.2”的方法，对MRSA菌株进行连续诱导，在7 d时取出，测定诱导后不同MRSA菌株对硫酸铜溶液的MIC值变化，测定方法及结果判定同“1.4.1”。
1.4.4 诱导前后MRSA菌株对6种抗生素MIC的测定根据CLSI指南[23]推荐的关于各抗菌药物配制方法，分别对氨苄青霉素钠、苯唑西林钠、氧氟沙星、头孢西丁、罗红霉素和链霉素6种抗生素进行配制，并稀释成不同浓度。同样，测定诱导前后MRSA菌株对各种抗生素的MIC值的变化，测定方法及结果判定同“1.4.1”。
1.4.5 不同时间点MRSA菌株抗重金属/抗生素基因表达检测 1.4.5.1 菌体收集、总RNA提取和反转录根据“1.4.2”，从12 h起，每隔24 h收集菌体，即在诱导12、36、60、84、108、132和156 h时收集菌体。按试剂盒操作方法提取细菌总RNA并反转录为cDNA，采用核酸浓度测定仪测定核酸浓度，A260/A280比值评估核酸纯度。
1.4.5.2 MRSA菌株抗重金属基因动态表达量检测按照试剂盒的操作说明，测定抗重金属基因(抗铜基因copA、抗砷基因arsB)的相对表达量。反应程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，3 s；60 ℃，30 s，40个循环。各荧光定量引物序列见表 2。得到不同取样点对应的Ct值，利用内参基因16S RNA进行归一化，通过2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量[25]。
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表 2 Real-time PCR引物序列 Table 2 Primers sequence for real-time PCR |
测定编码青霉素结合蛋白PBP2a的耐药基因mecA、氟喹诺酮类耐药相关基因norA、大环内酯类抗菌药物耐药基因ermB、氨基糖苷类抗菌药物耐药基因aac6′/aph2″的相对表达量。各荧光定量引物序列见表 2。反应程序及计算方法同“1.4.5.2”。
1.4.6 数据分析试验数据采用Excel进行初步处理，采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析(ANOVA)和差异显著性检验，利用Duncan’s法进行多重比较。以P值作为差异显著性标准。P>0.05为差异不显著；P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 诱导前后MRSA菌株对硫酸铜溶液MIC值比较诱导前测定MRSA菌株对硫酸铜溶液的MIC值，在1/4MIC硫酸铜溶液连续诱导7 d后，再次测定，对比MIC值在诱导前后的变化。结果表明(图 1)，在诱导前，MR-YB1224、MR-YS3和MR-P318的MIC值分别为2.5、3.5和3 mmol·L-1。连续诱导7 d后，3株菌对硫酸铜溶液的抗性均有不同程度的增加，诱导后的菌株平均MIC值分别为3.7、4.7和3.7 mmol·L-1，MR-YB1224和MR-YS3菌株在1/4MIC硫酸铜溶液诱导后，对硫酸铜溶液的MIC值差异显著(P < 0.05)。
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*表示差异显著，下同 *means significant difference, the same as below 图 1 硫酸铜溶液诱导前后3株MRSA菌株对硫酸铜溶液的MIC值比较 Fig. 1 The comparison of MIC values to copper sulfate solution before and after induction by copper sulfate solution in 3 MRSA strains |
通过1/4MIC硫酸铜溶液连续诱导7 d后，分别测定MRSA菌株对β-内酰胺类抗菌药物(氨苄西林、苯唑西林、头孢西丁)、氟喹诺酮类抗菌药物(氧氟沙星)、大环内酯类抗菌药物(罗红霉素)和氨基糖苷类抗菌药物(链霉素)等的MIC值，并对比诱导前后MIC值的变化，结果详见图 2。连续诱导7 d后，除3株MRSA菌株对罗红霉素的MIC值在硫酸铜溶液诱导前后无变化，以及MR-YB1224对氧氟沙星的MIC值不变外，3株MRSA菌株对其他几种抗菌药物的MIC值均有不同程度增加。除MR-P318对苯唑西林的MIC值在诱导前后变化不显著外，其余3株MRSA菌株对β-内酰胺类抗菌药物的MIC值在诱导前后变化显著(P < 0.05)，诱导后的MR-YS3菌株对苯唑西林的MIC值是诱导前的106倍。诱导后，MRSA菌株对6种抗菌药物MIC值变化大小依次为：苯唑西林>氨苄西林>头孢西丁>氧氟沙星>链霉素>罗红霉素。
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图 2 硫酸铜溶液诱导前后3株MRSA菌株对6种抗菌药物的MIC值比较 Fig. 2 The comparison of MIC values to 6 different antibiotics before and after induction by copper sulfate solution in 3 MRSA strains |
采用1/4MIC硫酸铜溶液连续诱导7 d，从12 h起，每隔24 h取样检测3株MRSA菌株对抗重金属基因copA和arsB的表达情况。结果表明(图 3)，在硫酸铜溶液连续诱导7 d，3株MRSA携带的抗重金属基因copA和arsB的表达量呈逐渐增高趋势。其中，MR-YS3、MR-YB1224和MR-P318菌株的copA基因表达量在60~156 h上调明显(P < 0.05)；MR-YS3、MR-YB1224和MR-P318菌株的arsB基因表达量在84~156 h上调明显(P < 0.05)。3株MRSA菌株的抗重金属基因表达量动态变化详见图 3。
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图 3 硫酸铜溶液连续诱导后3株MRSA菌株抗重金属基因相对表达量 Fig. 3 The relative expression of anti-heavy metal genes in 3 MRSA strains after continuous induction by copper sulfate solution |
采用1/4MIC硫酸铜溶液连续诱导7 d，从12 h起，每隔24 h取样，检测3株MRSA对耐药基因mecA、norA、ermB、aac6′/aph2″的表达情况。结果表明，在硫酸铜溶液连续诱导7 d的时间里，3株MRSA携带的耐药基因的表达量呈逐渐增高趋势。MR-YB1224菌株的mecA、ermB、norA、aac6′/aph2″基因表达量在84~156 h上调显著(P < 0.05)，其中，mecA基因表达量最高；MR-YS3菌株的mecA、ermB、norA、aac6′/aph2″基因表达量在108~156 h上调显著(P < 0.05)，同样，mecA基因表达量最高；MR-P318菌株的mecA、ermB、norA、aac6′/aph2″基因表达量在108~156 h显著上调(P < 0.05)，也是mecA基因表达量最高。同一菌株各耐药基因表达量的动态变化详见图 4。
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图 4 硫酸铜连续诱导后MR-YB1224菌株(A)、MR-YS3菌株(B)、MR-P318菌株(C)相关耐药基因的相对表达量 Fig. 4 Relative expression levels of related antibiotic genes in MR-YB1224 strain (A), MR-YS3 strain (B) and MR-P318 strain (C) after continuous induction by copper sulfate solution |
在畜牧业中，重金属离子因其能够替代抗菌剂而被广泛推广使用，从人和家畜来源的细菌以及人类食品中分离出的细菌，经常可观察到对砷、镉、铜、锌等具有抗性[28-29]。Aarestrup和Hasman[29]测定了从家畜中分离的不同种类的细菌对硫酸铜和氯化锌的抗性，结果表明金黄色葡萄球菌分离菌株对硫酸铜的MIC值为2~12 mmol·L-1，对氯化锌的MIC值为0.25~2 mmol·L-1。Cavaco等[30]测定了564株来自比利时、丹麦、法国等10个欧洲国家的金黄色葡萄球菌对硫酸铜的抗性，结果表明大部分受试菌株对硫酸铜的MIC值在8 mmol·L-1，部分菌株对硫酸铜的MIC值为4~28 mmol·L-1，MIC值≥28 mmol·L-1仅占2.3%。在本研究中，诱导前后，MR-YB1224、MR-YS3、MR-P318对硫酸铜溶液的MIC值分别为2.5/3.7、3.5/4.7、3/3.7 mmol·L-1，与上述其他学者的结果比较，本研究选用的菌株对硫酸铜具有较高敏感性。牦牛养殖/屠宰环节分离的金黄色葡萄球菌敏感性较高可能与青藏高原牦牛传统饲养方式有关，牦牛饲养仍然采用“靠天养畜”的传统放牧生产体系，补饲较少[31]。但3株菌株对硫酸铜的抗性在硫酸铜溶液单一连续诱导7 d后显著增高，说明重金属诱导在短时间内会导致菌株对重金属自身的抗性增强。由此推断，长期重金属接触可能会导致菌株对重金属的抗性增高，甚至出现耐受。本试验研究的是单一硫酸铜溶液诱导后菌株MIC值的变化情况，在实际情况中，菌株处在多种重金属污染下其抗性情况可能更为复杂。
本研究测定了硫酸铜诱导前后MRSA菌株对四类抗菌药物的MIC值变化，除MR-YB1224对氧氟沙星、以及3株MRSA对罗红霉素的MIC值在诱导前后无变化外；3株MRSA菌株对其余抗菌药物的MIC值均有不同程度增加。硫酸铜溶液连续诱导，明显增加了MRSA菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物的抗性。其他学者的研究也发现Cu2+可增加猪源分离菌株对β-内酰胺类和氨基糖苷类等药物的抗性[32-34]。本试验研究结果与上述有较高一致性。在重金属溶液诱导下，菌株对大部分抗菌药物的抗性增强，说明重金属与抗菌药物抗性之间存在较强的协同效应。
革兰阳性菌中铜和砷的抗性是由质粒介导的[14]。本研究中，硫酸铜溶液单一诱导之后，抗铜基因copA的表达量出现变化，抗砷基因arsB也发生了改变，copA基因和arsB基因的表达在诱导后期显著上调(P < 0.05)，可能是因为copA和arsB基因位于同一质粒上的缘故[11]。由此推断，单一的重金属溶液诱导可能会使位于同一遗传元件的其它抗重金属基因的表达发生变化。在硫酸铜溶液诱导后期，菌株抗重金属基因的表达量升高，并且菌株抗重金属基因的表达量与诱导时长相关，诱导时间越长，其表达量会出现较大的变化。
MRSA菌株携带mecA基因，编码PBP2a蛋白，赋予MRSA菌株广谱耐药性[4]。细菌的ermA/B/C基因表达红霉素核糖体甲基化酶，使细菌核糖体红霉素作用铅位点发生甲基化，从而导致红霉素耐药[35]。aac6′/aph2″为氨基糖苷类修饰酶基，赋予金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类药物的耐药性[36]。Hu等[28]研究了长期Cu污染对耐药发展影响时发现，Cu水平增加与耐药基因增加之间存在明显的联系。本试验测定了在1/4MIC硫酸铜溶液连续诱导后，MRSA菌株耐药基因mecA、norA、ermB、aac6′/aph2″的表达量变化。3株受试MRSA菌株在诱导至156 h时，耐药基因的表达量均出现显著上调(P < 0.05)，其中，编码青霉素结合蛋白PBP2a的耐药基因mecA表达量最高，其余基因表达量从高到低依次为norA(氟喹诺酮类)、aac6′/aph2″(氨基糖苷类)和ermB(大环内酯类)。说明硫酸铜溶液亚抑制剂量连续诱导对上述基因的表达起到促进作用。其中，对mecA基因的影响最大，对大环内酯类耐药基因的影响较小。所有基因的显著表达均在诱导后期，说明诱导时长与基因表达量之间也存在关联性，可推断诱导时间越长，菌株耐药基因的表达量随着诱导时间的延长会不断增高。
4 结论硫酸铜溶液亚抑制剂量连续诱导后，MRSA菌株对抗菌药物抗性增加，其耐药基因和抗重金属基因的表达增强，说明硫酸铜溶液诱导与MRSA菌株对抗菌药物抗性效应之间具有较强的协同效应。本文的研究结果警示了环境中的重金属离子或生产中使用的重金属离子会诱导细菌对抗菌药物的抗性增加。
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