, LUO Chuanzhen, LOU Jiangcheng, CHEN Mengyue, LIU Xiaoli, GU Changqin, ZHANG Wanpo, CHENG Guofu, LIU Bang, HU Xueying
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的接触性传染病，给我国养猪业造成了严重的经济损失。PRRS的主要临床症状表现为妊娠母猪流产、早产，呼吸困难，四肢发绀等[1-2]。本研究在探索HP-PRRSV致病机制过程中发现，感染HP-PRRSV的猪，除诱导典型的间质性肺炎外，还会引起肺大量微血栓形成。当心血管内膜受到损伤，血液中凝血系统和纤维蛋白溶解系统出现不平衡调节，会诱导微血栓形成。微血栓形成在一定条件下对机体有防御意义，能够应对血管破裂，起到止血的作用。严重时，则会引起组织器官缺血，甚至导致器官衰竭，造成生命危险[3]。
近年发现内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性与许多心血管疾病都有着重要联系[4]。eNOS是维持机体血管正常功能的关键因子，具有调解血管舒张、维持内皮功能和抗动脉粥样硬化的作用，控制着血管张力和血液凝固，对血栓形成有着重要影响[4-5]。当血管内皮功能异常时，会导致血管舒缩活动异常、血小板和凝血因子的异常激活，极大地增加了血液凝固性，进而导致相关心血管疾病的发生。因此eNOS对维持血管内皮正常生理功能有着重要的作用[3]。
由于目前关于HP-PRRSV对心血管系统的影响鲜有报道。本试验通过动物感染试验(感染品种鄂通两头乌猪[6])、HE染色、免疫组织化学、荧光定量以及Western blot技术，对HP-PRRSV、eNOS进行定位和定量，分析HP-PRRSV与微血栓严重程度的关系，了解eNOS的表达对微血栓的影响，为研究HP-PRRSV的致病机制提供新思路。
1 材料与方法 1.1 动物试验及样品采集从湖北省某猪场选取50头70日龄的鄂通两头乌猪，经武汉科前生物公司检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒和伪狂犬病毒及相应抗体，结果为全阴性。试验用病毒为HP-PRRSV WUH3, 由华中农业大学动物科技学院刘榜教授保存、馈赠。试验组(46头)按照3 mL·12 kg-1 (106PFU·mL-1)剂量肌内注射病毒悬液, 对照组(4头)不作处理。攻毒后7~14 d内采集猪肺组织样品，一部分样品-80 ℃冰箱保存，另一部分样品放入4%多聚甲醛固定。
1.2 HE染色、组织病理学观察取固定于4%多聚甲醛溶液的肺组织，经过常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，制作4 μm厚度的石蜡切片。应用全自动染色机(Autostainer XL)进行HE染色。通过光学显微镜(Nikon 80i)观察结果并详细记录。
1.3 微血栓病理学评分及实验动物分组根据HE染色结果，对微血栓病理学进行评分。通过观察病理切片全视野中微血栓面积大小，进行不同严重程度评分。共分为三个等级，轻度微血栓：面积0%~30%；中度微血栓：面积31%~60%；重度微血栓：面积61%~100%。实验动物则根据微血栓病变等级分为四组：正常对照组、感染HP-PRRSV轻度微血栓组、感染HP-PRRSV中度微血栓组、感染HP-PRRSV重度微血栓组，每组4头猪。
1.4 qPCR检测eNOS mRNA的表达Trizol法提取肺组织总RNA，应用微量紫外分光光度计A260 nm/A280 nm的标准检测RNA浓度及完整性。使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。以合成的cDNA为模板，进行目的基因的扩增及克隆，反应体系共10 μL，其中cDNA 1.0 μL、2×PCR mix 5 μL、上下游引物各0.2 μL，加水补足10 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。试验数据用2-ΔΔCt进行处理及分析。eNOS和β-actin基因特异性引物由上海生工生物工程有限公司合成(表 1)。
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表 1 基因引物序列 Table 1 Gene primer list |
提取肺组织总蛋白：称取100 mg肺组织，按比例加入含PMSF的RIPA裂解液，匀浆后充分裂解，低温高速离心20 min，吸取上清，通过BCA法测定蛋白浓度，分装后-80 ℃保存。使用5×蛋白上样缓冲液进行蛋白电泳，用湿转法转膜，脱脂奶封闭，4 ℃过夜孵育一抗eNOS(GB11086，赛维尔)和β-actin(20536-1-AP，CUSABIO)，洗膜后室温孵育二抗：HRP标记的羊抗兔IgG(AS014，ABclonal)。使用ECL化学发光盒曝光，凝胶成像系统扫描成像，Image J软件分析结果。
1.6 免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水，3%H2O2水溶液阻断过氧化氢酶，微波高温修复，5%山羊血清封闭非特异性。一抗(见表 2)低温孵育过夜，PBS振洗，滴加HRP标记羊抗鼠/兔二抗，配制DAB溶液显色，苏木精复染，进行常规脱水透明、封片。使用Leica Apero CS2切片扫描系统扫描免疫组化染色切片，使用Aperio ImageScope软件进行阳性率分析，具体方法见表 2。
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表 2 HP-PRRSV、eNOS免疫组织化学方法概括 Table 2 Summary of immunohistochemical methodology for HP-PRRSV and eNOS |
应用IBM SPSS Statistics 19软件与GraphPad Prism 6进行统计分析。所有检验均为T test双尾检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果 2.1 临床症状与病理变化 2.1.1 临床症状及大体病理变化鄂通两头乌猪感染第3天后持续出现高烧症状，体温＞40 ℃，精神状态萎靡，食欲明显减退，喜卧，反应迟钝，呼吸困难。第6天后个别猪出现神经症状，抽搐，肌肉震颤，皮肤发绀。正常对照组精神状态良好，食欲正常，维持正常体温38.5~39.5 ℃。
剖检后观察感染猪肺，出现严重的出血，呈暗红色，肺间质水肿、增宽，并有大面积的实变。正常对照组猪肺组织正常(图 1)。
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A.正常对照组猪肺；B.肺，感染猪，肺间质水肿并增宽，体积增大，被膜紧张；C.肺，感染猪，表面严重淤血，呈暗红色，肺实质呈“肉变”状 A. Normal lung, swine; B. Lung, infected swine, pulmonary interstitial edema and enlargement, increased volume with capsule tension; C. Lung, infected swine, severe congestion on the surface, dark red; The pulmonary parenchyma has a "meaty" appearance 图 1 感染猪和正常对照组猪肺的大体病理变化 Fig. 1 Major gross lesions in the lung of infected pigs and control pigs |
感染猪肺组织病理学变化与正常对照组相比，其肺泡间隔明显增宽，毛细血管淤血、出血，肺泡腔内有大量脱落的肺泡上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞。部分支气管周围有大量淋巴细胞围绕。肺泡腔内有渗出液，肺泡壁有大量微血栓。正常对照组，未见明显病理变化(图 2)。
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A.正常对照组肺，猪(100×)；B.肺，感染猪，轻微淤血，肺泡间隔明显增宽(100×)；C.肺，感染猪，肺泡腔内有大量的淋巴细胞及脱落的肺泡上皮细胞(200×)；D.肺，感染猪，肺泡腔内有少量均质淡染渗出液(200×)；E.肺，感染猪，支气管内有大量淋巴细胞、巨噬细胞和脱落的上皮细胞(100×)；F.肺，感染猪，支气管周围有大量的淋巴细胞围绕(100×)；G、H.肺，感染猪，肺泡壁内有大量微血栓(200×)；I.肺，感染猪，肺泡腔内有大量红细胞(200×) A. Normal lung, swine (100×); B. Lung, infected swine, slight congestion and significant enlarged alveolar septum (100×); C. Lung, infected swine, alveolar filled with a large number of lymphocytes and exfoliated alveolar epithelial cells (200×); D. Lung, infected swine, alveolar filled with homogeneous light stained exudate (200×); E. Lung, infected swine, large number of lymphocyte, macrophage and exfoliated epithelial cells in bronchus (100×); F. Lung, infected swine, a large number of lymphocytes surround the bronchi (100×); G, H. Lung, infected swine, a lot of microthrombus in alveolar wall (200×); I. Lung, infected swine, alveoli filled with a large number of red blood cell (200×) 图 2 感染猪和正常对照组猪肺的主要组织病理学变化(HE染色) Fig. 2 Major histopathological changes in infected pigs and control pigs(HE staining) |
通过对46头感染猪进行微血栓病理变化观察，根据微血栓病变评分标准进行评分，22头感染猪为轻度微血栓，14头感染猪为中度微血栓，10头感染猪为重度微血栓。通过将微血栓病变程度与死亡率进行分析，发现重度微血栓组死亡率高于其他两组(图 3)。
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图 3 HP-PRRSV感染猪的死亡率 Fig. 3 Mortality of HP-PRRSV infected pigs |
eNOS mRNA和蛋白在感染猪肺中表达量较正常对照组相比显著下调。通过对比轻度、中度、重度微血栓组之间eNOS的表达，三组之间的表达量无差异(图 4A、B)。
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A. mRNA (**.P < 0.01;***.P < 0.001)；B.蛋白(L1、L2.轻度微血栓组；L3、L4.中度微血栓组；L5、L6.重度微血栓组；L7、L8.正常对照组。*.P < 0.05;**.P < 0.01) A. mRNA (**.P < 0.01;***.P < 0.001); B. Protein (L1, L2. Mild thrombus; L3, L4. Moderate thrombus; L5, L6. Severe thrombus; L7, L8. Normal control.*.P < 0.05;**.P < 0.01) 图 4 eNOS在感染猪和正常对照猪肺中的mRNA、蛋白质水平表达差异比较 Fig. 4 Comparison of eNOS mRNA and protein level changes in infected pigs and control pigs |
利用免疫组织化学技术分析HP-PRRSV在肺中的分布规律发现，感染猪体内，HP-PRRSV主要分布于肺泡巨噬细胞、少量淋巴细胞的细胞质。轻度和中度微血栓组的阳性细胞数和染色较弱。重度微血栓组呈强阳性。正常对照组猪肺组织未见特异性阳性反应产物(图 5)。
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A.正常对照猪肺，未见特异性阳性反应产物(200×)；B~E.肺，感染猪，HP-PRRSV分布于肺泡巨噬细胞及少量淋巴细胞的细胞质，其中B~E图分别为轻度、中度、重度和重度微血栓(200×)；F. HP-PRRSV的阳性率与微血栓病变严重程度分析，随着病毒含量的升高，微血栓逐渐严重(*.P < 0.05;**.P < 0.01；***.P < 0.001) A. Normal lung, swine, no specific positive products were found (200×); B-E. Lung, infected swine, HP-PRRSV distributed in the cytoplasm of alveolar macrophages and a small number of lymphocytes. Among them, B, C and D-E are Mild thrombus, Moderate thrombus, Severe thrombus, and Severe thrombus (200×); F. Lung, infected swine, the positive rate of HP-PRRSV and the degree of thrombus were analyzed. With the increase of virus content, the thrombus lesion became more and more serious (*.P < 0.05; **.P < 0.01; ***.P < 0.001) 图 5 HP-PRRSV在感染猪和正常对照猪肺中的分布(IHC) Fig. 5 The distribution of HP-PRRSV in infected pigs and control pigs |
利用免疫组化技术分析eNOS在肺中的分布规律，eNOS主要分布于肺泡Ⅱ型细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及支气管平滑肌细胞的细胞质。与正常对照组相比，感染组阳性信号染色及数量显著低于正常对照组。通过对比轻度、中度、重度微血栓组之间eNOS的表达量，三组无差异性(图 6)。
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A.正常对照肺，猪，eNOS分布于Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞及血管内皮细胞的细胞质(200×)；B~E.肺，感染猪，阳信信号染色出现明显的减弱，阳性信号数量也减少, 其中B~E图分别为轻度、中度、重度和重度微血栓(200×); F. eNOS的阳性率与微血栓病变严重程度分析，随着微血栓病变不断的加重，微血栓轻、中、重组eNOS的表达无差异性(*.P < 0.05) A. Normal lung, swine, eNOS distributed in the cytoplasm of type Ⅱ alveolar epithelial cells, alveolar macrophages and vascular endothelial cells (200×); B-E. Lung, infected swine, the color and quantity of positive signal are obviously weakened; B-E are Mild thrombus, Moderate thrombus, Severe thrombus, and Severe thrombus (200×); F. Lung, infected swine, the positive rate of eNOS and the degree of thrombus were analyzed. With the aggravation of thrombus, there was no difference in the expression of eNOS (*.P < 0.05) 图 6 eNOS在感染猪和正常对照猪肺中的分布(IHC) Fig. 6 The distribution of eNOS in infected pigs and control pigs |
研究报道HP-PRRSV导致感染猪以间质性肺炎为特征，诱导呼吸困难并增加其他病原的感染[7-8]。本研究用HP-PRRSV WUH3毒株感染鄂通两头乌猪。肺组织病理学研究结果显示感染猪与正常对照组相比，其肺泡间隔明显增宽，毛细血管淤血、出血，肺泡腔内有大量脱落的肺泡上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞。部分支气管周围有大量淋巴细胞围绕，肺泡腔内有渗出液。这与Wagner等[2]观察的组织病理变化结果相同。本研究还观察到肺泡壁有大量微血栓形成，对微血栓病变严重程度与死亡率的分析，发现微血栓形成越严重，死亡率越高。当大量微血栓存在时，会引起相应内脏器官的局灶性坏死，甚至发生器官功能衰竭，肺内广泛的微血栓形成则会导致呼吸功能衰竭及右心衰竭[3]。
Krause等[9]研究发现HP-PRRSV分布在肺巨噬细胞及淋巴细胞的细胞质，与本研究结果一致，表明HP-PRRSV对肺泡巨噬细胞有亲嗜性。HP-PRRSV的表达在轻度、中度和重度微血栓组呈阶梯式增长，表明HP-PRRSV参与血管内皮损伤、血液状态改变等导致微血栓形成的过程，并有促进作用，增加感染猪死亡。
eNOS作为控制血管舒缩功能和维持心血管内稳态的分子之一，它的表达影响着心血管疾病的发生、发展[10-11]。eNOS下调表达可使血小板和白细胞聚集、黏附以及发生血管炎症[12]。小鼠单个耳部抗血栓的过程中eNOS呈高度表达[13]；eNOS表达失调导致胎盘血管内皮功能障碍[9]。本研究结果显示eNOS主要分布于肺泡Ⅱ型细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的细胞质，与Sood等[14]的研究结果一致。鄂通两头乌感染猪肺的eNOS mRNA和蛋白表达显著低于正常对照组，研究结果表明HP-PRRSV使感染猪肺组织eNOS的表达下调，参与感染猪肺组织微血栓的形成。
4 结论感染HP-PRRSV猪肺血栓病变严重程度与HP-PRRSV的病毒含量呈正比关系，微血栓病变越严重，死亡率越高。感染HP-PRRSV猪肺组织eNOS的表达下调，并参与微血栓形成。
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