2. 福建农业职业技术学院, 福州 350303
, LIU Xiaolong1, TAN Lining1, YE Shengcong1, QIU Lingshan1, CHEN Shengyong1, LIU Chuchu1, XU Lei2
2. Fujian Vocational College of Agriculture, Fuzhou 350303, China
塞内卡病毒A(Senecavirus A, SVA)属于小RNA病毒科猪塞内卡病毒属成员，最早发现于胚胎视网膜细胞(PER.c6)上[1]。SVA的寄主范围较窄，主要感染猪[2]，尤其是3~7周龄仔猪。该病毒侵染猪后可以产生多种症状，典型症状包括鼻镜、口腔和蹄部水泡或溃疡等，危害猪的正常生长，影响养殖场的经济效益。全球多个国家确诊了猪SVA疫情。近年来，传入我国多个省份，2018年对7个省份的36个屠宰场进行监测发现，调查的湖南、云南、新疆、辽宁、福建、湖北、广西7省(自治区)均有不同程度的SVA感染，个体样品阳性率为11.2%，场阳性率为48.6%，且监测的福建(100%)和湖北(80.0%)屠宰场阳性率均较高[3]。农业农村部多次强调中国动物卫生与流行病学中心要选择特征性的样品进行SVA检测，随时掌握SVA流行情况。SVA的研究和防控迫在眉睫，因此对SVA的基因组特性及其与其他毒株的同源性研究具有重要意义。然而，现有的福建地区SVA毒株的基因特征均来自于2017年分离的毒株，近年来未见相关报道。自2018年5月起，福建龙岩已全群免疫口蹄疫疫苗的养猪场发生不明原因的水泡性疾病，严重影响该养殖场的经济效益。本研究利用BHK-21细胞自发病猪中成功分离到了一株SVA，命名为FJLY株，并对该病毒进行了TCID50测定，发现其病毒含量高达109.0 TCID50·mL-1，并对其全基因组进行了序列测定与分析。
在疫苗的研制过程中，病毒的致病性决定该病毒能否作为检验用毒种，因此对SVA-FJLY株为疫苗的研制奠定基础并提供科学依据。然而，目前仅胡东波、赵晓亚分别对分离自河南和广东地区SVA进行了致病性分析，因此通过对分离自福建省龙岩市的SVA-FJLY株致病性分析具有重要意义。
针对SVA，其原型毒株SVV-001(GenBank：DQ641257.1)于2008年由Hales等[4]报道，SVA为无囊膜的单股正链RNA病毒，呈典型的二十面体对称，其基因组为7.2 kb的线性单链核糖核酸(RNA)。SVV的基因组包含一个独特的开放阅读框架(ORF)，SVV的ORF编码框由2 181个氨基酸组成的多聚蛋白前体。SVV多聚蛋白遵循标准的L-4-3-4微小核糖核酸病毒基因组的布局，结构蛋白编码区在基因组的5′端，非结构蛋白编码区在基因组3′端。病毒基因组由L和3个主要蛋白质区域组成，命名为多蛋白P1、P2和P3。P1分为VP1、VP3和VP0三个蛋白，VP0在其后组装的过程中会被水解为VP2和VP4。VP1、VP2和VP3分别为27、36和31 ku。P2区域分为2A、2B和2C。P3区包括3A、3B、3C和3D多肽。目前在NCBI数据库中，SVA完整的病毒全基因组序列也为数不多[5-9]。因此，很少有基于病毒基因组的研究。本研究通过RT-PCR扩增、测序、拼接，获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析，并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪，明确SVA的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系，了解SVA-FJLY株的致病性，为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据，同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。
1 材料与方法 1.1 病毒和试验动物SVA-FJLY株由派生特(福州)生物科技有限公司分离鉴定与保存，病毒含量高达109.0 TCID50·mL-1；试验动物为3~4周龄三元杂交仔猪，购自南平市禾翔丰畜牧发展有限公司，采用中和试验检测SVA抗体阴性[10-11]、采用荧光定量RT-PCR检测SVA抗原阴性[12]。
1.2 主要试剂RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；PCR mix购自Biosharp公司；DL2000 DNA Marker购自全式金生物技术有限公司；琼脂糖购自Oxoid公司；10×TAG购自索莱宝生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
1.3 引物参照原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列，用Primer 6.0软件设计覆盖SVA整个基因组(不包括Poly A尾)序列的5对引物，引物序列信息见表 1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 SVA-FJLY株全基因组扩增引物 Table 1 Amplifiled primers of SVA-FJLY genome |
取200 μL SVA-FJLY株细胞毒株作为样品，参照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，-80 ℃保存备用或立即反转录成cDNA。
1.5 RT-PCR根据常规RT-PCR反应体系将反转录所得的cDNA，再用5对引物分别进行PCR扩增SVA-FJLY株全基因组的各个片段。PCR扩增体系(25 μL)：2 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，PCR预混液12.5 μL，加DEPC水补足至25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54~57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
1.6 目的基因回收与测序按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的要求回收目的基因，取10 μL送生工生物工程(上海)股份有限公司用双脱氧法直接对胶回收产物进行测序，为了保证序列准确性，同时反向测定序列加以验证。应用DNAStar中的Megalin软件[版本号：7.1.0(44)]通过Clustal W方法对GenBank已发表的SVA全基因组序列和测序得到的序列进行同源性分析。
1.7 致病性试验将6头试验猪随机平均分成2组，一组通过滴鼻SVA-FJLY株10 mL·头-1(含109.0TCID50)，另一组作为空白对照组。攻毒后每天早晚观察记录试验猪临床表现和症状，连续观察10 d。
2 结果 2.1 目的基因扩增应用设计的特异引物扩增出5个片段，大小分别为1 574、1 700、1 741、1 643和1 328 bp，与预期的目的片段大小相符(图 1)。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；Mock.空白对照；A.扩增片段S1；B.扩增片段S2；C.扩增片段S3；D.扩增片段S4；E.扩增片段S5 M. DL2000 DNA marker; Mock. Blank control; A. Amplified fragment S1;B. Amplified fragment S2;C. Amplified fragment S3;D. Amplified fragment S4;E. Amplified fragment S5 图 1 SVA-FJLY株全基因组各个片段的扩增结果 Fig. 1 Amplification results of complete genomic fragments of SVA-FJLY strain |
按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的要求回收目的基因测序并利用DNAStar软件的Edit seq软件拼接组合成完整的基因组序列。SVA-FJLY株基因组全长7 275 bp (不包括PolyA)，GC含量为51.8%。SVA-FJLY株基因组存在单一开放阅读框架(第668—7 213位核苷酸)，编码2 182个氨基酸的多聚蛋白(polyprotein)。SVA-FJLY株基因组存在VP1蛋白和VP2蛋白，分别位于第2 453—3 436位核苷酸和1 118—1 969位核苷酸。
2.3 SVA-FJLY株与参考毒株相似性比较SVA-FJLY株与NCBI登录的参考毒株之间的基因组具有较高的相似性，核苷酸相似性为93.9%~98.5%，与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高，达98.5%；而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低，其核苷酸相似性93.9%。从图 2可知，SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支，与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近，同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。
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图 2 SVA-FJLY株全基因组序列遗传进化树 Fig. 2 SVA-FJLY strain complete sequence genetic evolution tree |
攻毒组在攻毒后第2天出现用鼻镜擦蹭猪栏的临床表现。攻毒后第4天鼻镜出现水泡，并于第6天出现水泡破溃(图 3)，之后再慢慢愈合。攻毒后第10天口腔内出现水泡(图 3)，10 d内尚未出现试验猪死亡，试验组2/3发病，对照组3/3正常。
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图 3 试验猪发病情况 Fig. 3 Incidence of the experimental pigs |
塞内卡病毒病是最近几年发现的、新的猪传染性病毒病[13]。塞内卡病毒病在短时间内造成世界范围内不同国家疫病的同时暴发，预示SVA毒病潜在巨大的危害性。2014年秋，巴西报道了SVA在新生仔猪中所致发病率和死亡率很高，特别是1~4日龄仔猪，病死率达30%~70%[14]。2014—2015年美国、巴西和中国均有病例报道[15-17]，并于2015—2016年期间，在美国、加拿大、中国、哥伦比亚和泰国等国呈现全球范围暴发的趋势[18-22]。近两年我国猪群中新发的SVA引发的水泡病不断出现，给我国的养猪行业带来了很大的危害，SVA的防控迫在眉睫。本研究对SVA-FJLY株全基因序列测定和遗传进化关系分析，获得了该病毒的全基因组序列、明确了SVA的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系。SVA-FJLY株与国内外的亲缘关系近，具有密切的相关性，与李秀博等[23]的研究结果相一致。
SVA基因组长约7.2 kb，包含一个独特的开放阅读框架(ORF)，含有一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。VP1蛋白和VP2蛋白是SVA最主要的两个结构蛋白之一，可能是病毒的主要保护性抗原蛋白，可诱导机体产生中和抗体，决定着病毒毒力及抗原变异，具有重要作用，种种原因之下，VP1蛋白和VP2蛋白可能成为SVA疫苗研究的主要抗原。VP1蛋白可诱导细胞发生凋亡[24]。另外，蛋白的糖基化位点的丧失，会引起病毒对动物的感染情况出现改变。因此，对SVA-FJLY株VP1蛋白和VP2蛋白特征分析，为SVA疫苗的研制和病毒的遗传进化研究奠定基础。同时，对SVA-FJLY株VP1蛋白和VP2蛋白的生物学特性有待进一步验证和深入分析。
SVA感染引起的水泡病与口蹄疫和猪水泡病等引起的病变非常相似，具体症状表现为病猪鼻吻部、蹄冠部出现水泡，同时病猪伴有厌食、跛行、发烧、嗜睡等症状[24]。新生仔猪感染SVA与成年猪不同，某些仔猪被报道患有腹泻(许多病毒均能引起临床症状)，而不引起鼻和蹄出现病变[25]。通过致病性试验，可以看出SVA-FJLY株对3~4周龄仔猪有较强的致病性，临床症状明显，可作为疫苗研制过程中的检验用强毒株。同时，也进一步揭示了SVA-FJLY株对我国养猪业有较大的威胁。
4 结论通过RT-PCR扩增、测序和拼接，获得了SVA-FJLY株全基因组序列，其全长7 275 bp (不包括PolyA)，存在VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性，与国内几个毒株属于同一个分支，与国内的HeB01-2017株相似性高、亲缘关系近，同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。SVA-FJLY株对3~4周龄仔猪有较强的致病性，是一株强毒株。
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