癌症是当今世界人类死亡的主要原因之一[1]。当前癌症治疗主要依赖于手术、化学疗法和放射疗法,但这些传统疗法具有很大的副作用,且预后效果较差[2]。在过去20年,尽管医疗水平不断提高,但是癌症患者的存活率并未发生明显变化,因此迫切需要能够有效补充这三种传统治疗手段的新方法[3]。溶瘤病毒疗法是一种具有巨大潜力的新方法,可以克服化学疗法和放射疗法的局限性,已成为传统癌症治疗的重要替代方法之一[4]。
溶瘤病毒是一类能够杀伤肿瘤细胞而对正常细胞不产生影响的病毒[5]。经过近一个世纪的发展,研究者发现了多种不同种类的溶瘤病毒,既有DNA病毒,也有RNA病毒[6-7]。溶瘤病毒相关的临床研究最早来源于20世纪初的病例报告,主要描述了在病毒感染或活病毒疫苗接种后病人的恶性肿瘤得到缓解的现象[8-10]。通过这些临床观察结果,研究者逐渐认识到病毒可以用来治疗癌症,并形成了一种治疗癌症的新方法“溶瘤病毒疗法”[11]。随着20世纪90年代基因工程技术的兴起,溶瘤病毒疗法的研究得到了蓬勃发展[12-13]。2005年,中国批准了第一个溶瘤病毒产品Oncorine,用来治疗晚期鼻咽癌[14];2015年,美国和欧盟先后批准上市了另一种溶瘤病毒产品T-VEC,用来治疗晚期或不可切除的黑色素瘤[15]。
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是一种天然溶瘤病毒,属于副黏病毒科,禽腮腺炎病毒属,基因组为不分节段的单股负链RNA,长度为15 000 nt左右,病毒粒子大小为200~300 nm[16]。该病毒感染禽类,并引发一种急性、高度接触性的烈性传染病——新城疫(Newcastle disease, ND),对养禽业危害巨大[17]。1965年,Cassel和Garrett[18]首次报道NDV具有抗肿瘤作用。与其他溶瘤病毒相比,NDV有以下优势:1)NDV是禽类病毒,只会在人体中引起一些轻度症状[19];2)人体很少存在NDV抗体[20];3)该病毒几乎不通过基因交换进行重组[21];4)作为一种RNA病毒,病毒复制过程中,其基因组不会同宿主基因组发生交互。因此,NDV溶瘤作用在其被报道后的五十余年里一直是领域内的研究热点。NDV的一系列溶瘤机制被发现并报道。
大量研究均发现,NDV在正常细胞中的复制水平远低于其在肿瘤细胞中的复制水平。然而,NDV的溶瘤作用是否完全取决于其在细胞内的复制水平尚不清楚。本研究选取了人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T,探究了NDV在不同细胞系的复制情况,对细胞的杀伤效果进行了比较,初步明确了NDV的复制和溶瘤作用关系,为NDV溶瘤机制的深入研究奠定了一定的基础。
1 材料与方法 1.1 材料NDV LaSota疫苗株由本实验室保存;人胚胎肾细胞(HEK293T)、人结肠癌细胞(HCT116)、人肺癌细胞(A549)购自美国ATCC生物标准品资源库;抗新城疫病毒血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)单克隆抗体由本实验室制备;Anti-β-actin抗体(Abcam);山羊抗小鼠红外二抗(SeraCare);AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen Biosciences);DH5α感受态细胞、pMD18-T载体、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit、One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit II(TaKaRa);碘化丙啶(Beyotime);PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I、流式细胞仪(BD);实时荧光定量PCR仪(Roche);倒置荧光显微镜(Thermo Fisher Scientific);近红外荧光扫描成像系统(GE)。
1.2 引物序列根据GenBank登录号为AY845400.2的序列作为LaSota的参考基因组,用Oligo7设计一对引物(表 1),用于RT-qPCR检测,由北京华大基因科技有限公司合成。
以提取的病毒基因组为模板扩增目的片段;将PCR产物进行核酸电泳,回收目的片段;将胶回收产物与pMD18-T载体连接,再将连接产物转化进DH5α感受态细胞,对测序鉴定正确的阳性克隆,进一步提取质粒;测定质粒浓度后,按照公式(6.02×1023 copies·mol-1)×质粒浓度(ng·μL-1)×10-9/(DNA长度×660 g·mol-1)=copies·μL-1换算为拷贝数,-20 ℃保存备用。
1.4 RT-qPCR采用SYBR法进行绝对定量。收集的细胞样品用试剂盒提取病毒基因组,用一步法荧光定量试剂盒进行qPCR,先配好混合体系。反应体系:10 μL 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer,0.8 μL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix,0.8 μL上游引物,0.8 μL下游引物,5.6 μL RNase Free dH2O,2 μL模板RNA。反应程序:42 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,共40个循环。
1.5 检测病毒基因组复制用感染复数(MOI)为1的NDV感染各细胞系,分别在感染后0、6、9、12、24、36 h收集细胞和细胞上清的混合样品,用试剂盒提取病毒基因组;然后用“1.4”所述SYBR法进行绝对定量,检测病毒基因组的复制情况。
1.6 检测病毒蛋白的表达水平用MOI为5的NDV感染各细胞系,分别在感染后12、24 h裂解细胞,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳,转印至硝酸纤维素膜,用5%脱脂乳室温封闭1 h,一抗(抗新城疫病毒血凝素神经氨酸酶蛋白单克隆抗体)4 ℃孵育过夜,PBST洗涤后加入山羊抗小鼠红外二抗,37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤后用近红外荧光扫描成像系统进行扫描成像。
1.7 显微镜观察将HEK293T、HCT116、A549三种细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中;待细胞生长至80%汇合度时,用MOI为5的NDV感染细胞,于含5%胎牛血清的DMEM培养基中继续培养36 h后,在倒置荧光显微镜下观察细胞形态。
1.8 细胞凋亡检测用MOI为5的NDV感染各细胞系,在感染后24 h检测细胞凋亡。将旧培养基吸出到对应15 mL离心管中,PBS洗涤细胞一次,用含EDTA的胰酶消化细胞,用新鲜培养基终止消化,收集细胞悬液到对应15 mL离心管;1 500 r·min-1离心5 min,弃掉上清,再用冷PBS洗涤两次;用1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞,将细胞浓度调整为0.25~ 1.0×106个·mL-1;从细胞悬液中吸取100 μL细胞重悬液转移到5 mL流式管中;加入5 μL PE Annexin V;再加入5 μL 7-AAD;轻轻涡旋细胞,室温避光孵育15 min,加入400 mL 1×Annexin V Binding Buffer,轻轻涡旋混匀;用300目滤膜过滤,在1 h内使用流式细胞仪进行检测。
1.9 细胞周期检测用MOI为5的NDV感染各细胞系,在感染后24 h收取细胞样品;用70%乙醇重悬细胞,-20 ℃过夜固定;用PI染色液进行染色,室温避光孵育30 min,再用流式细胞仪进行检测。
1.10 统计学处理采用Excel整理和分析数据,均值比较时采用t检验或单因素方差分析进行显著性检验,数据以“x±s”表示。差异显著性用“*”表示(*. 0.01 < P < 0.05,**. P < 0.01)。
2 结果 2.1 NDV在不同类型人细胞系中基因组复制水平的比较为了探究新城疫病毒在人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T的复制情况,用MOI为1的NDV感染各细胞系,分别在感染后0、6、9、12、24、36 h检测病毒基因组的拷贝数。结果表明,新城疫病毒在三个细胞系都能进行复制,虽然复制效率有差异,但在病毒复制后期(24、36 h),病毒基因组拷贝数都处于同一水平,没有显著差异(图 1)。
我们进一步探究了病毒HN蛋白在各细胞系的表达水平,用MOI为5的NDV感染各细胞系,分别在感染后12和24 h提取蛋白,用Western blot检测HN蛋白的表达水平。结果表明,NDV在各细胞系12或24 h的蛋白表达水平比较接近,但24 h的蛋白表达水平相较于12 h有所降低(图 2)。
虽然病毒的基因组复制水平在各细胞系没有差异,但在显微镜下可观察到病毒对各细胞系具有不同的杀伤效果。用MOI为5的NDV感染各细胞系,在感染后36 h,显微镜下观察。结果表明,HCT116和A549出现大量细胞死亡,HEK293T没有出现细胞死亡(图 3)。
为了探究NDV对这三种细胞系不同杀伤效果的机制,本研究进一步检测了细胞周期的变化。用MOI为5的NDV感染各细胞系,在感染后24 h检测细胞周期的变化情况。结果表明在感染NDV后,HEK293T和HCT116的细胞周期发生了G1期停滞,A549的细胞周期没有变化;且HCT116和A549发生了细胞死亡(图 4)。
为了探究各细胞系感染NDV后的细胞死亡变化,本研究进行了细胞凋亡的检测。用MOI为5的NDV感染各细胞系,在感染后24 h检测细胞凋亡情况。结果表明,NDV感染24 h后,在A549和HCT116均能检测到细胞凋亡,但A549的细胞死亡比例较高,且早期凋亡的比例比坏死/晚期凋亡高,而HCT116的细胞死亡发生比例略低,且坏死/晚期凋亡的细胞比例比早期凋亡多;HEK293T中没有检测到细胞凋亡的发生(图 5)。
溶瘤病毒疗法是一种结合基因工程技术和免疫疗法的新型生物疗法,在全世界得到了广泛研究[22]。NDV作为很有潜力的天然溶瘤病毒,其抗肿瘤活性研究也经历了很长的发展历程[23]。NDV作为一种禽类病毒,已在禽类体内进化出特异的病毒免疫逃逸机制,其编码的V蛋白能拮抗Ⅰ型干扰素信号通路的传导[24];但这种病毒逃逸机制具有物种特异性,在人肿瘤细胞中并不适用。对于NDV特异性杀伤肿瘤细胞的机制,先前的研究认为有以下几点:肿瘤细胞的抗病毒信号通路有缺陷,有研究表明,在肿瘤细胞内过表达RIG-Ⅰ能显著抑制NDV的复制[25];肿瘤细胞的Ⅰ型干扰素信号通路有缺陷,不能正常诱导Ⅰ型干扰素的生成[26];肿瘤细胞的细胞凋亡通路有缺陷,抗凋亡蛋白的高表达可能促进了NDV的复制[27]。
本研究选取了人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T,来探究NDV的复制水平与其杀伤作用的关系。在本研究中,首先检测了NDV在三个细胞系内的RNA复制水平,结果表明, 病毒基因组在三个细胞系中的复制水平相当;然后进一步检测了病毒HN蛋白表达水平,结果表明,在相同时间点,HN蛋白在三个细胞系的表达水平也比较接近,其中24 h的蛋白表达水平相较于12 h有所降低,我们认为是病毒粒子在此期间大量释放,HN蛋白作为病毒的结构蛋白,随病毒粒子一起释放出去,从而导致含量下降;当在显微镜下观察病毒的杀伤作用时,能明显看出NDV对这三个细胞系表现出不同的杀伤效果,NDV能对HCT116和A549发挥杀伤作用,但对HEK293T没有影响;以往研究普遍认为NDV在肿瘤细胞内的复制水平比正常细胞高1 000倍,因此推测这种复制水平的差异与其溶瘤作用相关[28-29];而本研究发现,NDV在人非肿瘤细胞系HEK293T中的复制水平与肿瘤细胞系A549和HCT116相当,但却有不同杀伤效果,这一结果表明NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平。在病毒感染后,HEK293T和HCT116的细胞周期出现G1期停滞,在A549中没有出现;而且细胞凋亡的结果表明,HCT116和A549的早期凋亡和晚期凋亡的比例也不相同,在HCT116中以晚期凋亡为主,A549以早期凋亡细胞为主,而晚期凋亡细胞主要是死亡细胞,这表明HCT116和A549引起细胞死亡的机制是不同的,A549以细胞凋亡为主,而HCT116以非凋亡方式为主。A549和HCT116是不同组织来源的肿瘤细胞系,分别是人肺癌细胞系和人结肠癌细胞系;癌症是一种异质性疾病,不同组织的癌症具有很大差异,但即便是在一个特定的肿瘤类型中,也存在基因组差异性[30]。而NDV在不同类型的肿瘤细胞系中存在不同的杀伤机制,正体现了这种异质性;这也提示我们在利用NDV开发溶瘤病毒疗法时,要注意不同肿瘤类型具有不同特点,进行有针对性的治疗。
4 结论通过对病毒在三个细胞系内的复制水平和杀伤效果的比较,确定了新城疫病毒的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且新城疫病毒对不同肿瘤细胞系的杀伤作用存在不同的机制,摸清了新城疫病毒与这三种细胞系相互作用的基本情况,为研究新城疫病毒的溶瘤机制建立了体外研究模型。
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