2. 西南野生动植物资源保护教育部重点实验室, 南充 637002
2. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation(China West Normal University), Ministry of Education, Nanchong 637002, China
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是世界生物多样性保护的旗舰物种，也是中国特有珍稀孑遗动物[1]。在漫长的进化过程中，大熊猫可采食高纤维的竹子并维持非常低的能量代谢而得以生存繁衍，这可能是在长期演化中大熊猫对其食性特化(专食竹子)的一种适应[2]。研究发现，大熊猫能够通过其肠道正常菌群降解纤维素[3-4]，而年龄、食性等因素可能引起大熊猫肠道中菌群的变化[5-6]，进一步影响大熊猫的营养健康状况，因而对不同年龄段大熊猫的菌群特征及其肠道消化生理特性的研究具有重大意义。对于哺乳动物肠道微生态菌群和其酶活等的研究已有报道，研究发现，雪豹、老虎等动物的肠道菌群组成结构与其年龄、食性等因素有关[7-8]，还发现芽胞杆菌[9-11]等细菌能提高动物肠道中淀粉酶、蛋白酶等消化酶活性，促进动物机体对营养物质的吸收利用。目前，对大熊猫肠道微生物的研究主要集中于肠道微生物组成差异与大熊猫食性的关系，但大熊猫肠道微生物菌群特征和其肠道酶活等环境因素对其肠道中物质消化影响的研究较少[12-13]。
本研究以不同年龄圈养大熊猫个体的粪便为研究对象，分析其肠道微生物多样性，并比较不同年龄大熊猫个体菌群组成，了解大熊猫肠道菌群和其年龄之间的联系；检测不同年龄大熊猫粪样的pH、酶活和还原糖含量等，探究大熊猫肠道微生物菌群与其肠道酶活力等环境因子之间的关系，能够为监测圈养大熊猫健康和饮食状况提供理论基础，同时可为提高圈养条件下大熊猫的饲养水平提供指导。
1 材料与方法 1.1 样本来源及采集在中国成都动物园分别采集3只圈养大熊猫的新鲜粪便，分组为J1(亚成年大熊猫个体)、J2(成年大熊猫个体)、J3(老年大熊猫个体)，年龄界定沿用胡锦矗[14]的界定标准。在早晨大熊猫排便后，立即使用无菌一次性手套，采集新鲜的整块粪便于无菌袋，并储存于冰盒，24 h内送回实验室，在无菌条件下，将粪便外部剥离，取中间粪便进行分装，一部分放置4 ℃保存，用于理化性质测定；一部分放置-80 ℃保存，用于微生物群落结构分析。
1.2 16S rRNA基因扩增、文库构建和测序样本采用Mobio Power Fecal DNA Isolation Kit试剂盒提取总DNA。选用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′)对16S rRNA V3-V4区进行PCR扩增，PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收，使用Qubit荧光定量系统对回收产物进行定量检测，然后将PCR产物等分子量混合，并构建高通量测序文库，最后在Illumina MiSeq(PE250)平台上机测序。
1.3 酶活力等理化指标检测称取适量粪便，分别加入样本重量10倍的生理盐水，用组织匀浆器匀浆后，用高速/冷冻离心机(Avanti JXN-30)在3 500 r·min-1转速下离心20 min后取上清液即为粗酶液。消化酶活力、氨基酸含量和还原糖含量的吸光度值均采用可见分光光度计(722S型)测定。采用3，5-二硝基水杨酸法[15]测定淀粉酶活力，以淀粉为底物，使用pH=5.6的柠檬酸缓冲液，3，5-二硝基水杨酸水溶液需配置好避光保存7 d后才能使用，淀粉酶活力单位定义为37 ℃条件下，每分钟催化分解淀粉产生还原糖的毫克数[mg·(g·min)-1]；采用福林-酚试剂法[15]测定蛋白酶活力，使用pH=7.5的磷酸缓冲液，以酪素为底物，蛋白酶活力定义为：在37 ℃条件下，每分钟催化分解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的量[μg·(g·min)-1]；采用3，5-二硝基水杨酸法[16]测定纤维素酶活力，使用pH=4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，以0.5%羧甲基纤维素钠为底物，纤维素酶活力单位定义：在46 ℃条件下，每分钟水解产生1 μg葡萄糖的毫克数[μg·(g·min)-1]；采用茚三酮比色法[17]测定氨基酸含量，使用pH=8.04的磷酸缓冲液；采用3，5-二硝基水杨酸比色法[18]测定还原性糖含量，使用pH=4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液。
1.4 数据的处理和分析使用QIIME软件计算各样本在门、纲、目、科、属5个分类水平上的组成和相对丰度分布表，绘图由Origin 8.5软件完成，利用Office 2010软件对数据进行统计，利用Canoco Software 5.0对大熊猫肠道菌群和理化性质进行冗余分析(RDA)。
2 结果 2.1 不同年龄大熊猫肠道菌群多样性及其分布 2.1.1 不同年龄大熊猫肠道中细菌的种类及相对丰度共获得244 897条细菌有效序列，按照已注释物种相对丰度作图(图 1)，在门分类水平上，如图 1A所示，试验样本中所有圈养大熊猫肠道中均以厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为主；从数据分析结果可见，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是大熊猫肠道中的优势微生物门类，它们的相对丰度均大于0.10%，占了总序列的93.80%。在属分类水平上，如图 1B所示，大熊猫主要以链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)为主。此外，随着年龄的增长，大熊猫个体肠道中各种细菌的相对丰度在不断变化，相对于J1，J2肠道中变形菌门、明串珠菌属的相对丰度升高，厚壁菌门和乳杆菌属的相对丰度降低，链球菌属相对丰度降低；相对于J2，J3肠道中变形菌门、乳杆菌属的相对丰度升高，链球菌属和明串珠菌属的相对丰度降低。上述结果初步表明，不同年龄阶段大熊猫个体肠道中的细菌种类和丰度都有区别。
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J1、J2、J3分别代表亚成年大熊猫个体、成年大熊猫个体、老年大熊猫个体。下同 J1、J2 and J3 represent the sub-adult giant panda, the adult giant panda and the old giant panda, respectively. The same as below 图 1 大熊猫粪便在门水平(A)和属水平(B)的细菌组成 Fig. 1 Bacterial composition in the feces of the giant pandas at the phylum level(A)and at the genus level(B) |
Shannon指数反映物种丰富度和均度，用于说明微生物群落分布的均匀度，其数值大小主要衡量非均衡分布状况；Chao-1指数则能够反映物种的多样性[19]。本试验中各大熊猫肠道内细菌的Chao-1指数和Shannon指数见图 2，其中大熊猫J2肠道细菌的Chao-1指数最高，均高于J1和J3，比J1高1.8倍，J1肠道细菌的Chao-1指数最低；J3肠道细菌的Shannon指数最高，为4.86，而J1和J2肠道细菌的Shannon指数低于J3，α-指数数据分析结果显示，大熊猫J2的微生物菌群多样性高于J1和J3。
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A. Chao-1指数；B. Shannon指数 A. Chao-1 index; B. Shannon index 图 2 大熊猫肠道菌群的α-指数 Fig. 2 α-index of fecal microbiota of the giant pandas |
本试验在大熊猫肠道中检测了淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶3种酶的酶活力，结果见图 3A。大熊猫肠道中淀粉酶活力高于蛋白酶和纤维素酶。淀粉酶活力在2.00~ 3.81 U·g-1范围内，J1、J2、J3的淀粉酶活力均有不同，淀粉酶活力大小顺序表现为成年>亚成年>老年；蛋白酶活力在0.36~0.46 U·g-1，大熊猫J1、J2、J3肠道中蛋白酶活力也不同，其大小顺序表现为亚成年>成年>老年；纤维素酶活力在0.16~0.34 U·g-1，大熊猫J1、J2、J3的肠道中蛋白酶活力也不同，其大小顺序显示为成年>老年>亚成年。结果初步表明，年龄对圈养大熊猫个体肠道中淀粉酶活力、蛋白酶活力和纤维素酶活力均有影响。
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A.酶活力；B. pH；C.还原糖含量；D.氨基酸含量 A. Enzyme activity; B. pH; C. Reducing sugar content; D. Amino acid content 图 3 大熊猫肠道中环境因子 Fig. 3 Environmental factors in the intestine of the giant pandas |
如图 3B，圈养大熊猫肠道的pH为6.12~7.08，不同年龄大熊猫个体的肠道pH不同。本试验还检测了不同年龄大熊猫个体的肠道还原糖含量和氨基酸含量，并发现大熊猫样本个体之间也不同，结果如图 3(C和D)所示，大熊猫J2肠道中的还原糖含量最高93.18 mg·g-1，J3肠道中的含量最低38.96 mg·g-1，J2肠道中的还原糖含量分别比J1和J3高了1.49倍和2.39倍。氨基酸含量在J1肠道中含量最高，达到2.24 mg·g-1，在J3肠道中含量最低，为1.13 mg·g-1，J1肠道中的氨基酸含量分别比J2和J3高了1.48倍和1.98倍。
2.3 大熊猫肠道优势菌群与其肠道环境因子的关系将大熊猫肠道优势菌群与其肠道消化酶等环境因子作RDA分析，结果如图 4所示，大熊猫肠道消化酶等环境因子位于第一、二、四象限，其中蛋白酶活力和氨基酸含量之间相关性较强，而纤维素酶活力和pH之间相关性较强。其次是大熊猫肠道优势菌群和各环境因子之间的相关性，其中厚壁菌门的相对丰度与淀粉酶活力呈显著正相关，与还原糖含量、蛋白酶活力和氨基酸含量之间均呈正相关，链球菌属与淀粉酶活力和蛋白酶活力也呈正相关；拟杆菌门的相对丰度与淀粉酶活力呈显著正相关，和还原糖含量呈正相关；放线菌门和梭菌属的相对丰度与纤维素酶活力和pH呈显著正相关，与蛋白酶活力和氨基酸含量呈负相关；变形菌门和乳杆菌属的相对丰度与淀粉酶活力、还原糖含量、蛋白酶活力和氨基酸含量均成负相关关系。明串珠菌属与纤维素酶活力和pH之间呈正相关。
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RS表示还原糖含量，TAA表示氨基酸含量，CA表示纤维素酶活力，AA表示淀粉酶活力，PA表示蛋白酶活力；黄色名称代表门水平菌群，黑色名称代表属水平菌群 RS indicates reducing sugar content, TAA indicates amino acid content, CA indicates cellulase activity, AA indicates amylase activity, PA indicates protease activity; The names in yellow color represent for the phylum horizontal flora and in black color represent for the genus horizontal flora 图 4 大熊猫肠道优势菌群与其肠道环境因子的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of the dominant fecal microbiota and intestinal environmental factors in the giant pandas |
一般哺乳动物(黑熊、老虎)肠道微生物中都以厚壁菌门和拟杆菌门为主[8, 20]，大熊猫以高纤维的竹子为主食，其肠道中也检测到大量厚壁菌门，且厚壁菌门占大熊猫肠道细菌总量的78%以上。厚壁菌门是动物肠道中主要的纤维素分解菌，能够降解纤维转化为挥发性脂肪酸供宿主使用，而高纤维饮食有利于厚壁菌门的积累[21-22]，大熊猫J1、J2肠道中厚壁菌门的相对丰度都高于J3，表明亚成年个体J1和成年个体J2对纤维素的分解能力较强，老年个体J3对纤维素的分解能力相对较弱。本研究中大熊猫肠道中变形菌门相对丰度表现出随着年龄的增加而升高的趋势，在J3肠道中的相对丰度也高于J1和J2，而变形菌门的增加反映了宿主能量不平衡和不稳定的微生物群落结构[23]，此外，动物粪便中肠杆菌科也多为条件致病菌，其在J3粪便中相对丰度也高于J2，所以相对于成年大熊猫J2，推测老年大熊猫J3因肠道结构紊乱而产生疾病的风险更高。
明串珠菌是一类异型发酵的乳酸菌[24-25]，其在J2肠道中的相对丰度高于J3。而肠杆菌科多为条件致病菌，J3中肠杆菌科某属高于J1和J2，结合图 1B细菌分类分析发现，随着年龄的增加，大熊猫肠道中明串珠菌、乳杆菌等有益菌的相对丰度在下降，而肠杆菌科某属、沙雷氏菌、不动杆菌等条件致病菌的相对丰度却在增加，表明老年大熊猫J3患肠道疾病的风险更高，所以在老年大熊猫的饲养过程中，可以适时适量添加益生菌，通过减少肠道潜在致病肠杆菌等的数量，促进肠道有益菌的增殖，进而预防或者减少其肠道疾病的发生[26-27]。宿主的年龄、饮食是影响肠道菌群多样性的重要原因[28]，大熊猫肠道微生物多样性结果表明，随着年龄的增加，大熊猫肠道菌群的Alpha多样性整体呈现先增加后下降的趋势，与王海瑞[13]研究结果基本一致，表明亚成年个体J1和老年个体J3肠道菌群的稳定性低于成年个体J2，亚成年和老年大熊猫应对条件变化的能力较弱，若环境条件发生改变，其肠道中抗定植能力较弱，潜在性病原体(包括条件致病菌)的定植和入侵风险升高。所以在饲养过程中可以添加适量益生菌以增加亚成年和老年大熊猫肠道菌群的多样性和稳定性，通过提高厚壁菌门比例和降低变形菌门的比例来促进大熊猫肠道的微生态平衡[26, 29]。
3.2 年龄对大熊猫肠道酶活力和理化性质的影响对不同年龄大熊猫肠道中酶活力分析表明，其肠道中蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力不同。研究表明，大熊猫自身缺少编码纤维素酶的基因[4]，所以大熊猫自身消化系统不能降解纤维素，而是通过其肠道菌群产生的纤维素酶降解纤维素，詹明晔等[30]研究发现，大熊猫的纤维素酶活性与年龄存在响应趋势，与本试验研究结果一致。分析原因可能是大熊猫肠道中纤维素降解菌的相对丰度受其年龄的影响[31]，例如大熊猫肠道中降解纤维素的菌群梭菌(Clostridum)，在J2肠道中相对丰度高于J1和J3，推测不同年龄大熊猫肠道中某物质降解菌不同，进而可能会导致其肠道中降解该物质的酶活力不同。不同年龄大熊猫个体肠道中蛋白酶和淀粉酶的酶活力也不同，崔永华[32]和郑玉才等[33]发现蛋白酶和淀粉酶等酶活性随着年龄变化而变化，与研究结果基本一致，成年个体J2肠道中淀粉酶和纤维素酶的酶活力高于亚成年个体J1和老年个体J3，显示出成年大熊猫可能对于淀粉类和纤维类食物具有较强的消化能力。
试验中大熊猫肠道的pH在不同年龄的样本之间有区别，成年个体J2高于亚成年个体J1和老年个体J3，分析这种差异可能是由于发酵微生物在不同年龄大熊猫肠道中相对丰度的差异所引起的，不同丰度的肠道微生物在发酵过程中会产生不等量的乳酸和短链脂肪酸等有机酸，使得肠道pH出现差异[27]，例如J2肠道中乳杆菌的相对丰度低于J1和J3。蛋白质、多糖等大分子物质在大熊猫的生长繁殖等生命活动中具有重要的作用[34]，试验结果表明，年龄对大熊猫个体肠道中还原性糖含量和氨基酸含量都有影响，但年龄对大熊猫个体肠道中氨基酸含量和还原性糖含量的影响规律表现不同，而肠道环境是复杂，其影响规律还需要进一步的研究和分析。
3.3 大熊猫肠道优势菌群和其肠道中消化酶等环境因子的关系分析大熊猫肠道优势菌与其肠道消化酶等环境因子的RDA分析结果显示(图 4)，大熊猫肠道中消化酶活力和理化性质对于大熊猫肠道中各种优势菌的相对丰度有不同程度的响应，且这种响应关系比较复杂，这可能与大熊猫肠道菌群和其肠道环境因子及其相互作用有关。图 4表明厚壁菌门的相对丰度和拟杆菌门的相对丰度都与淀粉酶活力和还原糖含量的正相关性较强，推测这两种优势菌群对大熊猫肠道中淀粉类物质的降解可能有协同作用，可以将淀粉等食物通过淀粉酶降解成还原糖供宿主利用[35]。同时，厚壁菌门的相对丰度与蛋白酶活力和氨基酸含量也存在相关性，结合年龄对酶活力的分析结果(图 3A)，表明对于不同年龄阶段的大熊猫，其肠道中丰度较高的淀粉降解菌和蛋白降解菌可能会促进淀粉酶活力和蛋白酶活力的提高，具体关系需要进一步探讨。此外，厚壁菌门的相对丰度与还原糖含量和氨基酸含量正相关性较强，而变形菌门的相对丰度与还原糖含量和氨基酸含量负相关性较强，推测厚壁菌门菌群有利于还原糖和氨基酸的积累，而变形菌门菌群可能会抑制还原糖和氨基酸的积累，进而表现出J3肠道中还原糖和氨基酸的含量均低于比J1和J2，而厚壁菌门的梭菌属与纤维素酶活力、厚壁菌门的链球菌属与淀粉酶和蛋白酶活力的正相关关系，推测高丰度的厚壁菌门菌群通过促进降解菌的酶活力使还原糖等营养物质实现积累。Shin等[23]研究发现，变形菌门在哺乳动物体内作为一个不稳定的因素会增加宿主患病的风险，所以变形菌门可能是通过抑制宿主对还原糖和氨基酸等营养物质的分解和利用使宿主患病率升高，致病菌沙雷氏菌属和变形菌门呈相同趋势(图 4)。
4 结论不同年龄的大熊猫个体肠道细菌菌群结构和多样性都表现不同，其肠道细菌菌群的相对丰度和酶活等环境因子存在相关性；在成年大熊猫J2肠道中，链球菌和明串珠菌最多，表现出对纤维素类食物具有较好的消化能力；在亚成年大熊猫J1肠道中，链球菌和乳杆菌较多，对纤维类食物的消化能力较弱，应对环境变化的能力较低，应该加强饮食和环境的管理；老年大熊猫J3对纤维素的利用率较低，有益菌相对丰度较低，而条件致病菌相对丰度增加，可以通过添加益生菌等方式加强对老年大熊猫肠道健康的管理。
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