, XIONG Xin, DUAN Linwei, LI Zhipeng, FU Penghui, XU Yixue, SHI Deshun, LIU Qingyou, CUI Kuiqing
体外胚胎生产和胚胎移植技术是优良家畜快速繁育的重要手段，也是动物克隆、基因编辑和转基因等研究的基础。体外胚胎的质量是影响胚胎移植后妊娠结局最重要的因素之一，目前，主要依据形态学评分对体外胚胎质量进行评估，如总细胞数，内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)细胞数量，ICM/TE细胞数量比，凋亡指数等被发现是胚泡的质量指数[1]，这些方法在本质上是侵入性的，会导致胚胎的死亡而无法应用于胚胎移植。无论人类辅助生殖还是家畜体外胚胎生产均亟待寻找一种无创且不影响胚胎发育的方法来筛选优质胚胎，而通过观察胚胎第一次分裂时间对胚胎质量进行评估是简单而有效的方法之一。Wharf等[2]对人体外受精胚胎(in vitro fertilization, IVF)早期卵裂(early cleavage, EC)与妊娠结局的关系进行了系统的研究，发现EC是早期胚胎植入潜能的有利指标之一。随后，贾楠等[3]研究证实了早期卵裂的胚胎具有更高的植入潜能。Santos-Ribeiro等[4]研究指出，EC是胚胎质量的有力指标，可用作选择胚胎进行移植以提高妊娠率和降低多胎妊娠率的额外标准。You等[5]通过进一步研究发现，EC还是妊娠结局强有力的预测指标，可用于移植前对胚胎的选择和评估。李超强等[6]报道，对胚胎早期卵裂的观察有助于预测胚胎发育潜能，而早期卵裂细胞数为2，且评分≤2级的胚胎发育潜能最高。李萍和陈媛媛[7]进一步提出，胚胎第一次卵裂时间与胚胎形态学评分相结合可以更好的评定胚胎的发育潜能，提高临床妊娠率。Mizobe等[8]研究显示，卵母细胞第一次分裂时间是胚泡形成速率的有用评估，其能够在培养的早期阶段选择存活的胚胎。同时，他还提出在培养后25.90 h内完成第一次分裂，37.88 h内完成第二次分裂的囊胚移植后妊娠率较高。研究者已经对胚胎分裂动力学进行了详细分析，特别是在人类胚胎中的应用和研究，最关注的是早期分裂表型[9-10]。Martínez等[11]研究指出，细胞分裂时间、细胞周期间隔和细胞周期的同步性是人类胚胎质量的标志，并可以影响猫植入前胚胎的体外发育潜力[12]。
目前，针对体外胚胎早期卵裂与发育潜能关系的研究主要集中在人和小鼠上，仅有Isom等[13]对猪体外早期分裂胚胎与发育潜能的关系进行了研究，并发现早期分裂胚胎的发育潜能与母源基因的降解相关。猪孤雌激活胚胎第一次分裂时间及其囊胚率和囊胚质量关系尚不清楚。因此，本研究针对猪孤雌激活胚胎，通过对其第一次分裂时间及其囊胚率和囊胚质量进行统计分析，对猪孤雌激活胚胎早期卵裂与胚胎发育潜能的关系进行研究。此外，本研究还通过检测早期卵裂胚胎全能性转录因子Oct4，多能基因Nanog、Sox2和Klf4，凋亡基因Bax和Caspase-3、Bcl-xl的表达变化，对早期卵裂胚胎具有高发育潜力的分子机制进行了初步研究。本研究旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响，及通过观察初次卵裂时间对猪体外生产胚胎进行早期筛选的可行性。
1 材料与方法 1.1 试验材料猪卵巢来源于南宁市五丰肉联公司屠宰场，抽取卵母细胞进行体外成熟培养，选择猪孤雌激活胚胎。
1.2 试验设计与分组猪孤雌激活胚胎从16~48 h分11个时间段，即0~16、16~18、18~20、20~22、22~24、24~26、26~28、28~30、30~32、32~42、42~48 h。对不同时间的卵裂率和不同卵裂时间的囊胚率进行统计分析得出胚胎较早初次卵裂，其发育成囊胚的几率较高，而较晚发生初次卵裂的胚胎其发育能力较低，甚至无法发育成囊胚。以此为据，将孤雌激活胚胎分为早期卵裂组(16~22 h)与晚期卵裂组(26~32 h)，试验4个重复，统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。
1.3 主要试剂除特殊说明外，本试验所使用的试剂均采购于美国Sigma公司。TCM-199和FBS购自GIBCO公司；细胞裂解液购自Thermo公司；琼脂糖购自Biowest公司；微量反转试剂DNaseⅠ、EDTA、Random Primer、dNTP、First·bStand·Buffer、DTT(二硫苏糖醇)、RNase Inhibitor RRI和SSⅡ购自TaKaRa公司；氨苄青霉素钠与卡那霉素钠购自于Solarbio公司；Trizol Reagent购自Invitrogen公司；定量试剂FastStart Universal SYBR Green Master购自Roche公司；其他常规分子试验操作相关的试剂均为国产分析纯；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.4 主要仪器与设备显微镜(日本NIKON公司)；显微操作仪(Eppendorf公司)；电融合仪(美国ECM2001-BTX)；电激活槽(美国BTXCO)；三气CO2细胞培养箱(Thermo Forma公司)；7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)；Gel Doc TM XR+水平电泳仪及电泳槽(美国BIO-RAD公司)；涡旋振荡仪SCILOGEX MX-S(BioSpec-nano公司)；Centrifuge 5810R超速低温离心机，小型离心机Centrifuge5418(Eppendorf公司)。
1.5 主要溶液配制洗卵液(CCM)：9.5 g TCM199 + 0.9 g NaCl + 1.2 g Hepes + 0.06 g青霉素+ 0.1 g链霉素+20 mL FBS + 0.4 g NaHCO3；成熟液：PMH：TCM199基础液+ 10%猪卵泡液+ 0.6 mmol·L-1半胱氨酸+ 50 ng·mL-1 EGF + 10 ng·mL-1 IGF-1+ 15 IU·mL-1 eCG和15 IU·mL-1 hCG；PM：TCM199基础液+ 10%猪卵泡液+0.6 mmol·L-1半胱氨酸+ 50 ng·mL-1EGF+10 ng·mL-1 IGF-1；电激活液：0.3 mmol·L-1Manmtol+0.1 mmol·L-1CaCl2+0.1 mmol·L-1MgSO4+5.0 mmol·L-1 Hepes+0.01% PVA；胚胎培养液(PZM-3)：108 mmol·L-1 NaCl+10 mmol·L-1 KCl+ 0.35 mmol·L-1 K H2PO4 +0.4 mmol·L-1 MgSO4+ 25.07 mmol·L-1 NaHCO3+5.0 mmol·L-1亚牛磺酸+2.0 mmol·L-1乳酸钙+1.0 mmol·L-1谷氨酸盐+0.06 g·L-1链霉素+20 mL BME+10 mL MEM+3.0 mmol·L-1BSA-FAF+0.06 g·L-1青霉素+0.2 mmol·L-1丙酮酸钠。
1.6 猪卵母细胞的收集与成熟从屠宰场收集猪卵巢，用37~38 ℃生理盐水清洗3遍后，置于39 ℃恒温水浴锅内。用带有12号针头的10 mL注射器吸取直径3~6 mm卵泡内的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)，置于CCM液中，在体视显微镜下，挑选出二级以上COCs，放入150 μL PMH微滴内，放入39 ℃，5% CO2和100%湿度的培养箱培养；22 h后，换到平衡好的150 μL PM微滴内继续培养22 h。
1.7 猪卵母细胞的激活与培养孤雌激活是研究胚胎体外发育的常用技术，猪的体外受精胚胎发育效率较低，孤雌激活是研究猪卵母细胞成熟和植入前胚胎发育机理的重要模型。将成熟的卵母细胞用0.1%透明质酸酶吹打掉颗粒细胞，挑取排出第一极体且胞质均匀细胞形态完整的置于CCM中备用。电融合仪预热10~20 min，用电融合液将激活槽和卵母细胞润洗3遍；将细胞呈直线排列放入激活槽中，激活参数为50 V，80 μs，3次，30 s，之后将卵母细胞吸出，放入35 μL PZM-3液滴中，置于培养箱中培养。
1.8 不同时间卵裂胚胎、早期卵裂和晚期卵裂胚胎分离培养及囊胚数量统计提前制作PZM-3培养盘，分8个区，每个区3滴PZM-3，35 μL·滴-1，覆盖上胚胎成熟培养油，放培养箱内平衡。在培养后的16~48 h期间，分11个组。然后将试验分为2组，即早期卵裂胚胎组(16~22 h)和晚期卵裂胚胎组(26~32 h)；分别按两次分组把二分裂胚胎分离出来，放置于新的PZM-3培养盘中培养7 d，对分裂数和囊胚数量及分裂率和囊胚率进行收集、分析。
1.9 微量反转提取RNA囊胚用PBS洗3遍，转移到细胞裂解液管中；将样品放入PCR仪，RNase 75 ℃灭活15 min；加入1 μL DNaseⅠ + 1.3 μL DNaseⅠ Buffer，37 ℃ 30 min；加入1 μL EDTA + 2 μL Random Primer + 1 μL dNTP，65 ℃ 15 min；加入4 μL 5×First·Stand·Buffer + 2 μL DTT(二硫苏糖醇)+ 0.5 μL RNase Inhibitor RRI，42 ℃ 90 min；最后加入0.25 μL Fast酶SSⅡ，25 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min。
1.10 实时荧光定量PCR参照GenBank已知的猪Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、Bcl-xl、Bax、Caspase-3以及18S-RNA的完整基因序列，利用Oligo7.0软件设计引物，引物序列见表 1。按10 μL体系加入各试剂到PCR管中，程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环；采用2-△△CT方法计算基因的表达情况；对所得数据用GraphPad Prism 6作图，用SPSS Statistics软件进行统计学分析。
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表 1 实时荧光定量引物 Table 1 Primers for qRT-PCR |
本研究所有数据均使用SPSS 20软件进行统计学分析，分析方法为Student’s t test和One-way ANOVA，结果用“平均值(±标准误)”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 猪孤雌胚胎不同时间的卵裂率和不同卵裂时间的囊胚率将猪孤雌激活胚胎从16~48 h分11个时间段。对不同时间的卵裂率和不同卵裂时间的囊胚率进行统计，结果显示，在16~22 h之间卵裂的胚胎数量占卵裂胚胎总数的50%~60%，而在26 h之后胚胎发生分裂的细胞数量显著降低，占细胞总数不到20%(图 1A)。通过对不同分裂时间胚胎的发育能力进行分析，结果显示，胚胎较早初次卵裂，其发育成囊胚的几率较高，而较晚发生初次卵裂的胚胎其发育能力较低，甚至无法发育成囊胚(图 1B)。在18 h完成第一次分裂胚胎的囊胚率更是达到了79%，超过42 h才发生初次卵裂的胚胎通常不能发育到囊胚期，猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组(P < 0.05)。本研究后续试验以此为基础将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂胚胎组(16~22 h)与晚期卵裂胚胎组(26~32 h)进行研究。
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A.猪孤雌胚胎不同时间卵裂率；B.猪孤雌胚胎不同卵裂时间的囊胚率。不同字母表示差异显著(P < 0.05) A. The cleavage rate of porcine parthenogenetic embryo at different time; B. Blastocyst rate of porcine parthenogenetic embryos at different cleavage time. The different letters indicate significant difference(P < 0.05) 图 1 猪孤雌胚胎不同时间卵裂率及不同卵裂时间的囊胚率 Fig. 1 The cleavage rate of porcine parthenogenetic embryo at different time and blastocyst rate of porcine at different cleavage time |
在同一批细胞中，16~22 h组的胚胎总数要多于26~32 h组，早期卵裂组的囊胚发育率((47.9±5.7)%)显著高于晚期卵裂组((15.5±0.6)%)(P < 0.05，表 2)。
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表 2 猪早、晚期卵裂孤雌胚胎的发育效率 Table 2 Development efficiency of early and late cleavage of porcine parthenogenetic embryos |
将不同组获得的囊胚分别按初级囊胚、初期囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚4个等级，对早晚期卵裂胚胎的发育潜能及其发育成囊胚的质量进行分析(表 3)。结果显示，16~22 h组的各级囊胚数均显著多于26~32 h组(P < 0.01)，且早期卵裂胚胎组各级囊胚的囊胚率均显著高于晚期卵裂胚胎组(P < 0.01)。值得注意的是，26~32 h组没有胚胎可以发育到孵化囊胚。因此，早期卵裂胚胎发育潜力显著高于晚期卵裂的胚胎。
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表 3 猪早、晚期卵裂胚胎不同等级囊胚率 Table 3 Different blastocyst rates of early and late cleavage embryos of porcine |
两组分别按照初级囊胚、初期囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚的等级通过Hoechst染色进行囊胚细胞计数统计(图 2)。结果显示，早期卵裂胚胎(16~22 h)发育而得的各级囊胚的细胞数均显著高于晚期卵裂胚胎(26~32 h, P < 0.05)。同时，组内的不同等级囊胚细胞数量也有较大的差异性，其中初级囊胚的细胞数量明显少于其他等级囊胚细胞数，扩张囊胚的细胞数要明显高于其他等级，即扩张囊胚的质量、发育状态均要明显高于初级囊胚以及初期囊胚(表 4)。因此，早期卵裂胚胎具有更高的发育潜力，可以得到更多的优质囊胚。
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A、A′.初级囊胚；B、B′初期囊胚；C、C′扩张囊胚；D、D′孵化囊胚 A, A′. Primary blastocyst; B, B′. Initial blastocyst; C, C′. Expanded blastocyst; D, D′. Hatched blastocyst 图 2 不同等级的囊胚形态特征(A、B、C、D)及Hoechst荧光染色(A′、B′、C′、D′) Fig. 2 Morphological characteristics of blastocysts at different levels(A, B, C, D)and Hoechst fluorescent staining(A′, B′, C′, D′) |
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表 4 早、晚期卵裂胚胎囊胚细胞数 Table 4 Number of blastocyst cells in early and late cleavage embryos |
分别收集2组发育的囊胚，并对多能性基因Oct4、Nanog、Sox2、Klf4的相对表达水平进行分析。结果显示(图 3)，Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因在16~22 h组的表达量显著高于26~32 h组(P < 0.05)，其中早分裂组胚胎的Oct4、Sox2和Klf4基因的相对表达量极显著高于晚分裂组(P < 0.01)。
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*. P < 0.05;**. P < 0.01, the same as below 图 3 早、晚期卵裂胚胎多能性基因相对表达量 Fig. 3 Relative expression level of pluripotency-related genes in early and late cleavage embryos |
分别收集2组发育的囊胚，并对细胞凋亡基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析。结果显示(图 4)，Bax和Caspase-3基因在早期卵裂胚胎(16~22 h)的表达极显著低于晚期卵裂胚胎(26~32 h，P < 0.01)，而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎有显著上调(P < 0.05)。
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图 4 早、晚期卵裂胚胎凋亡基因相对表达量 Fig. 4 Relative expression level of apoptosis-related genes in early and late cleavage embryos |
胚胎的质量与其发育潜能之间的关系一直都是广大研究工作者所探究的热点。目前，主要依据形态学评分(包括卵裂率、胚胎形态、细胞总数和内细胞团细胞数等)对体外胚胎的发育潜能进行评估。尽管这些技术性指标可以在一定程度上反映胚胎的质量，但是其检测方法多是侵入性的，检测后的胚胎无法进一步应用于动物的生产。本研究通过分析胚胎第一次分裂时间与胚胎发育潜能之间的关系，发现早期分裂的胚胎显著具有更高的囊胚率，且其囊胚质量也显著优于晚分裂的胚胎。进一步研究发现，Oct4、Nanog、Sox2、Klf4等多能基因在早分裂胚胎的表达量显著或极显著高于晚分裂的胚胎。同时，凋亡相关基因Bax和Caspase-3在早分裂胚胎的表达量显著低于晚分裂的胚胎，而Bcl-xl基因作为凋亡保护因子其表达量在早期分裂胚胎表达量更高。
研究表明，人和牛的卵母细胞在受精后早期发生初次卵裂的胚胎比晚期卵裂的胚胎更容易发育到囊胚阶段[14-15]。Brevini等[16]从mRNA丰度的角度研究了初次卵裂时间对牛胚胎质量以及后期发育的影响，发现初次卵裂时间是继形态学标准之后的又一个能够衡量胚胎发育潜能的重要指标。进一步研究表明, 大多数的囊胚均由早期卵裂胚胎发育而成[17]。随后，研究者对胚胎的早期卵裂时间与胚胎发育潜能的关系进行了广泛的研究，但在猪胚胎上研究较少。本研究首次对不同分裂时间的猪孤雌激活胚胎的发育能力进行了研究，并发现初次卵裂的时间对胚胎发育具有显著的影响，且早期卵裂胚胎(early cleavage embryo，ECE)的发育能力显著高于晚期卵裂胚胎(late cleavage embryo，LCE)，与上述研究结论相符[18-19]。
此外，本研究还发现，早期分裂胚胎发育得到的囊胚质量(囊胚细胞数)也显著高于晚期分裂胚胎。Vandaele等[20]比较了具有不同体内受精能力公牛的生育率与胚胎的凋亡细胞比率(ACR)，在体内和体外公牛的受精率之间仅发现非常低的负相关性，而从具有低生育率或正常生育率的父源中得到的各组之间的ACR没有差异(P＞0.05)。随后Pers-Kamczyc等[21]证明，早期胚胎畸变发生率显著降低，证实了首次合子裂解(FZC)作为胚胎质量标志物的有效性。Park等[22]用延时监测提供了关于个体胚胎发育动力学的新数据，早期分裂(≤20 h)正常形态的胚胎有助于预测牛移植胚胎选择的发育潜力。因此，越早进行初次卵裂的胚胎，其发育到囊胚的可能性越大，并且所得到的囊胚形态好，状态佳。Oct4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的重要转录因子之一，Nanog、Sox2、Klf4是重要的外胚层标志基因。赵天等[23]在牦牛卵母细胞研究中提出，Oct4在9-~16-细胞胚胎时期可能参与胚胎合子型基因转录激活的调控过程, 在囊胚时期可能参与维持内细胞团全能性的过程。此外，有研究表明，Oct4具有支持小鼠囊胚原始内胚层分化的活性。因此，胚胎多能基因的表达模式通常可以作为胚胎发育能力的指征[24]。郭诗萌[25]发现，在猪早期胚胎发育过程中, OCT4蛋白在猪囊胚的几乎所有细胞中均表达，Nanog蛋白在4-细胞胚胎细胞核中开始表达, 随后表达量下降, 仅在8-细胞胚胎的部分细胞中表达, 然而在早期囊胚和中期囊胚中基本检测不到Nanog蛋白表达。培养体系中添加FBS, 将胚胎培养至第8天, 发现在2-、4-、8-细胞胚胎和桑椹胚细胞质中存在Nanog mRNA表达。张艳艳等[26]研究证明，滋养外胚层的分化对哺乳动物早期胚胎发育至关重要。若关键基因Tead4、Cdx2和Eomes敲除或突变将导致滋养外胚层细胞分化错误, 而其完整性、渗透性和液体转运功能受损也将导致囊胚形成失败。本研究通过对早、晚期卵裂胚胎多能基因的表达进行定量分析，发现Oct4、Nanog、Sox2、Klf4在早期分裂胚胎中的表达量均显著高于晚期分裂胚胎，说明早期分裂胚胎具有更高的发育潜力。凋亡基因中有Caspase和Bcl两大基因家族，Caspase-3是具有促细胞凋亡作用的基因[20, 25]，Bcl-xl是对细胞凋亡有保护作用的基因，Bax为细胞凋亡的正调节因子，对细胞凋亡具有促进作用[21, 27-28]。
相对于晚分裂胚胎，早分裂胚胎具有更高的囊胚率和更好的囊胚质量这一现象已经在其他物种进行了系统的研究[29-31]。大量的研究表明，人胚胎的分裂时间与胚胎发育潜能及妊娠结局显著相关[32-33]。此外，牛和水牛的早期分裂胚胎同样具有更高的囊胚率，且胚胎移植后具有更高的妊娠率[34-37]。因此，胚胎的早期卵裂可能是胚胎发育潜力的一个有用的标记，也是选择优质胚胎进行移植或冷冻的一个额外标准。本研究对不同分裂时间猪孤雌激活胚胎的发育能力进行了系统的统计和分析，并发现初次卵裂时间对胚胎的发育具有显著的影响，且早期卵裂胚胎的发育能力显著高于晚期卵裂胚胎，与上述研究结论相符。
近年来，人们已经对胚胎发育的分子机制进行了广泛的研究，然而针对早期分裂胚胎不仅能够更快发育，而且能获得更好质量胚胎的确切机制尚不清楚。人们已经提出了几个可能的原因，其中之一是，早分裂胚胎拥有进一步发育所需的所有必要基因产物和蛋白质，而在晚分裂胚胎中缺乏这些基因产物和蛋白质，因此，更可能发育停滞或凋亡[38]。Vandaele等[38]提出假设，早期分裂的胚胎可能具有更好的细胞防御氧化应激的能力，并发现IDH和RAD50的高表达均参与了胚胎的应激保护。组蛋白2A、3A、YEAF、组织蛋白酶B、伴侣氨酸TCP1等参与基因组调控和转录、蛋白转化、细胞代谢、细胞凋亡、细胞骨架形成等的基因在早分裂胚胎中的表达水平高于晚分裂胚胎[39-41]。本研究发现，早分裂胚胎中多能基因的表达量显著高于晚分裂胚胎，说明早分裂胚胎具有更高发育潜能可能与多能基因的高表达有关，而晚分裂胚胎的发育障碍可能是由多能基因表达不够引起的，与上述第一种假设相符。同时，本研究还发现，早期卵裂胚胎的囊胚中抑制细胞凋亡的基因相对表达量较高，有效的延缓了胚胎凋亡，而晚期卵裂胚胎中凋亡基因的相对表达量较高，使胚胎发育能力降低。该结果与上述细胞凋亡相关基因在早分裂胚胎中的表达水平高于晚分裂胚胎的结果相符。
4 结论初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于晚期卵裂组，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数，本研究为猪体外生产胚胎的早期筛选提供了理论基础。
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