2. 畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室, 成都 611130
2. Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 611130, China
CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9))是从细菌和古菌中发展而来的一种抵抗外来生物的免疫机制，可以从入侵生物体中获取一段特异性序列，然后将其转录成CRISPR RNA(crRNA)，引导Cas蛋白干扰入侵DNA的表达[1]。CRISPR/Cas9系统因其独特的特点被广泛的发展应用，它是继一代锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)、二代类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技术之后的一种强大的基因编辑技术[2]。经过近30年的发展，它已成为研究生物科学及基因治疗等领域的热门工具。人们运用该技术已在家畜绵羊和模式动物小鼠中取得了突破性进展。在小鼠中获得了GDF5下游调控因子GROW1的敲除系，并解析了该因子的调控作用[3]；以及首次在绵羊Rosa26位点敲入tGFP报告基因，并产生了tGFP转基因绵羊[4]，这为生产转基因绵羊提供了参考。Rosa26作为外源基因表达的理想位点，其在小鼠、大鼠和人类中编码广泛表达的非编码RNA。非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是指一些没有编码蛋白能力的RNA，例如小分子非编码RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以及环状RNA(circular RNA，circRNA)等，它们可以参与基因表达、翻译调控等过程，在动物生长发育及疾病发生过程中发挥重要作用。以往研究非编码RNA功能主要是通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)或添加RNA模拟物等方法，目前，CRISPR/Cas9技术被广泛的应用，其可以定点编辑或稳定敲除基因、调控基因转录状态等，这为非编码RNA功能研究提供了新的思路。因此，本文通过简要介绍CRISPR/Cas系统发展历史及作用原理，并重点阐述CRISPR/Cas9技术在miRNA、lncRNA及circRNA领域中的应用，以期为相关研究提供参考。
1 CRISPR/Cas系统概述CRISPR/Cas系统自1987年被首次发现以来，直到2013年Cong等[5]成功将其应用于人和小鼠的基因编辑中，才被大家所广泛认识和深入挖掘(图 1)。随后该系统不断增添了许多新成员，如Cas12、Cas13、Cas14及Cas3等，并将其广泛的应用于农业、生物科学及基因疾病治疗等领域的相关研究。
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图 1 CRISPR/Cas系统发展中的典型事件 Fig. 1 Typical breakthroughs in the history of CRISPR/Cas system |
CRISPR/Cas系统主要由CRISPR基因座和Cas基因家族组成。根据CRISPR关联蛋白Cas的效应作用，CRISPR系统分为2类6型[12](表 1)。第1类需由多个Cas蛋白相互作用才能发挥CRISPR系统作用[13-14]，而第2类只需单一Cas蛋白(如Cas9、Cas12、Cas13等)。目前，广泛应用的基因编辑工具为Ⅱ型CRISPR/Cas9，该系统发挥作用的过程主要分为3步[15]：1)外源DNA序列的获取，即Cas1/2蛋白识别PAM序列(NGG)，然后，在CRISPR序列中插入PAM位点临近序列；2)前体crRNA(pre-crRNA)的形成；3) Cas9-crRNA-tracrRNA复合物的形成及靶向特异性位点发挥剪切作用，然后，通过非同源末端连接或同源重组(额外添加模板)等方式进行修复(图 2)。
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图 2 细菌体内天然的CRISPR/Cas9系统及其作用机制[22] Fig. 2 CRISPR/Cas9 system and its biological mechanisms in bacteria[22] |
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表 1 CRISPR/Cas系统分类及其特点 Table 1 Classifications and characteristics of CRISPR/Cas system |
目前已有研究表明，可以通过优化Cas9蛋白或sgRNA结构，以及使用抑制剂来降低基因编辑的脱靶效应。优化Cas9蛋白主要通过使Cas9蛋白的HNH或RuvC结构域失活，由2条sgRNA引导其靶向特异位点形成粘性末端，或使用具有广泛PAM位点(NGG、NG、GAA、GAT)的Cas9变体xCas9来降低脱靶率[16]。优化sgRNA主要从其序列、长度及二级结构等方面考虑。研究表明，在sgRNA的3′端富含GCC或TT序列时，敲除效率降低[17]，且不同长度的sgRNA在不同细胞中的效率不同。Fu等[18]发现，17或18 nt的sgRNA可以提高293T细胞中Cas9-sgRNA的特异性，进而降低靶外效应。Zhang等[19]在人间充质干细胞和诱导多能干细胞中却发现，17 nt sgRNA的敲除效率较20 nt降低10%~20%，且sgRNA脱靶效应增加。Kocak等[20]发现，给sgRNA加上一条短的尾巴使其具有发夹结构，通过检测其在不同蛋白中的效率可使其基因编辑准确性提高50倍。这表明，sgRNA的序列、长度及二级结构等因素会影响CRISPR/Cas9编辑基因的效率、特异性和准确性。另外，通过使用抑制剂可有效控制Cas9在体内的表达，Cas9酶活抑制剂AcrIIA2能够阻断DNA与Cas9的结合，通过干扰PAM位点的识别并与dsDNA靶位点结合，使HNH无法发生构象改变，进而导致Cas9剪切功能丧失[21]。抗CRISPR蛋白就像一个关闭开关，控制着基因编辑的准确调控。Maji等[22]通过高通量测序技术筛选出了与Cas9结合的可逆细胞渗透小分子抑制剂BRD0539，虽然它不会影响Cas9与sgRNA的结合，但会破坏Cas9-DNA的结合，这为小分子抑制剂在基因编辑中的使用提供了理论基础。
1.3 RNAi和CRISPR/Cas9技术作用特点目前，RNAi和CRISPR/Cas9技术被广泛应用于编码或非编码RNA功能研究，但其作用特点各不相同[23](表 2)。RNAi是由双链RNA与Dicer酶形成的RNA诱导沉默复合物介导的RNA降解，该方法用于研究基因功能时，可在短时间内对细胞质中的基因达到很好的抑制效果。但用于研究lncRNA功能时，由于许多lncRNA是核内RNA且结构复杂，同时，一些lncRNA功能是通过转录而不是转录产物实现的，这些特别的lncRNA使RNAi并不能发挥很好的作用效果。
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表 2 CRISPR/Cas9技术与RNAi作用特点 Table 2 Characteristics of CRISPR/Cas9 technology and RNAi |
相比于RNAi，CRISPR/Cas9技术可稳定敲除基因，并且能高效影响核内lncRNA表达。CRISPRa(CRISPR activation，CRISPRa)或CRISPRi(CRISPR interference，CRISPRi)是指核酸结构域失活的Cas9蛋白(nuclease-deactivated Cas9，dCas9)与转录激活/抑制因子融合，从而激活转录或抑制转录的方法。CRISPRa/i是在转录前发生作用，因此，不需要考虑lncRNA复杂的结构。应用CRISPRa/i还可观察到顺势调控作用的影响，研究发现，激活内源性启动子可在lncRNA转录本中观察到剪接变异的变化。但CRISPR/Cas9技术也存在不足，如干扰某些lncRNA时会对邻近基因造成干扰，RNAi技术却不会；研究来源于双向启动子的lncRNA时，其会影响编码基因的表达等[24-26]。因此，RNAi和CRISPR/Cas9技术作用优势各不相同，可以使二者相互补充，更好地用于研究基因的生物学功能。
2 CRISPR/Cas9技术在动物非编码RNA功能研究中的应用非编码RNA包括miRNA、lncRNA及circRNA等它们在动物体内广泛存在，同时也对动物的胚胎发育、细胞增殖分化、脂肪代谢及免疫抗病等方面起着重要的调控作用。目前，研究者们借助CRISPR/Cas9技术已经解析了部分非编码RNA在动物体内的生物学功能及其作用机制。
2.1 CRISPR/Cas9技术在动物miRNA功能研究中的应用miRNA是一类长度约22 nt的内源性非编码单链RNA，主要在转录后水平调控靶基因mRNA表达和抑制翻译起始进程。miRNA是机体生长发育不可或缺的一部分，其失调会影响细胞增殖、分化及机体免疫等过程，详见表 3。目前，利用CRISPR/Cas9技术探索miRNA功能的方法主要为直接干扰miRNA的表达，或干扰miRNA反应元件、miRNA宿主基因的表达以及通过Cas9与外泌体结合来探究miRNA功能。
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表 3 利用CRISPR/Cas9技术研究miRNA在动物中的作用 Table 3 Exploring the function of miRNA by CRISPR/Cas9 technique in animals |
对于miRNA功能的探索，大部分研究主要是通过直接干扰miRNA表达实现的。Zhao等[32]发现，单条sgRNA可引导Cas9靶向miRNA茎环区域，从而有效抑制小鼠细胞miR-21、miR-30a的表达。Li等[33]通过设计1条靶向罗非鱼miR-125种子区域的sgRNA干扰其功能，发现在共注射gRNA和Cas9 mRNA的20个胚胎中突变频率约为42%，但有时用单条sgRNA研究非编码RNA存在敲除效率低等问题，如单条sgRNA靶向miRNA200a/b、miRNA429a种子序列时，检测不到插入或缺失，而在其种子序列上下游设计一对sgRNA时，miRNA200a/b突变频率约60%，miRNA429a突变频率约25%。这表明，两条及以上sgRNA的使用弥补了用单条sgRNA研究miRNA功能方面存在的敲除率低或干扰同簇miRNA表达等问题[34]。miRNA在正常动物体内是处于动态平衡的，研究发现，miR-126在小鼠体内的靶向缺失会导致部分胚胎致死，这说明miR-126a对机体的发育和生长至关重要，Yan等[35]通过CRISPR/Cas9腺病毒系统介导基因组编辑技术在体内外DNA水平上干扰miR-126a表达，相关研究结果显示，miR-126a在衰老的肝中减少，在骨间充质干细胞中的破坏可诱导年龄相关性端粒缩短、DNA损伤反应和促炎细胞因子等，且缺失miR-126a会加重胆汁淤积所导致的肝缺陷。这表明，给予miR-126a是一种改善肝损伤和疾病后肝修复和代谢功能的潜在治疗策略。基于miRNA敲除，可以进一步深入解析miRNA的分子调控机制，李龙龙等[36]通过转录组数据发现，miR-125b-2敲除主要影响小鼠睾丸中与精子染色质结构和线粒体功能相关基因的表达，其中Papolb、Tssk1、Slc22a14等与精子发生相关基因显著上调。上述研究表明，miRNA可以作为治疗相关疾病的药物靶点，且相比于编码RNA，对于非编码RNA的敲除需要设计多条sgRNA才能高效干扰其表达。
由于miRNA的大部分功能是通过其种子序列靶向mRNA的3′UTR区实现的，因此，可以通过干扰mRNA的3′UTR区序列来研究miRNA功能。研究发现[37]，通过CRISPR/Cas9技术敲除Serpine1 3′UTR中miR-30反应元件后，内源转录本靶向miRNA降解机制受到干扰，阻碍了miR-30b/c的降解，进而影响了细胞凋亡的敏感性和加速了静止细胞进入细胞周期时G1/S期的转变，这项研究揭示了哺乳动物细胞中存在一个复杂的miRNA调控和由特定内源性靶点介导的基因表达调控机制，为进一步研究提供了参考数据。目前，研究生物体内miRNA活性仍面临巨大挑战，Wang等[38]利用miRNA细胞类型特异性信息，发明了一种由miRNA控制CRISPR开启的技术平台(miRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform，MICR)，该平台实现了CRISPR系统仅在特异性细胞中进行调控，将MICR与荧光蛋白表达相偶联时，可在活细胞水平实现miRNA活性的可视化监测。通过MICR平台，研究者首次在胚胎干细胞中发现了miR-21活性呈现不均一调控的异质性现象，这一发现拓展了miRNA的研究方向，表明MICR平台筛选可以成为鉴别干细胞中miRNA活性异质性的有力工具。综上，可将与特异性miRNA结合的mRNA 3′UTR区构建到该系统中，实现miRNA调控该系统的目的，Hoffmann等[39]使用miRNA依赖的抗CRISPR蛋白AcrIIA4结合Cas9变体控制基因组编辑，在Acr蛋白基因的3′UTR区插入肝脏和肌肉细胞中特异表达的miR-122和miR-1靶位点，共表达Cas9-sgRNA后，发现Cas9只在肝细胞或肌细胞中激活，这表明抗CRISPR蛋白与miRNA结合是一种激活细胞类型特异性Cas9活性的有效方法。MICR平台作为一项实用性技术，有望被广泛应用于基因编辑相关研究，为生物科学及基因治疗等领域提供新的思路。
miRNA的功能受其宿主基因表达的影响，因此，可通过研究其宿主基因的表达间接探索miRNA功能。Zhou等[40]研究发现，miR-139在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中高表达，但其潜在的作用机制还不清楚。通过荧光素酶报告系统分析发现，miR-139可以与DHFR的3′UTR结合，对CRISPRi技术研究发现，通过设计靶向牛PDE2A启动子不同区域的sgRNA干扰PDE2A表达，miR-139与其宿主基因PDE2A表达水平下降，双荧光素酶报告系统进一步证明了miR-139与其宿主基因PDE2A是属于共表达的关系，即miR-139促进牛骨骼肌卫星细胞的分化是受其宿主基因调控的。miR-2400可以靶向MYOG促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，针对其位于WHSC1L1基因的第8号内含子，设计了4条WHSC1L1启动子不同位点的sgRNA，共转染sgRNA与dCas9表达质粒，结果显示，miR-2400是由WHSC1L1内含子加工而成，而不是作为单独的RNA转录[41]。上述研究表明，大部分miRNA位于宿主基因的内含子区域，且通常与前体mRNA处于同一个转录方向。因此，它们可能受启动子驱动初级mRNA转录的控制，进而表现出共表达的模式，这意味着它们通常来源于同一个转录本。因此，对宿主基因表达的原位分析可以用来探测内含子miRNA的时空定位，为解析其功能机制奠定基础。
外泌体是一种直径为40~100 nm，由细胞分泌的含有蛋白质、脂质和核酸的双脂质膜泡，内容物主要为mRNA、miRNA、转录因子等生物活性物质，可以介导细胞间的信息交换、血管生成和细胞存活等过程。外泌体作为一种靶向药物的载体，包裹miRNA在疾病治疗应用上前景广阔。研究表明，外泌体与脂质体(含sgRNA-dCas9)结合并在间充质干细胞中发挥运输作用，通过构建CD9-HuR融合物，建立一种新的工程外泌体策略，可使miR-155抑制剂在外泌体中大量富集，高效地传递到受体细胞，使肝病小鼠得到有效的治疗[42-43]，这为肝病的诊断和治疗提供了新的靶点。外泌体miRNA作为细胞间通信的介质和疾病诊断的标志物，CRISPR/Cas9技术的出现为其发展提供了新策略，为体内基因递送的临床试验提供了基础数据支持。
2.2 CRISPR/Cas9技术在动物lncRNA功能研究中的应用lncRNA是一类含5′帽子和3′尾巴结构的长度大于200 nt的非编码RNA。近10年来，研究者们对lncRNA进行了大量的研究，发现lncRNA位点广泛存在于基因间、内含子区、启动子区、正义及反义基因内。亚细胞定位结果显示，分布在核内的lncRNA主要参与启动子特异性抑制、转录激活、表观遗传调控等，分布在细胞质中的lncRNA主要参与mRNA稳定、miRNA的表达、翻译等转录后水平。近5年的相关研究表明，lncRNA作为一类重要的调控因子在动物的生长发育过程中发挥重要作用，详见表 4。目前，通过CRISPR/Cas9技术研究lncRNA功能主要有两种方法：一是直接干扰lncRNA序列的表达，二是通过干扰lncRNA启动子影响其表达。
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表 4 利用CRISPR/Cas9技术研究lncRNA在动物中的作用 Table 4 Exploring the function of lncRNA by CRISPR/Cas9 technique in animals |
CRISPR/Cas9技术可以直接干扰lncRNA的表达，Wang等[50]在牛乳腺组织中发现了一种主要分布在细胞核内的lncRNA-TUB可以调控MAC-T细胞的免疫反应，它在促炎刺激的乳腺上皮细胞中的表达高于正常细胞，通过设计2条靶向lncRNA-TUB基因组位点的sgRNA敲除lncRNA-TUB，发现敲除后抑制了MAC-T细胞增殖、迁移等基本生物学特性和功能，这为研究lncRNA调控牛乳腺炎的机制奠定了基础。Stafford等[51]敲除小鼠lncRNA PEAT转录单元后，分析突变胚胎中的RNA-seq数据，发现近60个核糖体蛋白表达升高，且骨形态蛋白信号在PEAT突变体中轻微升高。Charme是一种小鼠染色质相关的肌肉特异性lncRNA，它可以促进肌肉生成，在肌细胞中Charme的缺失会引发特定染色体区域的解体及肌原基因的下调[52]。进一步研究发现，其在人类中存在一个同源转录本，调节相同的靶基因，这表明，Charme在进化上具有重要的保守功能，这为研究人类相关疾病提供了模型。上述研究表明，lncRNA可以影响染色体结构或作为转录因子调控转录，也可以参与到mRNA的转录后水平调控可变剪切及蛋白的翻译等，进而影响基因功能多态性及动物机体的发育过程。
启动子是位于基因5′端上游的一段DNA序列，可以影响基因的表达。田净净等[53]在斑马鱼lncRNA基因Nondret002679的启动子区域构建sgRNA，体外转录后与Cas 9mRNA一起显微注射到斑马鱼受精卵中，敲除效率达39%，并且这种敲除可以遗传至下一代，这为研究lncRNA的生物学功能提供了有效的途径，为揭示Nondret002679的功能机制奠定了基础。为了提高敲除率，在同一载体上构建两条靶向lncRNA基因MALAT1启动子区域的sgRNA，经过筛选发现，克隆体在稳定状态下的MALAT1 RNA水平下降高达98%，并显示出较低的增殖率[54]。除CRISPR/Cas9技术敲除外，CRISPRa也可以用于启动子相关的研究，Yamazaki等[55]应用可以靶向启动子区进而激活lncRNA转录的SAM复合物系统(dCas9-VP64-MS2-P65-HSF1)来上调lncRNA NEAT1，发现lncRNA NEAT1上调后，可诱导paraspeckles小体的形成。这种SAM系统作为研究基因表达和3D基因组组织中NEAT1诱导paraspeckles小体形成的分子功能和作用平台之一，将有助于进一步挖掘NEAT1具体作用机制。
lncRNA广泛存在于机体内，参与机体的各项生理或病理过程，然而，许多lncRNA执行的精确功能和机制在很大程度上仍然是未知的。为了查询或重定向lncRNA功能，Shechner等[56]开发了一个名为CRISPR-Display的平台，可使lncRNA靶向特定位点和操纵蛋白伴侣，这为深入了解lncRNA的性质，解析其功能机制提供了全新的工具。值得注意的是，利用CRISPR技术揭示lncRNA功能机制仍存在一定的困难，在全基因组分析中，发现15 929个lncRNA基因座中只有38%能够进行CRISPR调控，而近67%的lncRNA基因座会对邻近基因造成影响[57]，另外，对于双向启动子来源lncRNA的干扰可能会影响编码RNA的表达。
2.3 CRISPR/Cas9技术在动物circRNA功能研究中的应用circRNA是一类不含5′帽子和3′尾巴结构的环状RNA，其不易受核酸外切酶的影响，因此在细胞内可以稳定表达。circRNA作为非编码RNA的新成员，其来源于内含子、外显子等基因组区域，可以作为miRNA海绵、剪接和转录的调控因子以及亲本基因表达的修饰因子等。对于circRNA的成环机制普遍认同的是其侧翼序列的互补配对(Alu结构)，其次是套索结构和RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)。目前，通过CRISPR/Cas9技术研究circRNA功能主要有以下几种方法：直接敲除circRNA序列、干扰circRNA侧翼序列或干扰RBP的表达。
利用CRISPR/Cas9技术对基因组DNA特定位置的circRNA进行敲除时，可以在不影响mRNA表达的情况下对特殊的circRNA序列进行直接敲除。在人和小鼠的大脑中，circRNA CDR1as被大量的miR-7和miR-671结合，且CDR1as同一位置无其他RNA的表达，通过设计与CDR1as上下游结合的两条sgRNA显微注射C57BL/6N小鼠的单细胞胚胎，后期研究结果显示，CDR1as敲除的小鼠表现出了较差的感觉反应，且在CDR1as缺陷的大脑中，miR-7靶基因Fos等神经元活动标志基因表达增强[58]。Kleaveland等[59]借助CRISPR/Cas9技术解析了小鼠大脑中lncRNA-Cyrano、miR-7、miR-671以及CDR1as之间存在的复杂网络调控机制，发现Cyrano可以抑制miR-7的表达，miR-7可以直接或间接增强miR-671的表达来抑制CDR1as的积累，从而建立了由1个circRNA，1个lncRNA和2个miRNA相互调控的复杂网络。上述研究表明，circRNA具有很多miRNA结合位点，因此，可以充当miRNA的海绵，调控其靶基因的表达，参与神经网络调控、细胞增殖分化及血管生成等过程。
circRNA侧翼序列可促使其成环，因此，可通过敲除其侧翼序列抑制circRNA的形成。Zheng等[60]发现，HIPK3的2号外显子侧翼序列存在高度反向互补的Alu重复序列，通过CRISPR/Cas9技术在HEK-293T细胞中敲除侧翼序列会减少circHIPK3的形成，且对来源基因不会造成影响。circRNA Cia-cGAS在长期造血干细胞(LT-HSCs)的细胞核中高表达，通过CRISPR/Cas9技术敲除Cia-cGAS下游的反向互补序列可有效敲低Cia-cGAS基因的表达量，且在Cia-cGAS敲除小鼠中静息的LT-HSCs明显降低，骨髓中的Ⅰ型干扰素表达升高。Cia-cGAS可以结合细胞核内的DNA传感器cGAS，阻断cGAS酶活性，保护静息的LT-HSCs免受cGAS介导的衰竭，从而揭示了Cia-cGAS是通过阻断cGAS酶活性来抑制核cGAS的表达和阻止cGAS识别DNA来维持宿主稳态的机制[61]。以上研究证明了侧翼互补序列在circRNA成环及功能行驶中扮演着重要作用。但要注意的是，大多数circRNA有很多的侧翼Alu结构，因此，需要考虑具体情况来尽量减少敲除Alu对其mRNA或其他线性RNA的影响。
CRISPR/Cas9技术可以通过干扰RBP来抑制circRNA的形成。RBP是一类广泛参与基因转录和翻译的蛋白，参与circRNA的形成、翻译、靶基因的转录调控、细胞外转运等过程。QKI作为一种RNA家族信号转导和激活的RBP，可在上皮细胞向间质细胞转化过程中调节circRNA的形成。大鼠心肌细胞QKI沉默后会加剧阿霉素诱导心肌细胞发生的凋亡和萎缩。通过在QKI基因第1、2外显子上分别设计3条sgRNAs，构建QKI敲除的HL-1细胞系，深入研究发现，QKI是通过调控相关circRNA的表达来抑制阿霉素诱导的心肌损伤[62]。选择性RNA剪接在癌症中起着重要的作用，为了确定RNA进程中前列腺癌生长所需的基因，Fei等[63]利用CRISPR/Cas9敲除方法在全基因组筛选出了一种RNA结合蛋白异质核糖核蛋白L(HNRNPL)，其参与pre-mRNA的选择性剪接，RNA-seq结果确定了敲低HNRNPL后232个显著变化的circRNAs，且HNRNPL结合在内含子侧翼序列会显著增强circRNA的形成，进一步的研究数据揭示了HNRNPL及其RNA靶点在前列腺癌生长和潜在治疗靶点中的作用，提示靶向RBP或RBP-RNA相互作用可能是前列腺癌一种新的治疗方法。上述研究结果表明，RBP作为circRNA形成的促进剂，可通过稳定circRNA互补序列或通过调节RNA剪接来促进circRNA形成。利用CRISPR/Cas9技术研究二者之间的相互作用关系，可促进circRNA在动物生长、疾病研究等方面的应用。
CRISPR/Cas9技术除了能干扰circRNA表达外，还可以用于研究其编码潜能。最近的研究表明，环状RNA不仅可以在RNA水平发挥功能，还可以依赖内部核糖体嵌入位点和m6A甲基化修饰两种方式编码多肽。circ-ZNF609来源于ZNF609基因的第二外显子，包含一个ORF阅读框，能够特异性地控制成肌细胞的增殖。通过CRISPR/Cas9技术在小鼠胚胎干细胞ZNF609基因第二外显子终止密码子上游插入3×FLAG编码序列，该标记蛋白仅在ZNF609的第二个外显子成环时才能产生，结果显示，circ-ZNF609能够编码多肽，但其蛋白产物的详细功能及机制还不清楚[64]。长链非编码RNA lnc-PINT的2号外显子可单独形成circ-PINT，其包含一个完整的开放阅读框，通过CRISPR/Cas9技术结合其他试验，证实circ-PINT可通过核糖体进入位点序列IRES翻译出87个氨基酸组成的全新多肽PINT87aa，敲除小鼠低成瘤细胞中circ-PINT编码序列后，增强了小鼠的成瘤能力，这表明circ-PINT翻译的多肽PINT87aa可以抑制肿瘤的生长。PINT87aa作为一种新发现的相互作用蛋白，虽然没有证据表明其直接与DNA结合并作为转录因子发挥作用，但其与PAF1复合物的相互作用提示其可能在决定PAF1复合物的正确定位中发挥作用[65]。circRNA作为目前研究的明星分子，其翻译潜能的发现开拓了circRNA功能研究的新方向。
3 展望非编码RNA作为一类广泛存在于机体生长发育、疾病免疫等生理或病理过程中的RNA，在细胞的增殖、分化、迁移及机体免疫中扮演着重要的角色，但其很多具体的作用机制还有待进一步研究。例如circRNA作为非编码RNA的新成员，虽然已经利用一些研究方法解析了其部分的功能机制，且一些研究表明其具有编码潜能，但对其翻译产物的详细功能机制还有待研究。而对于很多lncRNA，其功能机制都还不清楚，需要利用有效的工具进行深入挖掘。CRISPR/Cas9技术作为一种简单易操作的编辑技术，已成为生物分子及基因治疗领域主要的基因编辑工具。目前，关于该技术在动物非编码RNA的研究主要集中在人或小鼠、斑马鱼等模式动物中。另外，该技术的使用存在一定的脱靶效应，且用于研究非编码RNA功能方面还存在一些局限性，但研究者们正在不断的完善该技术，相信随着技术的不断成熟，能为非编码RNA功能研究提供更有价值的帮助。
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