2. 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心, 兰州 730070
2. Technology and Research Center of Gansu Province for Embryonic Engineering of Bovine and Sheep & Goat, Lanzhou 730070, China
肾小管上皮细胞上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)在肾脏疾病的发生发展过程中有极为重要的作用,其主要表现为在失去肾小管上皮细胞表型的同时出现间质成纤维细胞表型[1]。研究表明,低氧对EMT的影响主要是由低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)家族中的HIF-1α所介导[2-3],与EMT密切相关的细胞因子是其调控的下游靶基因之一。目前,EMT的具体机制虽不明确,但已有研究显示,与EMT相关的通路有TGF-β1/Smad,Notch,NF-κB,PI3K/AKT等,其中TGF-β1/Smad信号通路在EMT机制中发挥着极为重要的作用[4-6]。有研究表明,HIF-1α可以增强Smad3介导的COL1A2转录[7]。此外,HIF-1α可以直接激活转化生长因子(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)信号通路中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的转录,协同诱导EMT。HIF-1α对TGF-β1的调节作用也在脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain-2,PHD-2)基因敲除小鼠模型中得到证实,当PHD-2不表达时,HIF-1α的降解停止,TGF-β1的表达显著上调,促进了肾小管上皮细胞上皮-间质转化[8]。当发生EMT时,肾小管上皮细胞的标志蛋白(E-cadherin和occludin)表达量减少,而间质成纤维细胞的标志蛋白(fibronectin-1,vimentin和α-smooth muscle actin)表达量增高,细胞形态由铺路石样的上皮细胞转变为长梭形的成纤维细胞[1]。
牦牛是长期生活于高海拔、低氧环境下的物种,经过长期自然选择,牦牛在高原的低氧环境下形成其独特的形态结构和生理机制,是研究有关低氧适应机制的天然物种[9]。虽然近年来有关牦牛的研究报道越来越多,但对牦牛肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells, RTECs)的分离、培养及肾小管上皮细胞上皮-间质转化的研究还未见报道。本实验室已发现,牦牛肾小管上皮细胞的数量随年龄的增长而减少[10],但与低氧机制的关系还不明确,且牦牛RTECs不仅是研究EMT机制的基础,也是研究肾脏疾病机理的重要条件。因此,本试验对牦牛RTECs进行分离培养及鉴定,在纯化得到细胞系的同时,进一步探讨HIF-1α的表达对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响。
1 材料与方法 1.1 试验样品新生牦牛(5日龄)样品采自本校动物房。处死牦牛后,取双肾,放置于预冷冰盒中带回实验室。
1.2 主要试剂和仪器DMEM/F-12购自Gibco公司。胰蛋白酶,Ⅰ型胶原酶,Ⅱ型胶原酶购自Sigma公司。胎牛血清购于Hyclone公司。CCK8试剂盒,兔抗CK18,TGF-β1,E-cadherin,α-SMA多克隆抗体和二抗均购自Bioss公司。鼠抗HIF-1α和β-actin单克隆抗体分别购自Abcam和全式金。倒置显微镜(Olympus,日本)。
1.3 牦牛肾小管上皮细胞的分离培养肾脏经生理盐水(含有50 U·mL-1青霉素和50 μg·mL-1链霉素)反复冲洗后剥离被膜,取皮质。将其剪成大约1 mm3的组织块后转移到离心管中,1 000 r·min-1离心5 min。取沉淀置于4个培养皿中,分别加入0.1%的Ⅰ型胶原酶、0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.1%的Ⅰ+Ⅱ型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶,在37 ℃培养箱中消化2 h后用培养液终止消化。将培养皿中的液体和未消化完全的组织用100目筛网过滤,过滤后的液体1 000 r·min-1离心3 min,重复3次。取沉淀,加入培养液制成悬液,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养。48 h后首次更换培养液。
1.4 牦牛肾小管上皮细胞的活性测定取对数期细胞制成细胞悬液并进行细胞计数。取1 mL悬液将其稀释成105、104、103和102四个梯度,设置空白对照组。每个梯度5个复孔,每孔加入100 μL培养液,置于96孔板中,37 ℃培养。细胞贴壁4 h后,每孔加入10 μL的CCK8试剂。分别在0.5、1、2和3 h时,用酶标仪(450 nm)测量其吸光度(OD值),制作标准曲线。选取104浓度接种96孔板,每隔24 h加入CCK8试剂孵育3 h后,测量其OD值,连续测定7 d。根据标准曲线将OD值换算成细胞密度,绘制生长曲线。
1.5 细胞免疫荧光鉴定用4%多聚甲醛对贴壁细胞固定30 min,0.5%的Triton X-100通透30 min,使用免疫荧光封闭液(BSA)室温封闭3 h(勿洗)。分别滴加anti-CK18(1:400),anti-Vimentin(1:400)和anti-CD31(1:400)后4 ℃孵育过夜。清洗后加山羊抗兔的荧光二抗(1:250),37 ℃孵育1 h。滴加DAPI染液,室温染色3 min。取出载玻片,封片,倒置显微镜下观察结果。
1.6 实时荧光定量PCR取DMOG组和对照组细胞置于冰盒上,使用细胞裂解液Trizol提取总RNA,按照反转录试剂盒说明书的步骤将其反转成cDNA后进行实时荧光定量PCR(引物序列见表 1)。反应体系为20 μL:10 μL SYBR Green Mix,8 μL ddH2O,1 μL cDNA,上下游引物各0.5 μL。反应条件:95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,72 ℃ 5 min,40个循环。每个基因设置3个复孔。用2-△△CT法计算基因的mRNA相对表达量。
取DMOG组和对照组细胞置于冰袋上进行蛋白裂解(1 mL RIPA +10 μL RMSF),将提取的蛋白与4×蛋白buffer混合(3:1),在100 ℃的恒温金属浴中放置10 min进行蛋白变性。4 μL蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,湿转法将其蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,HIF-1α(1:1 000),TGF-β1(1:250),E-cadherin(1:250)和α-SMA(1:250)一抗4 ℃孵育过夜。二抗(1:1 000)室温孵育1 h,ECL化学发光试剂盒显影。每组重复测定3次,Image J软件对Western blot条带进行分析。
1.8 数据统计分析采用SPSS19.0软件ANOVA分析法对不同组别的HIF-1α,TGF-β1,E-cadherin和α-SMA表达差异进行统计学分析。
2 结果 2.1 消化酶的选择使用0.25%胰蛋白酶,0.1%Ⅰ型胶原酶,0.1%Ⅱ型胶原酶和0.1%Ⅰ+Ⅱ型胶原酶对组织进行消化,以所获取的肾小管节段的数量和细胞贴壁的情况为标准,筛选出最适合牦牛肾小管上皮细胞分离提取的消化酶。由图 1可知,经0.1%Ⅰ+Ⅱ型胶原酶处理得到的肾小管节段和细胞团最多;悬液接种48 h后,对细胞的贴壁情况进行观察,发现经0.1%Ⅰ+Ⅱ混合型胶原酶处理过的组织,细胞贴壁数量最多(图 2)。综合上述试验结果,0.1%Ⅰ+Ⅱ混合型胶原酶无论是在获得肾小管节段的数量还是在细胞增殖上都是最优的消化酶。
细胞生长曲线呈“S”型(图 3)。在0~2 d时,细胞处于潜伏期。第2天之后细胞增殖明显,3~5 d时细胞达到对数期,呈指数生长。在第5~6 d时细胞增殖达到平台期。但由于细胞接触抑制等原因,导致细胞数量在平台期后有所减少。
角蛋白18(CK18)是上皮类细胞特异性蛋白标志物,波形蛋白(Vimentin)和内皮细胞粘附因子(CD31)分别为成纤维细胞和内皮细胞特异性标志物。CK18呈阳性表达说明所获得的细胞为肾小管上皮细胞。由图 4可知,CK18在细胞骨架上呈阳性表达且荧光信号较强,Vimentin和CD31呈阴性表达。试验结果表明,所培养的细胞为牦牛肾小管上皮细胞且纯度较高,可用于后续试验。
为研究HIF-1α的表达对EMT机制中相关基因的调控作用,对细胞使用HIF-1α激动剂甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)进行干预96 h,并将其作为DMOG组,未做药物处理的细胞作为对照组。使用实时荧光定量的方法来检测HIF-1α,TGF-β1,E-cadherin和α-SMA在mRNA水平上的表达情况。由图 5A可知,各个基因的扩增产物大小与预期片段大小相符,引物特异性强,可用于后续的qRT-PCR试验。由图 5B可知,HIF-1α,TGF-β1和α-SMA的mRNA水平在DMOG组的表达比对照组有所增加,且差异性极为显著(P < 0.01),而E-cadherin的mRNA水平在DMOG组的表达比对照组低,具有显著差异性(P < 0.05)。结果说明,DMOG诱导了HIF-1α的表达,从而使与肾小管上皮细胞上皮-间质转化有关的基因在mRNA水平产生变化。
为了验证DMOG对HIF-1α,TGF-β1,E-cadherin和α-SMA在蛋白水平上的影响,采用Western blot技术对相关基因的蛋白水平进行检测。由图 6B可知,HIF-1α,TGF-β1和α-SMA在DMOG组的蛋白表达量相比于对照组有所增加,且具有极显著差异性(P < 0.01)。而E-cadherin蛋白在DMOG组的表达与对照组相比有所减少,并具有极显著差异性(P < 0.01)。试验结果进一步表明DMOG成功诱导了HIF-1α的表达,从而使TGF-β1和α-SMA的蛋白表达显著增加,E-cadherin的蛋白表达显著降低。
为研究HIF-1α的表达对牦牛肾小管上皮细胞形态改变的作用,使用光镜观察DMOG组和对照组中的肾小管上皮细胞的形态变化并检测转化后的细胞类型。如图 7所示,对照组中的细胞呈铺路石样;DMOG组中的细胞经药物处理48 h时,部分细胞转化为长梭形细胞;在96 h时大部分细胞都转变为长梭形细胞,只有少量的铺路石样细胞存在。免疫荧光结果显示(图 8),转化后的细胞仅有少量表达上皮细胞特异性蛋白E-cadherin,而大部分细胞表达间质成纤维细胞特异性蛋白α-SMA。试验结果表明,经药物DMOG的处理后,细胞形态由铺路石样转化为长梭形且转化后的细胞为间质成纤维细胞。
上皮细胞的分离培养方法已有报道[11-13]。常用的分离方法有:组织贴壁法、酶消化法、免疫磁珠法和流式细胞分选法。由于免疫磁珠和流式细胞分选法的成本较高,接受范围小,所以国内外多应用组织贴壁法和酶消化法分离细胞。组织块贴壁法虽然操作简单,但细胞培养周期较长,获得的细胞纯度较低。而酶消化法操作相对繁琐,影响因素较多,但细胞的获取周期短,纯度高。在近些年的细胞分离培养研究中更多选用酶消化法,但由于试验动物和培养的细胞类型不同,并没有一种被公认最优的消化酶。因此本试验参考其它研究报道后,选取常用的几种消化酶对牦牛RTECs进行分离培养[14-16]。本试验结果表明,使用混合型胶原酶可以获得活性和纯度较高的牦牛RTECs,且在第3天细胞即可贴壁,在第5天其融合度可达到95%以上。相比既往报道,培养周期较短,细胞纯度较高[17-18]。试验中发现胶原酶比胰蛋白酶在细胞分离过程中的效果更好,可能是由于牦牛肾小管外围含有丰富的胶原纤维[10]。
细胞纯化是原代细胞培养过程中必不可少的一步,尤其RTECs衰老后会向成纤维细胞转化[19]。大多数研究中利用成纤维细胞对胰酶的敏感性和快速贴壁的原理,使用差速消化法和差速贴壁法对细胞进行纯化[20-22]。但由于差速贴壁法去除成纤维细胞需要重复多次细胞贴壁试验[22],且完全消化后的细胞形态均呈椭圆形,无法分辨成纤维细胞和上皮细胞形态上的差别,导致细胞贴壁时间无法把握,使纯化后所剩的细胞数量较少或细胞纯度较低。而差速消化法可以很好的避免这种弊端,利用成纤维细胞对胰酶敏感的特性,当加入胰酶后,成纤维细胞收缩变成椭圆形且有少量细胞悬浮时,再加入含有血清的培养液终止其消化并轻微吹打皿底细胞,可使成纤维细胞悬浮,而上皮细胞依旧处于贴壁状态。也有资料建议使用无血清或低血清培养法培养RTECs,可以有效的抑制成纤维细胞的生长[21]。但会导致上皮细胞增殖速度变缓,细胞培养周期变长。本试验采用差速消化法对细胞进行纯化,并使用较低浓度的血清,效果良好。
本试验通过DMOG对细胞处理后诱导HIF-1α表达,继而检测与EMT发生相关的基因变化情况,以确定HIF-1α对EMT机制是否具有调控作用。在EMT的进程中,上皮细胞转化为具有迁移能力的间质细胞是生物形态转变的一个必要过程。近年来的研究表明,EMT在实质器官的纤维化、肿瘤转移、糖尿病等疾病的发生发展过程中也扮演着重要角色[23]。而病理性的EMT发生与机体低氧有着密切的关系。Higgins等[24-25]发现,在低氧条件下,肝脏和肾脏中都存在EMT的发生,且HIF-1α的表达对EMT机制具有促进作用。Copple[26]发现,通过诱导PHD-2的表达从而抑制HIF-1α的累积,并没有EMT的发生,但当上调HIF-1α的表达时,检测到了EMT的发生[26]。这都说明HIF-1α对EMT具有调控作用。绝大部分研究表明,HIF-1α对EMT的调控主要依赖于TGF-β1/Smad信号通路(图 9)。在低氧的情况下,PHD-2的表达被抑制,导致HIF-1α的积累从而激活TGF-β1基因[25]。活化的TGF-β1与其受体结合后,使TGF-β R Ⅰ的甘氨酸和丝氨酸富集的GS区发生磷酸化,激活下游的信号分子Smad2和Smad3,活化的R-Smads与Smad4形成三聚体复合物,进入细胞核,通过结合ZEB1、SIP1、Snail、Slug、Twist等转录因子使上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达下调,成纤维细胞标志蛋白α-SMA的表达上调[27]。这时的上皮细胞失去极性呈纺锤状,粘附能力下降,迁移能力增强,最终导致上皮-间质转化的发生。本研究通过使用Western blot和qRT-PCR方法对与EMT机制相关基因在药物处理前后的表达情况进行检测,发现E-cadherin表达下调,而TGF-β1和α-SMA表达上调,上皮样细胞转变为间质样细胞形态,且部分处于转化中的细胞既具有间质特性也具有上皮特性,这与前人研究结果一致[25]。迄今为止,由于肾小管上皮细胞上皮-间质转化所涉及到的信号通路较多,并没有相关研究对EMT机制做出明确的阐述,因此仍需进一步研究。
0.1%Ⅰ+Ⅱ混合型胶原酶是最适合牦牛肾小管上皮细胞分离提取的消化酶,且获得的肾小管上皮细胞的活性和纯度较好,可以用于后续试验;在药物DMOG的作用下,牦牛肾小管上皮细胞HIF-1α表达上调,继而对TGF-β1和α-SMA的表达产生促进作用,并降低了E-cadherin的表达,贴壁的肾小管上皮细胞形态由铺路石样变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞,说明HIF-1α表达上调对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化具有促进作用。
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