2. 大路镇畜牧兽医站, 重庆 402772;
3. 四川省水产学校, 成都 611730
2. The Animal Husbandry and Veterinary Station of Dalu Town, Chongqing 402772, China;
3. Sichuan Fisheries School, Chengdu 611730, China
目前中国手机使用人数众多，其中青少年占13%。由于手机在使用过程中与大脑非常接近，有研究表明，大脑暴露电磁波辐射可导致脑功能障碍[1]。以往的研究表明，中枢神经是微波辐射的敏感靶器官之一[2-3]，暴露的电磁波能会导致中枢神经系统生理功能的改变[4-5]。Kivrak等[6]的研究表明微波辐射对海马和小脑有影响；Deshmukh等[7]则表示微波辐射可使脑内的DNA损伤，神经细胞死亡并抑制胚胎发育过程中神经干细胞向神经元的分化[8]，同时，改变血脑屏障通透性[9]、脑内神经递质水平及相关酶的活性，降低大脑的认知能力和造成记忆障碍[10-11]。下丘脑与中枢神经系统的其他部位具有密切的相互联系，可通过神经和血管途径调节脑垂体前﹑后叶激素的分泌和释放﹐还可参与调节自主神经系统[12-13]。谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、天门冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)是氨基酸神经递质，广泛分散于脑组织，可以传递各种信息，从而调节动物体生理功能[14-16]。
我国手机使用的频率集中在1.8~2.3 GHz，辐射剂量一般在0.6~2.1 mw·cm-2。1.8~2.3 GHz之间的微波频率是否会导致下丘脑组织形态和功能的改变，目前尚不清楚。本试验选择1.8 GHz频段和1、2 mw·cm-2辐射强度进行试验，以昆白小鼠为研究对象，研究不同辐射强度对性成熟前小鼠下丘脑组织结构的影响，为微波辐射对中枢神经系统的影响提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器Bouin’s固定液(饱和苦味酸75 mL，甲醛25 mL，冰醋酸5 mL)；磷酸盐缓冲液(PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司)；功率信号源(1 800 MHz，2 W，成都科之源电子科技有限责任公司)；频谱仪(FSP13，9 KHz~7 GHz，德国R/S公司)；TECNAI110电镜，荷兰飞利浦公司)。
1.2 实验动物分组与处理选用体重无显著差异的SPF级成年怀孕昆白母小鼠90只(体重30~35 g)，随机分为三组，每组30只，分别装入自制有机玻璃笼内，每天全身暴露于1.8 GHz微波[使用德国频谱仪(FSP13，9 KHz~ 7 GHz，R/S公司)在辐照前测试辐射参数]中12 h(9:00—21:00)，每组的辐射强度分别为0(对照组)、1(低剂量组)、2 mw·cm-2(高剂量组)，直至小鼠出生后30日龄停止辐照，继续饲喂小鼠至60日龄。试验小鼠放置在室温20~25 ℃、相对湿度60%~65%，恒定光照周期(12 h光照，12 h黑暗)的环境中饲养，自由采食和饮水。每天观察仔鼠的精神状态，称取各组小鼠体重，将对照组与处理组分别进行比较。
1.3 样品采集在小鼠30、45、60日龄时，每组随机取15只仔鼠进行断颈处死，取出小鼠整个脑组织，称重。投入Bouin’s液固定12 h，固定后分离出下丘脑。将每组的15个样本随机分为3份，每份5个，一份经30%蔗糖溶液脱水后，锡箔纸包好置于-80 ℃冰箱中保存，用于神经递质的测定，一份经冲洗后置于2.5%的戊二醛中用于制作电镜切片，剩余一份用作制备石蜡切片并进行HE染色。
1.4 测定指标 1.4.1 小鼠下丘脑组织结构和超微结构观察取Bouin’s液中保存的下丘脑组织(每组5个重复)冲洗后在70%、80%和90%的乙醇中分别脱水1.0 h，再经无水乙醇脱水2.0 h；置于二甲苯中进行透明化处理，最后将组织块浸蜡、包埋。采用连续切片，切片厚度为5 μm，每隔10张切片挑选1张，每30张中挑选2张。然后进行HE染色，在显微镜观察下丘脑组织结构的变化。
取出小鼠的下丘脑组织，用2.5%的戊二醛固定后，0.1 mol·L-1PBS漂洗两次(10 min·次-1)，1%锇酸后固定2 h，丙酮梯度脱水(50%、70%、80%、90%各10 min，100%15 min×3次)，环氧树脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片、铀染、铅染后，用荷兰飞利浦TECNAI110电镜观察下丘脑组织细胞的变化。
1.4.2 下丘脑中氨基酸类神经递质的测定标本处理：分别取对照组、低剂量处理组和高剂量处理组的冰冻下丘脑组织(n=5)，100 mg的脑组织中加入1 mL的10%磺基水杨酸；高速分散器匀浆；4 ℃ 15 000 r·min-1离心20 min，取上清，置于4 ℃冰箱中备用(以上过程均在冰浴中进行)。
氨基酸测定：取20 μL上述上清，衍生(加100 μL衍生试剂)后，采用惠普公司高效液相色谱仪检测下丘脑中Glu、Asp、GABA和Gly 4种氨基酸的含量。
1.5 数据处理与统计所有的试验处理每组5个样品，并且均经过三次重复测定。所获得的试验数据采用SPSS11.5软件分析数据间差异的显著性(P＜0.05)，并采用Global one-way ANOVAs分析各处理组间的相关性，经由LSD法分析不同组间的差异。试验数据采用x±sx(n=15)表示。
2 结果 2.1 试验期小鼠整体状态观察对照组小鼠精神状态良好，反应灵敏，动作敏捷，无死亡。低剂量试验组精神状态较好，反应稍迟钝，动作不敏捷，无小鼠死亡；高剂量试验组精神萎靡不振，反应迟钝，毛色粗糙、无光泽，甚至还有畸形、花斑鼠出现。停止辐射后，低剂量试验组小鼠精神状态逐渐好转，毛色逐渐恢复光亮，动作逐渐恢复敏捷。高剂量试验组小鼠的精神逐渐恢复，但畸形、花斑鼠仍存在。
2.2 小鼠体重及脑质量变化由表 1可知，30日龄停止微波辐射后，高剂量组小鼠体重显著低于对照组和低剂量组(P＜0.05)，分别减少了29.0%、21.4%；低剂量组的小鼠体重比对照组减少了9.6%，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 1 微波辐射对小鼠体重及脑重量的影响(x±sx) Table 1 Effect of microwave radiation on the measurement of body weight and whole brain weight in mice(x±sx) |
与对照组相比，低剂量组脑质量减少了5.6%(P＜0.05)，高剂量组的脑质量减少了11.8%(P＜0.05)；与低剂量组相比，高剂量组小鼠的脑质量减少了6.6%(P＜0.05)，由此可见，随着辐射强度的增加，小鼠脑组织的损伤差异越显著。
2.3 小鼠脑组织变化图 1箭头所指为小鼠下丘脑位置(腹面观)。
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图 1 小鼠全脑图 Fig. 1 Whole brain of mice |
30日龄时，对照组小鼠下丘脑，细胞层次清晰，细胞呈圆形且饱满结实，内容物均匀不透明，细胞核清晰可见(图 2A)；与对照组相比，低剂量试验组细胞出现空泡化，内容物不均匀，并出现萎缩现象(图 2B)；高剂量试验组细胞空泡化程度更加明显，空泡化细胞数量增多(图 2C)。
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A.正常下丘脑组织；B. 30日龄低剂量组下丘脑组织；C. 30日龄高剂量组下丘脑组织；D. 45日龄低剂量组下丘脑组织；E. 45日龄高剂量组下丘脑组织；F. 60日龄低剂量组下丘脑组织；G. 60日龄高剂量组下丘脑组织；1、8、9.正常细胞；2、4、10.细胞空泡化；3、5、6、7.细胞萎缩；标尺=50 μm A.Normal hypothalamic tissue; B. Hypothalamic tissue of the 30-day low-dose group; C. Hypothalamic tissue of the 30-day high-dose group; D. Hypothalamic tissue fo the 45-day low-dose group; E. Hypothalamic tissue of the 45-day high-dose group; F. Hypothalamic tissue of the 60-day low-dose group; G. Hypothalamic tissue of the 60-day high-dose group; 1, 8, 9. Normal cells; 2, 4, 10. Cells vacuolization; 3, 5, 6, 7. Cell atrophy; Bar=50 μm 图 2 辐射对下丘脑细胞影响的光镜观察 Fig. 2 Light microscopic observation of hypothalamic cells in control group and radiation groups |
45日龄时，低剂量试验组小鼠下丘脑细胞形态基本恢复，还有个别萎缩细胞出现(图 2D)；高剂量组萎缩变形细胞仍然较多，不过与高剂量试验组30日龄时相比损害细胞数量减少(图 2E)。
60日龄时，低剂量组细胞形态基本恢复(图 2F)，高剂量组基本恢复，存在个别空泡化细胞(图 2G)。
2.3.2 小鼠下丘脑超微结构的观察对照组细胞结构正常，核仁粗大，核膜清晰，细胞质内含丰富的线粒体和滑面内质网，基质电子密度较高，高尔基体较发达，还见较多游离核糖体，无线粒体肿胀现象(图 3A、B)。
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A.正常下丘脑细胞(标尺=5 μm)；B.正常下丘脑细胞(标尺=2 μm)；C. 30日龄低剂量组(5标尺=5 μm)；D. 30日龄高剂量组(标尺=5 μm)；E. 45日龄低剂量组(标尺=1 μm)；F. 45日龄高剂量组(标尺=1 μm)；G. 60日龄低剂量组(标尺=5 μm)；H. 60日龄高剂量组(标尺=1 μm)；1、22.滑面内质网；2、17、19.核仁；3.核膜；4、20.游离核糖体; 5、15、21.线粒体；6、9、12、14.线粒体水肿；7.血管间隙扩张；8.细胞间质水肿；10.核间隙扩张；11.核膜增厚，核孔增大；13.核萎缩；16、18.细胞核 A. Normal hypothalamic cells(Bar=5 μm); B. Normal hypothalamic cells(Bar=2 μm); C. 30-day low-dose group(Bar=5 μm); D. 30-day high-dose group(Bar=5 μm); E. 45-day low-dose group(Bar=1 μm); F. 45-day high-dose group(Bar=1 μm); G. 60-day low-dose group(Bar=5 μm); H. 60-day high-dose group(Bar=1 μm); 1, 22. Slip surface endoplasmic reticulum; 2, 17, 19. Nucleolus; 3. Nuclear membrane; 4, 20. Free ribosomes; 5, 15, 21. Mitochondria; 6, 9, 12, 14. Mitochondrial edema; 7. Dilated vascular space; 8. Interstitial edema; 10. Nuclear gap expansion; 11. Nuclear membrane thickening, nuclear pore enlargement; 13. Nuclear atrophy; 16, 18. Cell nucleus 图 3 辐射对小鼠下丘脑细胞超微结构影响的透射电镜观察 Fig. 3 Transmission electron microscopic observation of hypothalamic cells in control and irradiated mice |
30日龄时低剂量试验组下丘脑细胞间质和线粒体出现水肿，血管间隙严重扩张(图 3C)。高剂量试验组下丘脑细胞线粒体水肿明显增多，其电子密度降低，核间隙扩张，核膜增厚，核孔增大(图 3D)。
45日龄时低剂量试验组血管间隙未见明显增宽，但是仍有线粒体肿胀现象发生(图 3E)。而高剂量试验组核萎缩变形，线粒体肿胀现象并没有恢复(图 3F)。
60日龄时低剂量试验组基本恢复正常形态，正常线粒体清晰可见，细胞核呈圆形，核仁清晰可见(图 3G)。高剂量试验组也出现明显好转，线粒体肿胀的现象基本恢复，细胞核也恢复正常的圆形，核仁也能清晰看见，核糖体、滑面内质网清晰可见，电子密度较30日龄时高剂量试验组和45日龄时低剂量试验组升高(图 3H)。
2.4 小鼠下丘脑中氨基酸类神经递质的变化如表 2所示，与对照组对比，低剂量组小鼠30日龄脑内Asp、Glu的含量分别增加了12.2%、3.1%，但差异不显著(P＞0.05)；Gly、GABA的含量分别增加了20.3%、33.0%，差异显著(P < 0.05)；高剂量组小鼠30日龄脑内Asp、Glu、Gly、GABA的含量分别增加了43.0%、30.4%、101.7%、56.3%，差异显著(P < 0.05)。无论是低剂量组还是高剂量组GABA/Glu的比值都显著增大(P < 0.05)。
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表 2 微波辐射对小鼠下丘脑氨基酸类神经递质含量的影响(x±sx) Table 2 Microwave radiation on the mouse hypothalamic amino acid neurtransmitter content(x±sx) |
45日龄时，与对照组30日龄对比，低剂量组Asp、Gly的含量分别减少4.1%、1.7%，Glu、GABA的含量分别增加5.6%、2.7%，但差异均不显著(P＞0.05)；高剂量组Asp、Glu、Gly、GABA的含量分别增加23.8%、17.1%、111.9%、37.5%，均差异显著(P < 0.05)。低剂量组GABA/Glu比值基本恢复至对照组水平，高剂量组仍处于较高水平(0.41)。
60日龄时，与对照组30日龄对比，低剂量组Asp、Glu、Gly、GABA的含量分别增加0.6%、6.6%、1.7%、3.1%，但差异不显著(P＞0.05)；高剂量组Asp的含量减少1.7%，Glu、GABA的含量分别增加9.2%、4.9%，差异不显著(P＞0.05)，Gly的含量增加25.4%，差异显著(P < 0.05)。GABA/Glu比值都恢复至对照组水平。
3 讨论Jorge-Mora等[17]的试验证实下丘脑对微波辐射的非热反应敏感。本试验中小鼠的精神状态、行为异常，可能与下丘脑出现了功能异常有关。在停止辐射后(30日龄)低剂量试验组下丘脑组织细胞出现空泡化、萎缩现象，内容物不均匀；高剂量试验组细胞空泡化程度更加明显，空泡化细胞数量增多。王水明[18]报道经长期低强度微波辐射后下丘脑可出现空泡化、核萎缩等病变特点。这与本试验观察到的结果相一致。通过透射电镜进一步对下丘脑组织细胞内部进行观察，发现低剂量试验组下丘脑细胞间质和线粒体出现水肿，血管间隙严重扩张，高剂量试验组下丘脑细胞线粒体水肿明显增多，其电子密度降低，核间隙扩张，核膜增厚，核孔增大。结合光镜下观察到的下丘脑细胞萎缩及空泡化现象，说明微波辐射可能通过损伤细胞内的线粒体而引起下丘脑细胞的萎缩和空泡化。
Glu作为哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，存在于所有中枢神经系统(CNS)突触的一半以上，对学习、记忆、睡眠、运动和摄食具有重要作用[19]。GABA、Gly是CNS中的抑制性神经递质[20]，并且多达10%~40%的神经末梢使用GABA作为神经递质来传递“闭合”信号[21]，Gly属于突触后抑制，在感觉运动功能反应中起关键作用。Asp主要分布在内分泌和神经组织[22-23]，参与细胞-细胞信号传导的神经调节[24-25]。四种神经递质的检测结果显示，与对照组相比，低剂量组小鼠脑内四种神经递质的含量均有所增加，但只有Asp和Glu的量显著增加；而在高剂量组小鼠脑内四种神经递质的含量均显著增加。这可能是试验组小鼠细胞出现空泡化和萎缩，精神萎靡不振，发育迟缓等病理表现的重要原因。
辐射停止后继续观察小鼠的行为变化，发现试验组小鼠的精神状态和毛色等表象逐渐恢复正常。到60日龄时，试验组脑组织细胞形态基本恢复正常，细胞内线粒体、细胞核均恢复正常，四种神经递质的含量与对照组相比均不存在显著差异，GABA/Glu比值也恢复正常；仅在高剂量组存在个别空泡化细胞。说明在本试验条件下辐射损伤是可逆的。在现实生活中，手机使用时间越来越长，在这种长时间辐射条件下，是否对脑组织细胞产生非可逆性损伤还需要进一步研究。
4 结论长时间的微波辐射会导致小鼠下丘脑细胞萎缩和空泡化，线粒体出现肿胀现象，同时，使下丘脑内抑制性神经递质的含量增加导致小鼠出现精神异常的表现，但停止辐射一段时间后这些变化可恢复，这为探究微波辐射对下丘脑组织的影响提供了理论依据。
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