一直以来，β-内酰胺类抗生素被认为能够有效地治疗和预防由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)引起的感染性疾病。然而，近年该类抗生素在临床生产中不合理的使用，导致耐药菌株迅速增多，耐药率也不断攀升^[1-3]；出现以MRSA为典型代表的耐药菌株，给临床治疗和用药带来了巨大挑战，已严重威胁到人与动物的公共卫生安全^[4-5]。目前，关于S. aureus耐药机制的研究，主要集中于MRSA^[6]，抑或对大环内酯类药物^[7]及生物被膜的耐药^[8]，对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究，大多聚焦在经典的β-内酰胺酶^[9]和作用靶位的改变^[10]。此外，β-内酰胺类抗生素能否引起细胞壁(cell wall, CW)增厚，机制如何，仅有少数报道^[11]。同时，探究MRSA菌株中是否也存在该种耐药机制，有利于更全面地了解其突出的耐药性。本研究基于2016—2018年间分离得到的牛乳源S. aureus，进行耐药率及多重耐药情况的检测，以基因检测与形态观察结合的手段，揭示本地区S. aureus针对β-内酰胺类抗生素是否存在CW增厚的耐药机制，并进一步确定MRSA菌株是否也具有该种机制，为本地区S. aureus的防控提供一定理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验菌株

分离自2016—2018年间宁夏石嘴山市、银川市、吴忠市及中卫市等地区部分奶牛养殖场临床及亚临床型乳腺炎乳样。

1.1.2 培养基及试剂

氨苄西林、青霉素、头孢唑林、阿米卡星、四环素等14种抗菌药物均购自中国兽医药品监察所；金黄色葡萄球菌显色培养基购自法国CHRO-Magar公司；MH培养基购自青岛海博生物公司；DNA Marker，2×Taq PCR Master Mix，高保真PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase均购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；细菌总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司；SYBR^®Green实时荧光定量PCR预混液购自Thermo Fisher公司；引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要设备

双槽PCR扩增仪、ABI7500荧光定量PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)；电泳及成像系统(美国Bio-Rad公司)；生物型透射电镜(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 方法 1.2.1 细菌的分离鉴定

从宁夏地区部分奶牛养殖场采集临床及亚临床型乳腺炎乳样，经CHRO-Magar金黄色葡萄球菌显色培养基筛选，挑取紫红色的单菌落进行镜检以及纯化培养。以提取的基因组DNA为模板；利用16S rRNA通用引物(F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; R: 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′), nuc基因引物(F: 5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′; R: 5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAG-3′)，配制20 μL反应体系，以55 ℃为最适退火温度，进行基因片段扩增。测序结果上传至NCBI网站，利用BLAST工具进行序列比对。随后, 以高保真酶扩增mecA基因(F: 5′-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′; R: 5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′)，检测MRSA菌株。

1.2.2 药敏试验

根据美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的微量肉汤稀释法对分离鉴定出的261株 S. aureus进行药敏试验，测定其对14种抗菌药物的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration, MIC)。细菌振荡培养10 h，用PBS稀释至0.5麦氏单位，浓度约1×10⁸ CFU·mL^-1；在96微孔板中将所用药液倍比稀释成11个浓度梯度，随后加入稀释菌液至100 μL，并以不含药物的菌液作阳性对照，空白培养基作阴性对照，试验重复3次。MIC结果判定参照CLSI (2013)标准^[12]。

1.2.3 qRT-PCR

将5株高耐(青霉素MIC≥128 μg·mL^-1) S.aureus分别培养于含0和64 μg·mL^-1青霉素的培养基中，37 ℃振荡培养10 h。随后，根据总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，-80 ℃保存备用。为减少对后续试验的干扰，对总RNA进行痕量基因组污染去除，以去除痕量基因组的总RNA为模板，逆转录合成cDNA。最终，qRT-PCR检测CW增厚相关基因pbpB、murG、glmU、atlR的转录丰度，并以看家基因pta作为内参^[13]。所用引物是利用Primer 5.0软件，以文献引物为基础，进行修改、优化及设计。具体引物序列及片段大小等信息见表 1。

1.2.4 透射电镜样本制备

选取CW相关基因转录丰度上调较显著的MSSA JY21菌株和MRSA WLD10 (青霉素MIC值均≥128 μg·mL^-1)分别培养于含青霉素64、128 μg·mL^-1的MH培养基中，经数次传代，待菌株稳定生长。恒温培养后收集细菌，PBS缓冲液漂洗3次，以2.5%戊二醛置于4 ℃低温固定12 h，经1%锇酸染色1 h，50%~90%的乙醇梯度脱水处理，随后依次用不同浓度(1:1和1:2)丙酮与环氧树脂混合液处理。完成后，加100%环氧树脂400 μL置于60 ℃烘箱中聚合48 h，包埋后进行冷冻超薄切片。最终，制备完成的样品在生物型透射电镜下观察并摄片。每个样品选取9个结构典型的菌体，测量其CW厚度。使用IBM SPSS 13.0软件进行数据分析，以P < 0.05作为存在统计学差异。

2 结果 2.1 细菌的分离鉴定

从宁夏地区部分奶牛养殖场采集临床及亚临床型乳腺炎的乳样，经金黄色葡萄球菌显色培养基筛选，镜检以及PCR方法扩增16S rRNA、nuc基因和测序比对，共分离鉴定出261株S. aureus。经进一步检测mecA基因，最终确定9株为MRSA。

2.2 耐药率

261株S. aureus对14种抗菌药物的耐药情况见表 2。由表可知，分离株对β-内酰胺类抗生素的耐药率最为突出，其中对氨苄西林的耐药率最高，达到79.69%，其次是对青霉素(78.54%)；耐药率较高的还有复方新诺明、氟苯尼考、林可霉素。对氨基糖苷类及喹诺酮类药物则比较敏感，敏感率都在60%以上，对万古霉素全部敏感。

2.3 多重耐药情况

261株牛乳源S.aureus对14种抗菌药物的多重耐药情况见图 1。由图可见，多重耐药主要以3、7及8重的菌株居多，所占比例分别为10.73%、16.48%及19.54%。10重及以上耐药的菌株共15株，占5.75%。其中，1株对试验所用的14种药物均表现出耐药。若将同时对3种及以上抗菌药物耐药归为多重耐药，则多重耐药率为69.73%。

2.4 细胞壁结构的变化 2.4.1 qRT-PCR

利用特异的qRT-PCR引物，使用SYBR^®Green染料法检测pta、pbpB、murG、glmU、atlR基因在0和64 μg·mL^-1青霉素浓度下的转录情况，结果显示(图 2)，5株高耐菌株在青霉素浓度为64 μg·mL^-1时，相对于无药物培养，pbpB基因表达上调约3.78倍，murG、glmU基因分别上调约4.12和3.58倍，atlR基因上调约2.99倍。经统计分析，可知pbpB、murG、glmU基因转录丰度均发生极显著变化(P < 0.001)，atlR基因转录丰度极显著升高(P < 0.01)。内参基因pta的转录丰度没有发生明显变化(P>0.05)。

2.4.2 细胞壁增厚

选取的两株细菌MSSA JY21和MRSA WLD10 (图 3)，JY21在64和128 μg·mL^-1药物浓度下均呈现出CW极显著增厚(P < 0.001)，但JY21(128) (厚度为64.32 nm±18.77 nm)与JY21(64) (厚度为51.92 nm±5.18 nm)相比，增厚程度并不显著(P>0.05)；即CW增厚到一定程度时，便不再继续显著增厚。WLD10(128) (厚度为29.88 nm±1.48 nm)与WLD10(0) (厚度为27.52 nm±1.47 nm)相比，CW厚度无显著性差异(P>0.05)；同时，JY21(0) (厚度为25.49 nm±2.3 nm)和WLD10(0) (厚度为27.52 nm±1.47 nm)CW厚度也无显著的差异(P>0.05)；即在自然状态下，MSSA JY21和MRSA WLD10的CW厚度接近一致。但在128 μg·mL^-1药物浓度下，MSSA JY21的CW要远厚于MRSA WLD10 (P < 0.001)。

2.4.3 其他形态变化

JY21(64)和JY21(128)菌株出现CW表面粗糙，松散，有结节状凸起，甚至出现不均匀的增厚，呈现出“花瓣状”(图 4A、B)。JY21菌株在128 μg·mL^-1青霉素浓度下，形态由球形变为梭形、椭球形及杆状；由图 3知，CW厚度增加到一定程度就不再显著增加，开始出现裂隙(图 4C)，并在视野中极少见到横隔膜或是处于分裂期的细菌个体(图 4D~F)。

3 讨论

S. aureus作为引起奶牛乳腺炎的重要病原之一，因具有较高的临床分离率和突出的耐药性，备受人们关注。有关S.aureus针对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究，主要集中于以往经典的耐药方式。对于其他潜在机制的发现以及引起CW增厚的分子机制的研究还很不足。此外，药敏试验呈现出对氨苄西林和青霉素高度的耐药，该情况已经不容忽视。关注MRSA菌株是否也具有该种机制，对其严重耐药性的分析具有重要的意义。因此，基于分离得到的261株牛乳源S.aureus，选取药敏试验中青霉素MIC≥128 μg·mL^-1的菌株，以qRT-PCR方法检测CW合成及增厚相关的基因在青霉素浓度为0和64 μg·mL^-1的培养环境下转录丰度的变化；并结合透射电镜进行形态观察。结果显示，MSSA JY21菌株的CW出现显著的增厚。一定程度上，说明存在该种针对β-内酰胺类抗生素的耐药机制。

同时，MSSA JY21菌株对β-内酰胺类抗生素具有高耐药值，且多重耐药达9重之多；在青霉素亚MIC浓度(64 μg·mL^-1)下，较无药物时出现CW显著增厚；将药物浓度增至MIC (128 μg·mL^-1)时，未出现连续的显著增厚，但与无药物时相比，依然显著。即在一定范围内，CW的厚度随细菌所能耐受药物浓度的升高而显著增加，但超出这一范围，增厚依然发生，而差异不再显著。而耐药值和多重耐药数量均高于JY21的MRSA WLD10菌株，处于同等药物浓度下，却未出现明显的CW增厚。该现象提示，对于MRSA WLD10来说，CW增厚并非重要的耐药机制，很大程度是因其特有的mecA耐药基因以及编码的低亲和力青霉素结合蛋白PBP2a^[14]，使其本身作为青霉素类药物的固有耐药菌株却不发生CW增厚，可被认为进化出了一种更加“高级”的耐药方式。但对于MSSA JY21来说，CW增厚依然对其高度耐药作出了重要贡献。这与Yuan等^[15]的结果不完全一致，很大可能是药物种类不同所致。CW增厚对细菌来说，是一种很不经济的代偿方式，这也就决定撤去药物压力后，细菌将出现一定程度的“返祖现象”^[16]；将JY21(128)与去抗培养30代的JY21(128)共培养，试验结果也证实了这一观点。因此，CW增厚可被认为是一种适应性耐药的表现形式，且一般介导中低水平的耐药^[17-18]；而耐药基因介导较高水平的耐药^[19-22]。由于耐药基因存在和转移，使具有该类基因菌株的耐药性得以稳定维持。

研究发现，青霉素引起CW增厚的原因与万古霉素引起的增厚不尽相同，后者主要是通过“亲和捕获”和“孔隙阻塞”的方式使CW增厚^[23-24]。试验发现的增厚机制主要是肽聚糖的过度合成及细胞自溶素(autolysin, Atl)的合成减少。由于CW的形成受到精确且严格的基因调控，其中glmU和murG基因控制CW中肽聚糖合成所必需的前体物^[25-26]，pbpB基因编码的青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins, PBPs)能促进肽聚糖单体交联形成致密的网状结构^[27]。Atl是维持CW始终处于适宜厚度的关键，其编码基因座中的atlR基因能抑制Atl的合成^[28]，防止正常细胞发生自溶。当基因的转录水平变化时，可反映细胞内与之相关生命活动的变化^[29]。即较强的药物选择压力，致使pbpB基因转录丰度上调了约3.78倍，其编码的青霉素结合蛋白PBP2具有转肽酶活性，在肽聚糖合成后期发挥着重要的作用^[27]。PBP2转肽作用增强；引起CW深部的肽聚糖交联度升高，肽聚糖层由深部向外增厚。随着glmU和murG基因转录丰度的上调，肽聚糖单体UDP-GlcNAc合成增多^[25]，更多的Lipid Ⅰ经MurG催化而形成Lipid Ⅱ^[26]，参与肽聚糖的合成，同样导致肽聚糖层显著地增多增厚，阻碍药物分子进入CW深部，从而实现细菌对药物的耐受。Atl编码基因座中atlR基因的转录丰度显著上调，可抑制其下游的atl基因，进而引起Atl合成减少^[28]，造成CW厚度增加。同时，表面陈旧的肽聚糖层不能被及时清除，出现不均匀的堆积^[30-31]，因而出现CW表面粗糙，有结节状凸起(图 4A、5)。

值得注意的是，细菌在128 μg·mL^-1的药物浓度下，CW不再显著增厚，推测该种方式已不能很好地拮抗高浓度药物形成的胁迫压力，此时很可能启动其他更为“高级”的耐药机制。该种表现也与CW增厚介导中低水平耐药的结论相契合。转而出现其他方面的形态改变。包括：(1) S. aureus由球形变为梭形、椭球形及杆状。推测可能是较高的环境压力引起细菌生长放缓，分裂过程受到抑制；即过于坚厚的CW及低水平的Atl，使得CW难以向内凹陷并形成横隔膜，阻碍细胞正常分裂成两个子细胞^[31]。将JY21(0)与JY21(128)共培养，发现JY21(128)生长缓慢，且形成的菌落很小；振荡培养的菌液离心后，重悬时发现，细菌呈现团块状。(2)处于该浓度下的细菌，视野中很少见到横隔膜，也印证了细菌的分裂受到抑制的观点。(3) JY21(128)相比于JY21(64)，CW除不再显著增厚外，其增厚也不均匀，呈现出“花瓣状”，但原因尚不清楚。(4) 图 4C表现出CW与细胞膜的间隙略微增大，且CW出现皲裂；推测是由于肽聚糖层过厚而难以稳定地维持，交联发生断裂，故而出现裂隙(图 5)，其机制还有待进一步研究。

4 结论

从宁夏地区分离得到261株牛乳源S. aureus，对β-内酰胺类抗生素表现出较强的耐药性；对14种抗菌药物具有较高的多重耐药率；试验结果表明，针对β-内酰胺类抗生素，存在细胞壁增厚的耐药机制，属于适应性耐药。增厚的原因主要是肽聚糖的过度合成及细胞自溶的减少。对于MSSA JY21菌株来说，细胞壁增厚是针对β-内酰胺类抗生素重要的耐药机制；而对于MRSA WLD10并非如此。