, WANG Shujuan, YAN Ruoqian*
, BAN Fuguo, ZHAO Xueli, XIE Caihua, WANG Huajun, WANG Dongfang
猪伪狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是一种由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、流产、死胎等为主要临床症状的高度接触性、急性传染病[1]。妊娠母猪感染PRV后主要症状为流产、产弱仔、死胎以及木乃伊胎等；新生仔猪感染最为严重，多呈现急性致死性经过，有典型的神经症状、麻痹，死亡率近100%[2]。PRV在世界范围内已广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失，是影响养猪业健康发展的重大传染病之一[3]。
从匈牙利引进的Bartha-K61 gE基因缺失弱毒活疫苗及武汉科前HB98株疫苗等对我国PR疫情的控制发挥了重要的作用[4]。但自2011年以来，PR又在我国许多地区(包括河南、河北、山东、山西等在内)的多个猪场中呈暴发式流行[5]，给我国的养猪业带来了严重的经济损失。《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》总体策略中重点要求规模化猪场猪伪狂犬病逐步实现从有效控制到净化消灭。因此，建立一种敏感、简便、快速的PRV抗体检测方法能够更好地用于准确高效地评估猪伪狂犬病的预防、控制及净化效果。
PRV基因组序列编码的11种糖蛋白中gB蛋白是PRV最为保守的蛋白之一[6]，可以诱导动物机体产生中和抗体[7]，临床上常常以gB蛋白为检测抗原来评价疫苗免疫效果。现有技术中，ELISA方法被国际兽医局(OIE)列为监测猪伪狂犬病的首选方法，也是我国应用最为广泛的方法。目前虽然国内外有检测PRV gB抗体的ELISA试剂和方法[8]，但过程相对繁琐，操作时间长，降低了临床高通量检测的效率。
化学发光酶联免疫方法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)是将化学发光体系与酶联免疫分析技术相结合，以化学发光底物发光强度与反应物浓度的正比关系，检测微量抗原或抗体的一种新型免疫测定技术[9]。该技术与普通间接ELISA检测方法相比，操作简单，反应时间短；可通过绘制标准曲线实现定量分析[10]；敏感性与精确度明显优于其他方法，标准阳性样本检出率高达100%[11]；检测范围很广，可达6个数量级[12]。因此，该方法已被广泛应用于人体外诊断试剂，如肿瘤标记物检测，丙型肝炎、艾滋病抗体检测[13]，食品安全检测等项目，但因其在动物疫病检测领域仍处于萌芽阶段，应用尚不广泛。
为了提高PRV gB抗体检测试剂的灵敏度、准确度及反应效率，本研究根据gB全长基因BLAST比对结果选择高度保守的区域进行扩增表达，以重组表达纯化的猪伪狂犬病病毒(PRV) gB重组蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体，并通过酶标抗体与血清中gB抗体同时竞争性地与包被抗原结合，以酶促鲁米诺发光底物化学发光系统反映出gB抗体的含量，成功建立了一种敏感、快速、准确的PRV-gB-CLEIA检测方法。
1 材料与方法 1.1 病毒、细菌、细胞、血清及实验动物PRV流行变异毒株HeNZK-2014由河南省动物疫病预防控制中心分离保存[14]；E. coli BL21(DE3)、pQE30载体、pQE30-rgB和pQE30-rgE蛋白[15]、骨髓瘤细胞(SP2/0)由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存；猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)阳性血清由河南省动物疫病预防控制中心鉴定、保存；PRV gB抗体阳性血清国家参考品(Z89)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)阳性血清、SPF猪血清购自中国兽医药品监察所；猪源大肠杆菌菌体蛋白、大肠杆菌BL21(DE3) plysS阳性血清由西南民族大学重点医学实验室馈赠。采自河南省背景清晰猪场的PRV临床免疫抗体阳性血清和PRV阴性血清均经过进口商品化试剂盒检测；8~10周龄雌性BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心。
1.2 主要仪器和试剂预染蛋白质Marker、BCA蛋白定量试剂盒等为TaKaRa公司产品；羊抗鼠IgG(HRP标记)二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；PEG2000、NaSCN、牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)、Casein等购自Solarbio公司；胎牛血清购自Seropro公司；DMEM、DMSO购自武汉博士德生物工程有限公司；HT、HAT、8-Azaguanine、单抗亚类鉴定试剂盒为美国Sigma公司产品；高速蛋白层析纯化仪(NGCTM Chromatography Systems)、SUPrATM Cartridge亲和层析柱购自美国Bio-Rad公司；鲁米诺发光底物液由洛阳莱普生信息科技有限公司提供；LUMO化学发光仪购自郑州安图生物工程股份有限公司；PRV gE抗体ELISA检测试剂盒为荷兰百测产品，PCV 2型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物有限公司，PRV gB抗体ELISA检测试剂盒、PRRSV抗体ELISA检测试剂盒、CSFV抗体ELISA检测试剂盒购自美国IDEXX生物科技公司。
1.3 抗PRV gB蛋白单克隆抗体的制备根据本实验室的单克隆抗体制备方法[16]，按照既定的免疫程序将经灭活浓缩的PRV流行变异毒株HeNZK-2014病毒培养液乳化后免疫BALB/c小鼠，进行融合、亚克隆和杂交瘤细胞的筛选。参照曾报道的方法[17]，以纯化的rgB蛋白为包被抗原、羊抗鼠IgG(HRP标记)为酶标二抗建立筛选抗体用的间接ELISA方法，用于免疫小鼠血清抗体与杂交瘤细胞上清单抗效价的检测。将经5次亚克隆后阳性率达到100%时，即可进行扩大培养。采用体内诱生腹水法对可稳定传代的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀方法对无菌采集的经单抗亚类鉴定为IgG亚型的腹水进行粗纯化，高速蛋白质层析纯化仪结合SUPrATM Cartridge亲和层析柱进一步纯化[18]，脱盐处理并用BCA法测定最终单抗浓度。间接ELISA方法对单抗效价进行测定，以SP2/0细胞诱生的小鼠腹水为阴性对照。
1.4 抗PRV gB蛋白单克隆抗体的鉴定 1.4.1 Western blot分析以pQE30/BL21空载体、pQE30-rgB蛋白作为抗原，以制备的抗gB单克隆抗体为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG为酶标二抗，Western blot鉴定单抗的反应性。
1.4.2 特异性鉴定用大肠杆菌菌体蛋白包被板及PRV gE、PCV2、PRRSV、CSFV等4种病原的抗体检测试剂盒鉴定单克隆抗体的特异性，同时设空白及阴、阳性对照进行分析。
1.4.3 应用性鉴定以纯化的rgB蛋白为包被抗原，分别先加入SPF猪血清、50份PRV免疫猪血清、30份PRV阴性猪血清，再加入待检单抗，最后加入羊抗鼠IgG(HRP标记)为酶标二抗，显色终止读取OD450 nm。当加入PRV免疫猪血清孔的OD450 nm值低于加入PRV阴性猪血清和SPF猪血清孔OD450 nm值一半左右时，说明此gB单抗可被猪血清中免疫抗体特异性地阻断，即为针对特异性gB抗原位点的单抗，可用于后续建立方法的应用。
1.5 PRV gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法(CLEIA)的建立 1.5.1 最佳浓度的确定以pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将rgB蛋白分别按2、1、0.5、0.25 μg·mL-1浓度稀释并包被化学发光板，分别将5份PRV免疫猪血清、5份PRV阴性猪血清与含HRP标记单抗的酶结合物1:1混合后加入100 μL于发光板中，置37 ℃反应30 min，PBST洗涤后加鲁米诺化学发光底物，化学发光免疫分析仪测定结果，以最大N/P化学发光值比值所对应的浓度确定为最佳包被浓度；将辣根过氧化物酶标记的PRV gB单克隆抗体按1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000稀释，方法同上，确定最佳酶结合物工作浓度。
1.5.2 最佳缓冲液的确定分别以含1%明胶、1%酪蛋白、2%牛血清白蛋白(BSA)、1%胰酪胨的1%蔗糖-PBST作为封闭液，以分别含1%明胶、1.5%酪蛋白、3%牛血清白蛋白(BSA)、1%胰酪胨的Tris-Cl作为酶结合物稀释液，方法同“1.5.1”，以最大N/P化学发光值比值所对应的缓冲液作为最佳缓冲液。
1.5.3 最佳反应时间的确定待检血清和酶结合物分别于37 ℃反应15、30、60 min，作2组重复试验；加入底物后15~25 ℃下避光分别作用3、5、10 min，每个时间点作2组重复，以最大N/P值所对应时间为待检血清与酶结合物最佳反应时间及最佳底物作用时间。
1.5.4 校准品的制备采用猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性血清国家参考品(Z89)作为校准品溯源血清，赋值为5 000 NCU·mL-1，用校准品稀释液对血清进行倍比稀释，测定稀释血清的发光值，以抗体剂量值为横坐标，发光值为纵坐标，运用ELISACalc软件进行分析，通过四参数曲线拟合方法拟合出校准曲线[19]。从曲线中选择出5个特征点，用校准品稀释液将标准阳性血清根据剂量值按比例分别稀释，作为校准品2~校准品6，用校准品稀释液将SPF猪血清1:20倍稀释制备校准品1。根据国家参考品检测值和校准品绘制的校准曲线回算抗体剂量值关系，标定合格后将校准品定量分装，-20 ℃以下保存备用。
1.5.5 临界值的确定以确定的最佳反应条件和试剂检测背景清晰的采集自规模化猪场经猪伪狂犬疫苗免疫的猪血清176份，用血清中和试验(SNT)鉴定均为PRV抗体阳性；检测采集未经猪伪狂犬疫苗免疫且无母源抗体的仔猪血清167份，用血清中和试验鉴定均为PRV抗体阴性；检测用血清中和试验证实为PRV抗体阳性且商品化gB抗体检测试剂盒检测为弱阳性的血清30份，测定并根据标准曲线计算出抗体剂量值，以“NCU·mL-1”表示。采用SPSS 16.0软件对所有血清样本的抗体剂量值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以约登(Youden)指数[(Youden指数=敏感性-(1-特异性)]最大的点作为阴阳性判断的临界点，对应的抗体剂量值即为临界值[20]。
1.5.6 特异性试验用建立的PRV gB竞争CLEIA分别检测PPV、PCV2、CSFV、PRRSV阳性血清各10份，大肠杆菌阳性血清2份，同时用商品化gB抗体检测试剂盒进行平行检测，验证建立方法的特异性。
1.5.7 敏感性试验将国家参考品用酶结合物稀释液按1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1 024、1:2 048、1:4 096稀释，分别用建立的PRV gB竞争CLEIA以及商品化gB抗体检测试剂盒进行检测，同时以血清抗体中和试验进行鉴定，验证建立方法的敏感性。
1.5.8 重复性试验用3个批次PRV gB竞争CLEIA试剂分别检测已知背景猪血清30份，其中阴性、强阳性、弱阳性样本各10份，每份血清样品作3次重复检测，对结果进行统计学分析，计算批间变异系数(coefficient of variation, CV)，CV(%)=(标准差/平均值)×100%。
1.5.9 保存期研究将样本稀释液、经包装的包被发光板、校准品、酶结合物溶液、发光底物组装配套，从3个批次PRV gB竞争CLEIA试剂中随机抽取3套试剂分别放置2~8 ℃保存，分别于保存1、2、3、6、9、12、15个月进行检验，根据敏感性和特异性试验结果确定该方法试剂的保存期。
1.5.10 比对试验分别采用建立的PRV gB竞争CLEIA、商品化gB抗体检测试剂盒与血清中和试验分别对从不同猪场采集的180份猪血清进行检测，确定两者之间及与中和试验之间的符合率[21]。
2 结果 2.1 抗PRV gB蛋白单克隆抗体的制备选择抗体效价最高达1:32 000的小鼠，取其脾进行融合，融合率达100%。经筛选最终获得1株能特异性分泌IgG 2a亚型gB单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E9H7，其上清效价高达1:32 000，反复冻融15次及连续传代15代以上均可稳定分泌抗体，效价仍高达1:16 000；制备腹水获取的单克隆抗体经纯化后纯度高达90%以上，见图 1A；经脱盐浓缩后浓度高达11.2 mg·mL-1，效价高达1:20万。Western blot结果显示，6E9H7单抗可与rgB蛋白特异性地反应，而与pQE30空载体无非特异性交叉反应，见图 1B。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.纯化后6E9H7株单抗；2. rgB蛋白；3. pQE30空载体对照 M.Protein marker; 1. The purified monoclonal antibody of 6E9H7 strain; 2. rgB protein; 3. pQE30 control 图 1 6E9H7株单抗纯化后SDS-PAGE(A)及Western blot (B)鉴定 Fig. 1 Purification of purified McAb of 6E9H7 strain identified by SDS-PAGE (A) and Western blot (B) |
6E9H7株单抗可与rgB蛋白产生特异性反应，而与PRV gE抗原等其他4种抗原及大肠杆菌菌体蛋白均未发生非特异性反应。
2.3 单抗的应用性鉴定结果显示，加入50份PRV免疫猪血清孔的OD450 nm值(平均值0.134~0.489)均低于加入SPF猪血清孔OD450 nm值(1.827)和30份PRV阴性猪血清OD450 nm值(平均值1.023~1.989)的一半。6E9H7株单抗能够与gB蛋白的抗原位点结合，可用于后续方法建立的应用。
2.4 PRV gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法(CLEIA)的建立 2.4.1 最佳浓度的确定N/P值随着酶标单抗浓度降低而下降，随着包被浓度降低先上升后下降，rgB蛋白包被浓度为0.5 μg·mL-1，酶标单抗稀释度为1:500时，N/P值最大。因此，确定最佳包被浓度为0.5 μg·mL-1，酶标单抗稀释度为1:500。
2.4.2 最佳缓冲液的确定含1%胰酪胨的封闭液有效降低了本底值，N/P值最大，故将含1%胰酪胨的1%蔗糖-PBST作为最佳封闭液；含3%牛血清白蛋白(BSA)的酶结合物稀释液有效提高了敏感性，N/P值最大，故将含3%牛血清白蛋白(BSA)的Tris-Cl作为酶结合物稀释液。
2.4.3 最佳反应时间的确定待检血清、酶结合物与抗原在37 ℃条件下作用30 min时，N/P值最大，因此37 ℃反应30 min作为待检血清和酶结合物混合物与抗原的最佳反应时间；加入底物后作用5 min，N/P值最大，因此确定底物最佳作用时间为5 min。
2.4.4 校准品的制备将校准品溯源血清进行4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048倍稀释，绘制出校准品的四参数拟合曲线。根据曲线看出抗体剂量值≤100 NCU·mL-1时发光值区分最为明显，因此以100 NCU·mL-1为起点[猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性血清国家参考品(Z89)稀释50倍]，依次配制不同抗体剂量值的血清样品，重复多次绘制四参数拟合曲线，当抗体剂量值在5、12、25、50和100 NCU·mL-1时，所对应的坐标点重复性最好，且曲线的r2均＞0.99，见图 2。配制6批次校准品，制备校准品抗体剂量值与理论抗体剂量值的偏差在7.0%以内，结果见表 1。
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图 2 校准品(抗体剂量值为0~100 NCU·mL-1)绘制曲线图 Fig. 2 The curve drawed by the calibrator (antibody dose value: 0~100 NCU·mL-1) |
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表 1 配制校准品理论抗体剂量值与实测剂量值比较 Table 1 Comparision between the theoretical antibody dose value and the measured dose value of the prepared calibrator |
利用SPSS 16.0软件对检测结果进行数据分析，以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，绘制ROC曲线，见图 3。计算每个临界值的Youden指数，Youden指数最大为0.98，所对应抗体剂量值为9.99 NCU·mL-1，见表 2(仅显示部分)。因此，将本方法的临界值确定为10，最终将本方法的判定标准定为：样本抗体剂量值≥10 NCU·mL-1时，为猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性；样本抗体剂量值＜10 NCU·mL-1时，为猪伪狂犬病病毒gB抗体阴性。在此判定标准下，此临界值对应的敏感性为98.3%，特异性为100%。
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图 3 ROC曲线绘制结果 Fig. 3 The result of ROC curve plotted |
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表 2 不同剂量值所对应的敏感性、特异性及Youden指数 Table 2 Sensitivity, specificity and Youden index according to different dose values |
结果见表 3，建立的PRV gB竞争CLEIA检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌阳性血清均为阴性，无交叉反应。
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表 3 特异性试验结果 Table 3 The result of specificity test |
建立的PRV gB竞争CLEIA与中和试验检测结果一致，均可检测到最大稀释倍数为1:2 048的国家参考品，而市售的商品化gB抗体检测试剂盒仅可检测到1:1 024倍稀释的国家参考品，见表 4。
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表 4 敏感性试验结果 Table 4 The result of sensitivity test |
建立的PRV gB竞争CLEIA批内变异系数在1.13%~9.47%，小于10%；批间变异系数在2.43%~14.07%，小于15%。
2.4.9 保存期研究3套批次PRV gB竞争CLEIA试剂于2~8 ℃放置保存15个月，仍可检测到最大稀释倍数为1:2 048的国家参考品，检测猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌阳性血清，剂量值均小于10 NCU·mL-1，无交叉反应。因此，将该方法试剂的保存期确定为12个月。
2.4.10 比对试验检测结果见表 5，建立的PRV gB竞争CLEIA检测结果与中和试验阳性符合率为94.00%，阴性符合率为96.92%，总符合率为96.11%；市售的ELISA试剂盒检测结果与中和试验阳性符合率94.00%，阴性符合率为95.38%，总符合率为95.00%。建立的PRV gB-CLEIA与中和试验符合率优于商品化ELISA试剂盒。
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表 5 两种ELISA方法与中和试验结果的比较 Table 5 Comparison of the results of the two ELISA methods and the neutralization test |
阻断ELISA方法是我国用于PRV gB抗体评估检测最为广泛的方法，但该方法检测线性范围仅限于0~4，操作时间大于2 h，仅能定性检测。各种PCR方法对设备和人员要求较高[22]。CLEIA作为一种在人医领域得到广泛应用的检测方法，相比于普通ELISA方法，其具有敏感性高、反应时间短、检测范围广、操作简单等优点，其敏感性可高于ELISA方法一个数量级[23]，且能够根据质控品绘制的标准曲线精确地实现抗体水平的定量检测[24]。目前，CLEIA在国内外动物疫病检测领域仍处于萌芽发展阶段。Zamora和Hartung[11]用CLEIA检测屠宰猪肉样品中的沙门菌，发现CLEIA的敏感性和特异性均优于间接ELISA方法；刘泽众等[25]成功建立了检测H1N1禽流感病毒、布鲁菌、结核杆菌等病原的CLEIA技术。
本研究建立的CLEIA选择原核表达的重组PRV gB结构蛋白为包被抗原，而非使用PK-15细胞培养的PRV全病毒蛋白，大大降低了病毒扩散的风险。建立竞争ELISA方法的关键在于选用酶标单抗的特异性、敏感性、稳定性、纯度及应用性是否能满足应用的要求，本研究选用的单抗特异针对gB蛋白的抗原位点，与其他4种抗原无非特异性交叉反应，抗体效价大于1:20万，纯度大于95%，能够被PRV gB阳性血清特异地阻断，为CLEIA的建立提供了可靠的原材料。
人体外诊断试剂确定临界值统计学方法有很多，如C50法、阴性对照法、ROC曲线法等[26]，其中ROC曲线可清晰得出不同发光值所对应的方法敏感度和特异度，因而被认为是最佳方法，但其应用前提是要收集大量已知背景的临床血清，这成为了许多实验室面临的难题[27]。本课题组花费两年时间在不同规模猪场收集已知背景的临床样品，并使用商品化试剂盒和中和试验逐一进行检测，将检测结果与背景一致的样本分类汇总，作为用来确定临界值的临床样本。将CLEIA检测结果导入SPSS软件，绘制出ROC曲线，计算出不同切点对应的Youden指数，并选择其最大的对应切点作为建立方法的临界值。Youden指数常用于人体外诊断试剂方法真实性的评价，表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力，指数越大说明真实性越大[28]。为了保证建立方法的准确性，本研究在对建立方法进行敏感性考核和与其他方法符合率试验时，均选择了金标准中和试验和市售商品化试剂盒作为比较对象，保证检测指标的准确性；本研究首次实现了PRV gB抗体的定量检测，可将每份血清中的PRV gB抗体定量至抗体剂量(NCU·mL-1)，检测范围扩大至发光值0~106。最终成功建立的PRV gB竞争CLEIA方法敏感、特异、稳定，其敏感性与中和试验一致，且优于市售商品化ELISA试剂盒；检测其他抗原血清无交叉反应性；批间变异系数不高于15%，2~8 ℃放置保存15个月后的性能指标保持不变。市售ELISA试剂盒临床样本检测结果与中和试验总符合率为95.00%，而建立的PRV gB竞争CLEIA与中和试验总符合率高达96.11%。该方法不仅快速、高效、简便，而且更加敏感、准确，能够较好地在动物疫病防控一线工作中推广与应用。
4 结论成功建立了基于单抗的PRV gB抗体一步法竞争CLEIA检测方法，该方法敏感、特异、准确、稳定，操作时间小于45 min，实现抗体剂量值的定量检测，检测临床样品结果与金标准中和试验完全一致，为PRV gB抗体的快速定量检测提供了一个科学可靠的技术手段。
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