2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室, 兰州 730046
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
塞内卡病毒A(Seneca virus A，SVA)是微RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一家族成员，临床上主要表现为猪的蹄冠部和鼻部的水泡病变、伴有跛行、厌食以及嗜睡等，并且感染仔猪可引起新生仔猪腹泻且死亡率增加[1-3]。SVA感染引起猪的临床症状与口蹄疫、猪水泡病以及水泡性口炎等我国规定的一类疫病难以区分[4]，并与口蹄疫病毒存在混合感染，严重阻碍了口蹄疫的净化。SVA在2015年首次暴发于我国广东省某猪场，发病育肥猪临床表现为水泡症状及新生仔猪的死亡[5]，随后陆续在我国福建[6]、湖北[7]、河南[8]、黑龙江[9]等省暴发SVA的感染。目前，郑海学团队Yang等[10]在国内外首次报道了SVA灭活疫苗的研制及其免疫效果评价，通过中和试验评估灭活疫苗在猪体的免疫原性，并用SVA CH/FJ/2017株攻毒免疫猪，与未免疫试验对照组相比，免疫含有油佐剂的灭活疫苗(2 μg·剂-1)可以诱导宿主产生较高的中和抗体，并且能够抵抗攻毒毒株的攻击，产生良好保护功效，为后期研制SVA疫苗奠定了基础。在此之前，Poirier等[11]将SVV-001全长克隆到T7核心启动子中，成功建立了SVV-001全长cDNA感染性克隆pNTX-09，并在SVV-001全基因组2A序列之后引入GFP和口蹄疫病毒2A基因，成功构建了表达GFP标记的重组病毒SVV-GFP。Chen等[12]用同样的研究方法以当地SVA流行的毒株KS15-01构建了全长cDNA感染性克隆pks15-01-Clone，并利用反向遗传学技术以pks15-01-Clone作为骨架在2A和2B之间引入EGFP基因，成功构建表达EGFP标记的重组病毒(vKS15-01-EGFP)，并与亲本病毒KS15-01相比，重组病毒pks15-01-Clone和vKS15-01-EGFP均能在体外和体内有效复制。感染亲本病毒KS15-01的宿主中可观察到背部和鼻部的水泡，而感染重组病毒vKS15-01-Clone或vKS15-01-EGFP的宿主中均未观察到水泡等临床症状，这表明SVA感染性cDNA克隆可以作为外源基因表达的病毒骨架以及作为研究新型疫苗的重要工具。
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是微RNA病毒科口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的家族成员，主要感染猪、牛、山羊等偶蹄类家畜，引起一种高度接触性水泡性疾病[13-15]。FMDV衣壳由60个拷贝的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1位于G-H环的免疫位点可诱导宿主激发中和抗体[16]。而G-H环是FMDV衣壳表面的一个突出部分，横跨140—160位氨基酸周围约有20个残基[17]，并含有一个高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)基序，它能与细胞表面整合素受体结合，并有助于诱导中和抗体的产生[17-18]。Bittle等[19]首次将O型FMDV VP1蛋白上的140—160位氨基酸(AA)线性合成的肽免疫豚鼠，可诱导豚鼠产生中和抗体，从而抵抗FMDV的攻击。Shao等[20]利用同样含有O型FMDV VP1蛋白上的141—160位AA和O型FMDV的猪免疫球蛋白G(IgG)重链恒定区成功构建重组表位疫苗，免疫宿主后也能诱导宿主产生高水平的抗FMDV特异性中和抗体，并能够抵抗FMDV的攻击。因此，G-H环是研制新型FMD疫苗的重要免疫原性区域[21]。
FMDV和SVA均可引起猪群的水泡性疾病，感染后猪发病的临床症状难以区分，且SVA在我国近年来各省份的流行不断扩大，对该类疾病的防控提出了挑战。随着病毒基因工程和分子生物学技术的进步，利用病毒反向遗传技术构建嵌合表达外源抗原蛋白或嵌合表位疫苗已有较多报道[22-23]。因此，本研究首次利用反向遗传学技术以SVA CH/FJ/2017株全长cDNA感染性克隆作为骨架，选择已报道的FMDV特异性B细胞表位构建了嵌合FMDV抗原表位的重组质粒，并成功拯救出重组病毒，然后对拯救的重组病毒进行鉴定，为微RNA病毒科嵌合表位毒株的构建和疫苗研究奠定了理论和实验基础。
1 材料与方法 1.1 质粒、细胞和病毒SVA CH/FJ/2017(登录号：KY747510.1)病毒由口蹄疫与新发病流行病学团队分离、鉴定与保存，SVA CH/FJ/2017毒株的全长cDNA感染性克隆pSVA由口蹄疫与新发病流行病学团队构建并保存，猪肾细胞(IBRS-2)由口蹄疫与新发病流行病学团队保存。
1.2 主要试剂限制性核酸内切酶购自NEB公司，Plasmid Purification Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit和Viral RNA Kit均购自OMEGA公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞和低分子量蛋白质Marker购自全式金生物科技股份有限公司。DMEM细胞培养基和0.25%胰酶溶液购自GIBICO公司，胎牛血清购自BI公司，青霉素和链霉素溶液、Lipofectamine2000和Opti-MEM Ⅰ Medium均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG抗体购自博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自Abcam公司。FMDV VP1高免兔血清由口蹄疫与新发病流行病学团队制备并保存。
1.3 重组质粒的构建参考相关文献扩增白蛋白信号肽(human albumin signal peptide, HAS)基因[24-25]和O型FMDV的B细胞表位(OB)[24, 26]基因(VP1的135—160位、200—213位AA)，并用Linker进行连接。由北京金唯智生物科技有限公司合成的基因片段质粒pHAS-OB连接在过渡的T克隆载体上。用NdeⅠ与PpuMⅠ酶切pHAS-OB后，回收约2 378 bp的DNA片段，并插入到用同样酶消化的pSVA质粒中，并通过T4 DNA连接酶进行连接，构建出重组质粒pSVA-HAS-OB。转化至克隆菌株DH5α，并进行PCR鉴定以及双酶切鉴定，初步双酶切鉴定正确的重组质粒送至杨凌天润奥科生物科技有限公司对插入目的基因片段进行测序验证。
1.4 重组病毒的拯救当IBRS-2细胞(铺于6孔板)覆盖底部80%~90%时，取2 μg鉴定正确的重组质粒pSVA-HAS-OB，用Lipofectamine2000转染IBRS-2细胞。转染6 h后更换为含2%FBS的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。当约95%的细胞出现明显的细胞病变(cytopathic effects，CPE)时，收获病毒，反复冻融3次后在IBRS-2细胞上连续传代，每代病毒样品于-80 ℃保存备用，收获的重组病毒命名为rSVA-HAS-OB。
1.5 拯救重组病毒的鉴定 1.5.1 重组病毒的RT-PCR扩增与测序鉴定提取重组病毒感染细胞的病毒RNA，针对基因插入位点设计特异性PCR引物，rSVA-F: 5′-GATCTGGAATTCGCCGTGGG-3′，rSVA-R：5′-GGGCCAAATTAGTCTTTCCCAGT-3′。然后用One Step RT-PCR扩增重组病毒插入基因片段，1%琼脂糖凝胶纯化回收后送杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。
1.5.2 间接细胞免疫荧光检测将IBRS-2细胞(3.5 cm共聚焦小皿)培养至汇合80%的细胞单层时，将重组病毒和亲本病毒以MOI=0.1感染量接种细胞，同时设立正常的细胞对照。37 ℃、5% CO2细胞培养箱连续培养12 h后弃上清，用1×PBS洗细胞3次，加入4%多聚甲醛室温下固定30 min，0.02%的Triton X-100通透5 min，5%的BSA封闭1 h，然后分别用1:100倍稀释的兔抗FMDV VP1血清4 ℃孵育过夜，1:500倍稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG抗体常温下避光孵育1 h后DAPI染核5 min。以上每一步骤完成后均用1×PBS洗涤3次，每次10 min。最后用免疫荧光倒置显微镜观察荧光试验结果，检测FMDV-VP1抗原蛋白的表达。
1.5.3 嵌合抗原蛋白的外源基因的Western blot鉴定收取重组病毒rSVA-HAS-OB和亲本病毒SVA CH/FI/2017感染的IBRS-2细胞，按照Western blot操作方法处理细胞蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，通过湿转法将其转至硝酸纤维素(NC)膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后分别用1:1 000倍稀释的兔抗FMDV VP1血清作为一抗，4 ℃孵育过夜，用1:10 000倍稀释的HPR标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗，37 ℃孵育1 h。以上每一步骤完成后均用TBST洗膜3次，每次10 min，然后用高分辨图像采集系统进行ECL化学发光法显影并保存。
1.5.4 重组病毒遗传稳定性分析取传至第5、10、15、20和25代的重组病毒rSVA-HAS-OB的细胞毒液，收集的细胞毒液用RNA试剂盒提取病毒RNA，扩增的引物rSVA-F: 5′-GATCTGGAATTCGCCGTGGG-3′，rSVA-R：5′-GGGCCAAATTAGTCTTTCCCAGT-3′，然后用One Step RT-PCR扩增特异性目的片段，其产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行目的片段大小的鉴定，并将鉴定大小正确的PCR产物纯化回收后送公司测序，比较重组病毒连续传代后插入的序列和预期序列是否一致。
1.6 重组病毒的增殖特性 1.6.1 病毒蚀斑试验将长满的IBRS-2细胞消化后制成细胞悬液，以1×106个·孔-1加入6孔板中，置于37 ℃ 5% CO2的细胞培养箱中培养48 h。取第5代重组病毒rSVA-HAS-OB和亲本病毒SVA CH/FJ/2017分别做10倍梯度稀释，用无血清的DMEM洗涤长满的IBRS-2细胞后，分别取900 μL 10-2~10-7的病毒液接种每孔细胞，每个梯度设2个重复孔，继续置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中吸附1 h，期间每隔10 min摇动1次。随后弃每孔毒液用无血清的DMEM洗细胞一次，添加1.2%黄芪胶2 mL，置于37 ℃ 5% CO2的细胞培养箱中培养48 h，弃黄芪胶加入2 mL固定液(50%丙酮+50%甲醇)于－20 ℃固定30 min，弃固定液加入2 mL结晶紫染液染色60 min，最后用清水冲洗，自然晾干后观察重组病毒与亲本病毒蚀斑表型并拍照。
1.6.2 病毒一步生长曲线以MOI=0.5的病毒感染量将重组病毒rSVA-HAS-OB和亲本病毒SVA CH/FJ/2017接种于铺在3.5 mm小皿中的单层IBRS-2细胞，吸附2 h后弃去病毒液，用无血清DMEM洗涤细胞2次后添加2 mL无血清DMEM培养基，并在感染后4、8、12、16、20、24、30和36 h收获病毒，反复冻融3次后，离心收集上清液。将收获的病毒进行10倍梯度稀释，每个稀释度重复3次测定各时间点病毒的TCID50，统计数据后绘制相应病毒的一步生长曲线。
1.7 统计与分析使用SPSS 13.0软件分析试验数据，采用t检验方法，比较各组数据的差异。
2 结果 2.1 重组质粒的酶切鉴定将重组质粒pSVA-HAS-OB用NdeⅠ与PpuMⅠ酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶核酸电泳结果显示，切出2 378和8 000 bp的条带，与预期大小一致(图 1)。将双酶切鉴定正确的重组质粒送至杨凌天润奥科生物科技有限公司测序，结果表明目的基因的FMDV抗原表位序列成功插入到目标载体中。
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M.DNA DL10000相对分子质量标准；1.重组质粒pSVA-HAS-OB NdeⅠ、PpuMⅠ酶切结果 M.DL10000 DNA marker; 1.The recombinant plasmid pSVA-HAS-OB digested by NdeⅠ and PpuMⅠ 图 1 重组质粒pSVA-HAS-OB的酶切鉴定 Fig. 1 Identification of recombinant plasmid pSVA-HAS-OB by enzymatical digestion |
将测序鉴定正确的重组质粒pSVA-HAS-OB转染IBRS-2细胞后，在48 h内出现明显的CPE，细胞变圆、脱落、呈葡萄串状以及漂浮大量病变细胞在液面，而正常IBRS-2细胞形态正常，未变圆和脱落。连续传代5次(F5)后，出现98%CPE的时间趋于稳定，约为13 h，病变也更加典型。
2.3 拯救重组病毒的鉴定 2.3.1 重组病毒的RT-PCR扩增与测序鉴定根据针对SVA设计的引物，用One Step RT-PCR扩增重组病毒所含的FMDV抗原表位序列基因，1%琼脂糖凝胶核酸电泳结果显示，可得到长约1 752 bp的目标片段(图 2)。将目的片段正确的PCR产物纯化回收后送至公司测序，测序的结果分别同参考序列进行比对，结果表明插入FMDV抗原表位的序列没有发生缺失和突变，插入的HAS序列发生2个氨基酸缺失和2个碱基突变，但对重组病毒的拯救没有影响。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准; 1. rSVA-HAS-OB重组病毒；2.SVA CH/FJ/2017亲本病毒；3.对照IBRS-2细胞 M.DL2000 DNA marker; 1.Recombinant virus of rSVA-HAS-OB; 2.Parental virus of SVA CH/FJ/2017;3. Normal IBRS-2 cells 图 2 重组病毒rSVA-HAS-OB的RT-PCR鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant virus rSVA-HAS-OB by RT-PCR |
间接免疫荧光结果显示，重组病毒rSVA-HAS-OB感染IBRS-2细胞后检测到抗VP1的特异性绿色荧光，而亲本毒株SVA CH/FJ/2017和对照细胞(接种PBS)均未观察到荧光(图 3)，表明重组病毒感染IBRS-2细胞后插入的FMDV抗原表位基因能够正确表达，并具有中和FMDV VP1抗体结合的反应原性。
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图 3 重组病毒rSVA-HAS-OB间接免疫荧光鉴定 Fig. 3 Identification of the recombinant virus rSVA-HAS-OB |
Western blot结果显示，重组病毒rSVA-HAS-OB感染IBRS-2细胞后能检测到表位的表达，大小为18 ku，与计算目的蛋白相对分子质量一致，而亲本病毒和对照细胞均未出现蛋白条带(图 4)，表明重组病毒感染IBRS-2细胞后能够正确表达插入外源的FMDV抗原表位。
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1.rSVA-HAS-OB重组病毒；2.SVA CH/FJ/2017亲本病毒；3.对照IBRS-2细胞 1.Recombinant virus of rSVA-HAS-OB; 2.Parental virus of SVA CH/FJ/2017;3.Normal IBRS-2 cells 图 4 重组病毒rSVA-HAS-OB的Western blot鉴定 Fig. 4 Identification of recombinant virus rSVA-HAS-OB by Western blot |
将收获冻存的重组病毒rSVA-HAS-OB第5、10、15、20和25代的病毒毒液分别提取病毒RNA，用引物rSVA-F和rSVA-R进行RT-PCR扩增，结果表明重组病毒在第5、10、15、20和25代病毒样品中均能扩增到插入的B细胞表位(图 5)。测序结果表明，这5个代次中插入的B细胞表位序列均没有发生缺失与突变，但插入5′端HAS发生缺失与突变。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准; 1~5.分别为第5、10、15、20、25代rSVA-HAS-OB重组病毒的插入表位基因的PCR产物；6.对照IBRS-2细胞 M.DL2000 DNA marker; 1-5.PCR products of different passage of rSVA-HAS-OB (the 5th, 10th, 15th, 20th and 25th passage, respectively); 6.Normal IBRS-2 cells 图 5 不同代次rSVA-HAS-OB的插入表位基因扩增 Fig. 5 PCR products of different passage of rSVA-HAS-OB |
重组病毒rSVA-HAS-OB和亲本病毒SVA CH/FJ/2017在IBRS-2细胞上做蚀斑形态分析，结果表明重组病毒在10-7梯度下出现可数的蚀斑，亲本毒株也在10-7梯度下出现可数的蚀斑，空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)统计结果无明显差异。病毒一步生长曲线结果显示，重组病毒和亲本病毒具有相似的增殖特性，重组病毒复制能力在4~20 h稍低于亲本病毒，但在24~36 h病毒复制能力与亲本病毒复制能力基本一致(图 6)，表明嵌合外源基因对重组病毒的复制能力影响不大。
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A.重组病毒rSVA-HAS-OB蚀斑形态；B.亲本病毒SVA CH/FJ/2017蚀斑形态；C.病毒一步生长动力学曲线 A.The plaque phenotype of the recombinant viruses of rSVA-HAS-OB; B.The plaque phenotype of the parental virus of SVA CH/FJ/2017; C.One-step growth kinetics assay of recombinant viruses 图 6 重组病毒rSVA-HAS-OB和亲本病毒SVA CH/FJ/2017在IBRS-2细胞上的增殖 Fig. 6 The proliferation of recombinant viruses rSVA-HAS-OB and parental virus SVA CH/FJ/2017 in IBRS-2 cells |
随着病毒反向遗传操作技术的成熟和应用，通过病毒基因组操作可以对疫苗毒株进行改造和提升，而利用反向遗传学技术构建嵌合病毒研究病毒疫苗，在黄病毒等多种病毒疫苗研究中已报道较多。自20世纪90年代末，Bray等[27]首次利用反向遗传学技术构建登革病毒(Dengue virus，DENV)的嵌合病毒以来，随后大量的嵌合黄病毒疫苗被人们研究出来。Yang等[28]将JEV SA14-14-2株的prM和E基因替换为YFV 17D株的相应位置的基因，成功构建一株JE/YF嵌合病毒，用YFV 17D进行攻毒，嵌合黄病毒免疫昆明小鼠均有保护作用，而在JEV SA14-14-2免疫组，仅有部分小鼠(66.7%)得到保护。Li等[29]将亚洲型ZIKV株FSS1302531的prM和E基因替换为JEV SA14-14-2中相应位置的区域，成功构建一株JEV-ZIKV嵌合体，嵌合寨卡病毒在体外保持复制活性和遗传稳定性，并在小鼠和恒河猴动物模型中表现出寨卡病毒特异性中和抗体。Kum等[30]将亚洲型ZIKV的prM和E基因替换为YFV-17D中相应位置的区域，成功构建一株YF-ZIKV嵌合病毒，用嵌合病毒颅内接种免疫功能正常的BALB/c小鼠不会引起神经症状或死亡。以上研究结果表明嵌合疫苗可以同时完整表达两种或两种以上的结构蛋白，保留亲本病毒的抗原特异性，从而具有良好的免疫效果，在动物模型中具有减毒特性的同时也可诱导针对亲本病毒的中和抗体，且能抵抗原型病毒的攻击，但嵌合病毒普遍存在病毒增殖能力弱的特性，对嵌合疫苗减毒的机制尚未明确等问题也不可忽视。而本研究以SVA CH/FJ/2017株全长cDNA感染性克隆作为骨架成功构建嵌合表达FMDV抗原表位的重组质粒并成功拯救出重组病毒，重组病毒与亲本病毒相比，重组病毒的蚀斑形态大小与亲本病毒蚀斑形态大小相同，且无明显差异；病毒一步生长曲线的绘制，证实重组病毒与亲本病毒具有相似的增殖能力，表明该重组病毒具有制备疫苗的潜力，但对宿主免疫效果的评价还有待进一步研究。
前期研究表明，FMDV抗原表位的串联表达可以有效地诱导动物的免疫反应，而FMDV的有效抗原表位也多有报道。Lei等[26]将A型和O型FMDV的B细胞表位(VP1上134—161位AA和200—213位AA)和T细胞表位(3A上21—35位AA)重复串联，插入到乙型肝炎病毒核心(HBc)载体上，成功构建嵌合病毒样颗粒(VLP)，用嵌合VLP免疫小鼠可诱导机体产生针对A型和O型FMDV的特异性IgG和中和抗体。Lee等[31]将不同FMDV突变体的5个B细胞表位(VP1上136—162位AA)和1个T细胞表位(3A上21—35位AA)重复串联，成功构建嵌合多表位重组蛋白(5BT)，用5BT免疫小鼠后可以诱导小鼠产生与FMD灭活疫苗一样的FMDV特异性抗体。Li等[24]将FMDV B细胞表位(VP1上135—160位AA)取代猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2 Cap)上(第123—151位AA和第169—194位AA)所构建的重组嵌合表位蛋白，纯化后的嵌合表位蛋白免疫小鼠和豚鼠后能够诱导机体产生针对FMDV和PCV2b的特异性中和抗体。根据上述研究背景，本研究利用O型FMDV结构蛋白VP1上能产生中和抗体的B细胞表位(VP1上135—160位AA和200—213位AA)，以人工合成抗原表位序列并用Linker进行连接串联三次的抗原表位片段；同时参考文献[25]，合成一段人白蛋白信号肽(HAS)与三拷贝抗原表位串联表达，以增强重组病毒嵌合的外源基因的分泌表达，为后期的免疫研究做准备。
口蹄疫与新发病流行病学团队前期已成功构建了SVA的反向遗传质粒，并且成功构建了嵌合表达FMDV VP1表位的重组SVA毒株，重组病毒免疫猪体不能诱导宿主产生抗FMDV中和抗体(未发表)。作者推测是否由于重组病毒表达的VP1蛋白没有分泌到胞外，从而影响宿主不能产生FMDV中和抗体。有研究表明，赵平等[32]将人IL-2信号肽与通用性T细胞表位引入HBV核心抗原基因的5′端，成功构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠能够诱导细胞免疫和体液免疫应答。张玲楷[33]在猪瘟病毒(CSFV)C株基因组中插入PCV2 Cap，获得的重组病毒不能诱导兔产生抗PCV2 Cap的抗体，随后对重组病毒进一步优化，又构建了去除核定位信号并在氨基端引入不同分泌信号肽的Cap基因的重组病毒，优化后的重组病毒成功诱导兔产生抗PCV2 Cap蛋白的特异性抗体。在前期研究的基础上，本研究以同样方法以SVA CH/FJ/2017株全长cDNA感染性克隆质粒作为模板，并在其5′端引入信号肽以增强与B细胞表位的融合表达，为免疫宿主动物诱导产生抗FMDV特异性的中和抗体。利用合成的含目的基因质粒pHAS-OB作为过渡质粒，在限制性内切酶的作用下纯化回收目的基因，并在T4 DNA连接酶的作用下使目的基因和载体基因进行连接，然后转化至DH5α感受态细胞，得到含有B细胞表位的重组质粒pSVA-HAS-OB。通过将重组质粒转染IBRS-2细胞后均在48 h发生明显的CPE，表明成功拯救重组病毒；经RT-PCR扩增与基因测序结果表明成功插入O型FMDV抗原表位，但插入的HAS发生突变和缺失，并没有影响重组病毒的拯救，但对重组病毒的影响还有待进一步的验证。间接细胞免疫荧光和Western blot鉴定，证实成功构建了含有O型FMDV抗原表位重组SVA全长感染性克隆，并且插入的FMDV抗原表位基因能够正确的表达。遗传稳定性分析表明重组病毒在传至25代次的传代过程中插入的FMDV抗原表位的基因仍稳定存在，证实构建的重组病毒具有稳定性。病毒蚀斑试验和一步生长曲线绘制，都表明重组病毒与亲本病毒具有相似的增殖能力，均具有制备疫苗毒株的潜力，为下一步免疫学评价提供了理论依据。
4 结论成功构建并拯救出嵌合口蹄疫病毒抗原表位的重组塞内卡病毒A毒株，为研究微RNA病毒科嵌合病毒改造技术和疫苗研究奠定基础。
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