口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是一种由口蹄疫病毒(FMDV)引起的高度传染性病毒性疾病，严重危及牛、猪、羊等偶蹄动物，给畜牧业带来巨大的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将其列为需报告传染病[1-2]。FMDV属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属的单股正链RNA病毒，基因组大约由8 500个核苷酸组成，包括5′-UTR、开放阅读框(ORF)和3′-UTR[3]。其ORF可以翻译成一个约为250 ku的多聚蛋白，随后被病毒自身蛋白酶和宿主细胞蛋白酶切割，从而产生四种结构蛋白和八种非结构蛋白(Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol)[4]。FMDV衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白各60分子组成，VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，而VP4位于内部[5]。FMDV共有7个血清型，分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2及SAT3等型，每个血清型都可以感染动物，且不同血清型之间不存在交叉保护[6-7]，因此可能会出现多个血清型口蹄疫病毒同时流行的情形，从而使口蹄疫的防控任务面临更大的难题。目前，口蹄疫主要通过口蹄疫疫苗来预防疾病的发生，虽效果显著，但作用相对有限[8]。因此，需要开发新的抗病毒药物来协助控制FMDV的暴发以及传播。
细胞表面最大的受体家族是G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)。GPCRs的信号需要通过异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-proteins)传递到下游的效应蛋白。异三聚体G蛋白依据其α亚基分为四个亚家族：GS、Gi、Gq和G12。G12亚家族由Gα12和Gα13组成，并且在各种细胞和组织中表达[9]。Gα12第一个被鉴定的功能是致癌转化[10]，据报道，Gα12在各种生理过程中调节多种细胞反应，包括生长、极性、迁移和凋亡，例如胚胎发育、血管生成、血小板活化以及免疫和神经元调节作用[11-13]。含有G蛋白信号结构域的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(RGS-RhoGEFs)的调节因子将异源三聚体G蛋白α亚基的G12家族的活化形式与小GTP酶Rho直接连接[14]。G蛋白偶联受体(GPCRs)与异源三聚体G蛋白α亚单位Gα12和Gα13的Gα12家族成员相连，调节Rho GTPases的激活，从而促进许多关键的生物学过程[15]。Gα12介导的信号反应主要通过RhoGEF对小GTP酶Rho的激活作用，RhoGEF与肌动蛋白应力纤维的调节和转录活性的诱导有关[16]。除RhoGEF外，已发现超过20种蛋白质作为Gα12的效应分子，如钙黏蛋白、Hsp90和BTK等[17]。这意味着Gα12可以通过不同组织中的不同机制起作用。最近研究发现Gα12的表达与致癌的信号转导途径密切相关[18-19]，其参与溶血磷脂酸诱导的高血压反应的分子机制[20]，在饮食诱导的关于脂肪组织扩张和重塑的肥胖中起到重要作用[21]。目前，Gα12在抗病毒方面的研究尚未见报道，我们的研究发现FMDV的感染可上调Gα12的表达，过表达Gα12抑制FMDV的复制，说明Gα12具有抗FMDV的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞、病毒和质粒HEK293T细胞、PK-15细胞、Vero细胞和BHK-21细胞均由本实验室保存。
FMDV/O/HN/93株由国家口蹄疫参考实验室分离并保存。SeV由本实验室保存。IFN-Luc、NF-κB-Luc和pRL-TK质粒由舒红兵教授(武汉大学)馈赠。pcDNA3.1/myc-His(-)载体由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂大肠杆菌感受态Trans5α购自全式金生物技术有限公司；M-MLV、Trizol、LA Taq酶、SYBR premix Ex Taq (TLi RNaseH PLus)均购自宝生物(大连)有限公司；蛋白Marker、ECL显色液购自赛默飞世尔科技有限公司(中国)；转染试剂JetPEI-Polyplus购自达科为生物技术有限公司；Np-40细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF购于碧云天生物技术有限公司；NheⅠ-HF(R3131S)、BamHⅠ-HF(#R3136S)和Cutsmart buffer (B7204S，10×Concentrate)购于BioLabs公司(英国)。小鼠抗Gα12单抗、小鼠抗myc单抗、小鼠抗β-actin单抗、山羊抗鼠IgG和山羊抗豚鼠IgG二抗均购于Santacruz公司，抗O型FMDV豚鼠血清由本实验室制备。Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody购自Invitrogen公司；DAPI购自罗氏公司。双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取及Gα12基因的克隆Trizol裂解法提取PK-15细胞(1×106)总RNA：细胞中分别加入1 mL Trizol，反复吹打至透明状，用移液器吸至1.5 mL无RNase Eppendorf管中，再加入250 μL氯仿，剧烈振荡15 s，使Trizol与氯仿充分混合，4 ℃冰箱放置10 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，用移液器慢慢吸取透明上清(不要吸到中间的蛋白层)至无RNase的离心管中，加入等体积的异丙醇上下颠倒7~10次，在-20 ℃放置30 min以上，沉淀RNA。4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入用DEPC水配制的75%乙醇1 mL上下轻轻颠倒8~9次，4 ℃ 7 500 r·min-1离心5 min，弃掉上清，将含有RNA的EP管放在超净台中，晾干，加入20 μL的DEPC水溶解RNA，测浓度，备用。
反转录反应体系(20 μL)：4 μL的5×First buffer，2 μL的0.1 mol·L-1 DDT，1 μL的RNA酶抑制剂RRI，1 μL的80 μmol·L-1 oligo dT，1 μL的M-MLV反转录酶，0.5 μL的100 μmol·L-1 Random primer，1 μL的10 mmol·L-1dNTPs，4.5 μL的DEPC无RNase水，5 μL的RNA。程序为25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min，16 ℃保存。
1.2.2 Gα12质粒的构建设计并合成Gα12上、下游引物(表 1)，分别引入NheⅠ和BamHⅠ-HF双酶切位点，从猪体内扩增Gα12基因序列，构建到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)上。以RNA反转录成的cDNA为模板，扩增Gα12片段，双酶切，将片段连接于pcDNA3.1/myc-His(-)载体上，构建pcDNA3.1-Gα12-myc重组质粒。
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表 1 本试验中用到的引物序列 Table 1 The primers used in this study |
GCTAGCGACATCGACGCGCTGCTGGCCCGC(NheⅠ)
GGATCCCTGCAGCATGATATCTTTCAGGTT(BamHⅠ)将pcDNA3.1-Gα12-myc质粒用NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。采用10 μL体系：500 ng pcDNA3.1-Gα12-myc质粒，0.5 μL NheⅠ酶，0.5 μL BamHⅠ酶，1 μL Cut Smart Buffer，加ddH2O至体系为10 μL。37 ℃酶切3 h，1%琼脂糖凝胶电泳。送金唯智生物科技有限公司测序，证实构建正确。
1.2.3 Western blot制备PK-15细胞蛋白样品：细胞接种35 mm的培养皿，待密度为70%~80%进行转染。培养一定时间收集样品，加1×SDS loading buffer裂解样品，95 ℃煮样10 min，12 000 r·min-1，离心10 min。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及转印：配制12%聚丙烯酰胺凝胶，将制备好的蛋白样品加样，同时加指示Marker，电泳时先调80 V电压跑30 min，再将电压调为120 V跑至结束；电泳结束后，100 V 1 h转印至NC膜上；用5%脱脂奶粉溶液封闭1.5 h(室温)后；一抗孵育，4 ℃过夜；用TBST洗3次，每次10 min；二抗(山羊抗鼠IgG、山羊抗豚鼠IgG)室温孵育2 h后，用TBST洗3次，每次10 min；最后采用蛋白发光印迹仪进行ECL显影、曝光。
1.2.4 实时荧光定量PCR用Trizol裂解法提取PK-15细胞总RNA，将RNA反转录为cDNA，用对应的引物进行检测。采用20 μL体系：10 μL SYBR Green，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，1 μL cDNA，8.2 μL DEPC水。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃10 s，60 ℃ 34 s共40循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)，95 ℃ 1 s。扩增引物见表 1。
1.2.5 间接免疫荧光试验HEK293T细胞接种于35 mm共聚焦培养皿，待密度为70%~80%转染。24 h后弃掉培养液，用PBS洗两次；4%多聚甲醛组织固定液固定30 min，PBS洗两次，每次8 min；0.3%Triton通透25 min，PBS洗三次，每次10 min；5%脱脂奶粉溶液4 ℃封闭4 h；小鼠抗myc单抗(1:300，300 μL)孵育，4 ℃孵育过夜，PBST洗三次；山羊抗鼠IgG抗体(1:300，300 μL)孵育，常温孵育1 h (或者4 ℃孵育4 h)，PBST洗三次，每次5 min；DAPI染色10~15 min，PBST洗三次，每次5 min，共聚焦显微镜观察，拍照。
1.2.6 病毒感染及病毒滴度测定病毒感染：PK-15细胞接种于细胞培养皿，待细胞密度70%~80%，用JetPEI-PolyPlus转染试剂分别转染0、1和2 μg的 pcDNA3.1-Gα12-myc，转染24 h后，弃掉细胞培养液，用PBS洗一次，然后接种FMDV，12 h后收取样品，冻融3次。
病毒毒价的测定(TCID50)：在96孔板中加入消化吹打混匀的BHK-21细胞(100 μL)，12 h后，弃上清，用无血清DMEM培养基洗一次，用DMEM以10倍倍比稀释病毒，将不同稀释度的病毒分别加入96孔板(50 μL)，同时设置一列阴性对照孔，培养48 h后，记录每一稀释度产生CPE的细胞孔数目，根据Reed-Muench法计算TCID50。重复试验三次。
1.2.7 Gα12 SiRNA干扰试验将PK-15细胞接种于六孔板，待密度为70%~80%时分别转染150 nmol·L-1的NC siRNA (5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′)和Gα12 siRNA(5′- CGUGA-AGGGCCUAAAGUUU-3′)，转染24 h后，分别感染FMDV，在0、12、24、36 h不同时间点收取样品。用实时荧光定量PCR和Western blot检测。
1.2.8 双荧光素酶报告试验将293T细胞(1×105·mL-1)接种到24孔板中，12 h后分别转染100 ng报告质粒、20 ng pRL-TK和相应浓度的Gα12质粒，24 h后用SeV感染，12 h后用双荧光素酶检测试剂盒(Promega，美国)检测荧光素酶活性。
2 结果 2.1 Gα12真核表达质粒的鉴定利用引物对Gα12基因进行扩增后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测到1 023 bp扩增条带(图 1A)，大小与预测相符。将经NheⅠ和BamHⅠ双酶切的片段与pcDNA3.1/myc-His(-)载体连接，转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，进行NheⅠ与BamHⅠ双酶切鉴定，如图 1B所示，可见两条带，大小与预期相符，说明Gα12真核表达质粒构建成功。
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A. Gα12 PCR扩增；B.真核表达质粒pcDNA3.1-Gα12-myc的NheⅠ与BamHⅠ双酶切鉴定 A. Amplification of Gα12 sequence by PCR; B. NheⅠ and BamHⅠ enzymatic digestion of pcDNA3.1-Gα12-myc plasmid 图 1 Gα12真核表达质粒pcDNA3.1-Gα12-myc的构建与鉴定 Fig. 1 Construction and identification of pcDNA3.1-Gα12-myc eukaryotic expression plasmid |
将pcDNA3.1-Gα12-myc真核表达质粒和pcDNA3.1/myc-His(-)对照质粒分别转染PK-15细胞，36 h收取细胞样品，用小鼠抗myc单抗进行Western blot检测，检测到40 ku条带，大小与预测相符合，表明质粒Gα12-myc在PK-15细胞中成功表达(图 2A)，并且，利用间接免疫荧光试验检测到Gα12-myc质粒成功表达，且定位于细胞质中(图 2B)。
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A.蛋白质印迹法检测pcDNA3.1-Gα12-myc质粒的表达；B.间接免疫荧光试验检测pcDNA3.1-Gα12-myc质粒的表达及其细胞定位 A. The identification of expression of pcDNA3.1-Gα12-myc plasmid by Western blot; B. The identification of expression and subcellular localization of pcDNA3.1-Gα12-myc plasmid by indirect fluorescence assay 图 2 pcDNA3.1-Gα12-myc质粒的表达 Fig. 2 The identification of expression of pcDNA3.1-Gα12-myc plasmid |
将PK-15细胞接种于35 mm的培养皿，待细胞长满后，感染FMDV (MOI=0.5)，不同时间点收取细胞样品(0、4、8、12 h)，进行相对实时荧光定量PCR检测，以GAPDH为内参。结果显示，随着感染时间延长，FMDV mRNA的量逐渐呈现上升趋势，且Gα12 mRNA的量也呈现上升趋势(图 3A)。但是不接毒的Mock细胞Gα12 mRNA水平没有明显的变化(图 3B)。同时，用Western blot方法检测内源性Gα12蛋白的变化，如图 3C所示，感染FMDV之后，随着病毒蛋白的增加，内源性Gα12的蛋白水平也逐渐升高。
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A.实时荧光定量检测FMDV感染细胞后FMDV和Gα12 mRNA的变化(**.P < 0.01)；B.实时荧光定量PCR检测未接毒的Mock细胞中Gα12 mRNA的变化；C. Western blot检测FMDV感染细胞后Gα12和FMDV蛋白水平变化 A. The mRNA level of FMDV and Gα12 were detected by qPCR in FMDV-infected cells(**.P < 0.01); B. The mRNA level of Gα12 was detected by qPCR in mock cells; C. Gα12 and FMDV proteins were detected by Western blot in FMDV-infected cells 图 3 FMDV感染上调Gα12 Fig. 3 FMDV infection upregulates Gα12 |
综上所述，FMDV感染后上调Gα12在基因和蛋白水平的表达。
2.4 过表达Gα12抑制FMDV的复制为了验证Gα12过表达对FMDV复制的影响，将pcDNA3.1-Gα12-myc真核质粒以不同剂量(0、1和2 μg)转染PK-15细胞，转染24 h后接FMDV(MOI= 0.5)，24 h后收取细胞样品。如图 4A所示，随着Gα12蛋白表达量的升高，FMDV的蛋白量逐渐下降；实时荧光定量PCR结果显示，随着Gα12 mRNA水平的升高(图 4B左)，FMDV mRNA水平逐渐下降(图 4B右)。同时，TCID50结果显示，随着Gα12表达量的升高，FMDV的病毒滴度呈逐渐下降的趋势，而且存在显著差异(图 4C)，这些结果说明过表达Gα12抑制FMDV的复制。随后我们又做了病毒复制曲线，检测Gα12对FMDV在BHK-21、PK-15和Vero细胞中复制的影响，如图 4D~F所示，不管是在BHK-21、PK-15还是在Vero细胞上Gα12都能显著抑制FMDV复制，说明Gα12在多种细胞上都能抑制FMDV复制。
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A. Western blot检测Gα12和FMDV蛋白在PK-15细胞表达(**.P < 0.01)；B.实时荧光定量PCR检测Gα12和FMDV转录水平变化(**.P < 0.01)；C. TCID50方法检测口蹄疫病毒滴度；D~F. RT-qPCR检测FMDV在BHK-21、PK-15和Vero细胞中不同时间点的复制水平并绘制病毒复制曲线 A. Verification the expression of Gα12 and FMDV proteins by Western blot in PK-15 cell(**.P < 0.01); B. The mRNA level of Gα12 and FMDV was detected by qPCR(**.P < 0.01); C. Detection of viral titers by TCID50 assay; D-F. RT-qPCR was used to detect the replication levels of FMDV in BHK-21, PK-15 and Vero cells at different time points, and the viral replication curve was drawn 图 4 过表达Gα12抑制口蹄疫病毒复制 Fig. 4 Overexpression of Gα12 suppresses FMDV replication |
为了进一步验证Gα12对FMDV复制的影响，笔者做了Gα12的干扰试验。首先合成三条Gα12 SiRNA引物，为了验证干扰效率，将150 nmol·L-1的Gα12 SiRNA-1、Gα12 SiRNA-2、Gα12 SiRNA-3和NC SiRNA分别转染PK-15细胞，转染36 h后分别用实时荧光定量PCR和Western blot方法从RNA和蛋白水平分别检测对Gα12的干扰效率，结果显示，Gα12 SiRNA-3的干扰效率最高(图 5A)。
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A.实时荧光定量和Western blot分别检测Gα12转录水平和蛋白水平变化；B.实时荧光定量PCR检测Gα12和FMDV转录水平变化；C. TCID50方法检测口蹄疫病毒滴度；D. Western blot检测Gα12和FMDV蛋白水平变化; **.P < 0.01 A. Detection of Gα12 mRNA level and protein level by qPCR and Western blot; B. The mRNA level of Gα12 and FMDV was detected by qPCR; C. Detection of viral titers by TCID50 assay; D. Gα12 and FMDV proteins were detected by Western blot; **.P < 0.01 图 5 下调Gα12促进口蹄疫病毒复制 Fig. 5 Downregulation of Gα12 enhances the FMDV replication |
将150 nmol·L-1 Gα12 SiRNA-3与NC SiRNA分别转染PK-15细胞，24 h后感染FMDV(MOI=0.5)，分别在0、12、24 h收取样品，用实时荧光定量PCR分别检测Gα12和FMDV的mRNA水平。结果显示，敲低和不敲低Gα12的两组比较，敲低Gα12之后，FMDV的mRNA水平有显著升高(图 5B)。
将150 nmol·L-1 Gα12 SiRNA-3与NC SiRNA分别转染PK-15细胞，24 h后感染FMDV，分别在0、24和36 h收取样品，分别测定病毒滴度并进行Western blot检测，敲低和不敲低Gα12的两组比较，敲低Gα12之后，FMDV的病毒滴度和蛋白水平都升高(图 5C和D)。结果显示，敲低Gα12之后，FMDV的mRNA水平、蛋白水平及病毒滴度都有所升高。
2.6 Gα12促进NF-κB信号通路众所周知，Ⅰ型干扰素启动一系列信号级联反应，发挥重要抗病毒作用，SeV是一种激活Ⅰ型干扰素信号传导的模式病毒。为探讨Gα12是否影响SeV诱导的Ⅰ型IFN信号转导，将载体质粒或pcDNA3.1-Gα12-myc质粒分别与IFN-Luc或NF-κB-Luc荧光素酶报告质粒及pRL-TK共转染HEK-293T细胞，然后用SeV感染HEK-293T细胞。结果表明，Gα12蛋白的过表达以剂量依赖的方式增加了SeV诱导的NF-κB基因启动子活性(图 6B)，但是对SeV诱导的β-IFN基因启动子活性没有影响(图 6A)，表明Gα12蛋白促进NF-κB信号传导，这可能与Gα12介导的抗病毒作用有关。
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A. Gα12对SeV诱导的β-IFN基因启动子活性的影响；B. Gα12对SeV诱导的NF-κB基因启动子活性的影响 A. Effect of Gα12 on SeV-induced promoter activation of β-IFN; B. Effect of Gα12 on SeV-induced promoter activation of NF-κB 图 6 Gα12促进NF-κB信号通路 Fig. 6 Gα12 enhanced the NF-κB signaling pathway |
口蹄疫是一种具有高度传染性且对经济具有重要影响的疾病[22]。FMDV通过操控宿主蛋白的表达以利于自身复制，同时其生命周期也受不同宿主蛋白的影响[23]。已发现一些宿主蛋白与FMDV蛋白发生相互作用并且影响FMDV的复制。例如，宿主蛋白DNAJA3与口蹄疫病毒VP1相互作用抑制口蹄疫病毒的复制[24]。PCBP2与VP0相互作用，促进病毒复制[25]。DCTN3可以与3A相互作用，并且该互作对于病毒在牛体内的复制至关重要[26]。Vimentin是2C的特异性宿主结合配体，2C和Vimentin之间的相互作用对于病毒复制至关重要[27]。Beclin1也是2C的天然配体，其参与自噬途径对FMDV复制很重要[28]。Sam68与FMDV非结构蛋白3C和3D共定位并共沉淀，突出该宿主因子对FMDV感染过程的重要性[29]。VP1诱导的Ⅰ型干扰素抑制是通过与sorcin的相互作用介导的[23]，并且FMDV 2B与RIG-Ⅰ相互作用并诱导RIG-Ⅰ的减少[30]。总之，宿主蛋白在口蹄疫病毒的复制过程中起到很重要的作用。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)调节并参与多种跨膜信号转导系统[31]，异三聚体G蛋白将多种细胞外信号传递给细胞内的效应分子，其由鸟嘌呤核苷酸结合α-亚基、β-亚基和γ-亚基组成，基于其α亚基的序列相似性分为四个亚家族。由α亚基Gα12和Gα13组成的G12亚家族在细胞中可发生变异，并且这种变异与细胞的极性、生长、黏附、迁移、侵袭以及肿瘤的发生密切相关[32]。有研究发现Gα12信号通路与肿瘤发生密切相关[33]，并且也发现Gα12启动子的甲基化与子痫早期发作有关[34]。然而Gα12目前在口蹄疫病毒方面的研究还未见报道，笔者的相关研究表明，Gα12与FMDV在PK-15细胞中的复制密切相关，通过FMDV感染PK-15细胞发现，内源性Gα12在转录水平和蛋白水平均上调，进一步通过过表达Gα12和利用干扰RNA敲低Gα12的表达试验表明，上调Gα12可以抑制口蹄疫病毒的mRNA水平、蛋白水平和病毒滴度，而下调Gα12可以促进口蹄疫病毒的复制，说明Gα12具有抑制FMDV复制的作用。进一步研究表明Gα12促进NF-κB信号通路，但是Gα12促进NF-κB信号通路的具体机制尚不明确，还需要进一步研究。
4 结论本研究成功构建Gα12真核表达质粒，且在真核细胞中成功表达并定位于细胞质中，用FMDV感染PK-15细胞后可上调Gα12，说明FMDV与Gα12之间存在一定的关联，通过过表达和干扰试验发现：过表达Gα12可明显抑制FMDV在PK-15细胞中的复制，而下调Gα12则促进FMDV在PK-15细胞中的复制。综上所述，Gα12在PK-15细胞中能够抑制口蹄疫病毒的复制。进一步研究发现，Gα12促进NF-κB信号传导，这可能与Gα12介导的抗FMDV作用有关。
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