牦牛(Bos grunniens)是分布在我国青藏高原及其毗邻地区的重要畜种，是我国青藏高原牧民赖以生存的主要生活资料和生产资料。但是，牦牛的泌乳量和产肉性能较普通牛低，用普通牛品种与牦牛杂交繁殖的杂种一代(犏牛)具有显著杂交优势，犏牛产奶量和产肉量较牦牛有大幅度提高，但是杂种一代雄性不育。母犏牛只能与普通牛或牦牛回交繁殖后代并产奶，但回交后代杂种优势解体，生产性能显著降低[1]。因此，使用屠宰场收集的牦牛卵巢和普通牛精子作为材料，利用体外受精(in vitro fertilization, IVF)技术生产犏牛胚胎，以母犏牛为胚胎移植受体开展犏牛胚胎移植具有重要研究价值和应用前景。虽然在牦牛与犏牛同期发情、胚胎体外生产条件优化、胚胎冷冻保存等方面的研究为开展犏牛胚胎移植奠定了一定基础[2-9]，但是犏牛胚胎体外生产效率仍有待进一步提高。
血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是1972年首次报道的一种乙酰化甘油信号磷脂(1- O -烷基-2-乙酰基-甘油-3-磷酸胆碱)[10]。机体多种组织器官都能合成和分泌PAF，小鼠、人、兔、绵羊和牛的胚胎在发育过程中都会分泌PAF[11-13]。PAF可改善胚胎的质量，促进胚胎的着床和妊娠的建立，是研究最多的早期胚胎生长因子之一[10-18]。虽然在小鼠胚胎培养液中添加PAF不能提高胚胎发育率，但可以提高囊胚的细胞数量和胚胎移植后的附植能力[14-15]。在猪的研究也证明，胚胎培养液中添加PAF不能提高IVF胚胎发育率，但能显著提高体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)胚胎的囊胚率[19]。活体研究表明，给处于卵泡期的小鼠注射PAF对其排卵率、受精率和和早期胚胎发育能力有不同程度的影响[15, 20]。用纺锤体分裂剂(nocodazole)阻断胚胎PAF的产生或向卵母细胞中注射PAF特异抗体后，产生的原核中缺乏PAF，从而降低胚胎发育能力[13]。Bódis等[21]认为，卵母细胞成熟过程能促进其自身PAF的产生，活化的血小板在卵泡的聚集能促进可溶性分子的局部释放和作用，从而促进卵母细胞的成熟和激素的合成。
BCL-2基因家族对细胞凋亡起关键的调控作用，其中BCL-2蛋白起抗凋亡作用，而BAX蛋白则起促凋亡的作用[22]，与卵母细胞成熟和早期胚胎发育密切相关[23-25]。表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)在卵泡和胚胎细胞中都有表达，二者结合激活MAP/ERK和PI3K/Akt通路，从而促进卵母细胞的成熟和胚胎发育[8, 16, 26]。转录因子OCT-4和NANOG在卵母细胞和胚胎中都有表达，OCT-4负责内细胞团(ICM)的多能性，而NANOG则维持上胚层的多能性，Oct-4-/-小鼠不能形成ICM[27]。敲低这两个基因中任何一个基因的表达都会影响猪的胚胎发育[28]。c-fos基因编码55 ku的核内蛋白质，这一因子可识别特定的DNA序列来启动细胞的增殖和分化[29], 在胚胎的发育过程中对细胞的生长、分化及增殖起促进作用[30]。因此，本试验拟研究卵母细胞成熟液中添加不同浓度的PAF对牦牛卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及成熟COCs和早期胚胎中BCL-2、BAX、EGF、EGFR、c-fos、OCT-4、NANOG等基因表达水平的影响。
1 材料与方法 1.1 试剂与耗材Single Cell-to-CtTM Kit购自美国Invitrogen公司；胎牛血清(fetal calf serum, FCS)、双抗(pen strep)购自美国Gibco公司；PAF(C16 Lyso PAF)、199液(10×)、17β-雌二醇、丙酮酸纳、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠购自美国Sigma公司(St. Louis, MO)；促黄体素(LH，LutropinⓇ-V)、促卵泡素(FSH，FolltropinⓇ-V)购自加拿大Bionniche公司(Belleville, Ontario)；细胞培养皿(35×10 mm)、双井培养皿购自Falcon公司；四孔板培养皿购自美国Nunclon公司；Millipore过滤器(0.2 μm)购自美国Pall公司(Pall, East Hills, NY)；透明质酸酶、矿物油、洗精受精液(G-IVFTM PLUS, G-IVF)、卵裂胚培养液(G-1TM PLUS, G-1)、囊胚培养液(G-2TM PLUS, G-2)均购自瑞典Vitrolife公司；DMSO其他生化试剂均为国产分析纯。
各种体外受精培养液在使用前均经预平衡培养。培养条件为饱和湿度、38.5 ℃、5% CO2，其中，除G-IVF液培养时间为2 h外，其他培养液的培养时间均为8 h。
1.2 牦牛卵母细胞的收集与体外成熟根据Zi等[3]的方法进行卵母细胞的收集与体外成熟(in vitro maturation, IVM)。用含有双抗的35 ℃生理盐水将从屠宰场带回的牦牛卵巢冲洗3次，选择卵巢上直径为3~8 mm的卵泡，用10 mL(12号针头)的一次性注射器抽取卵泡液，置于90 mm的一次性平皿中，在体视显微镜(Leica MZ75，德国)下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)。挑选卵丘颗粒细胞3层以上、卵母细胞胞质均匀且结构致密的COCs，用IVM液清洗3次，IVM液为含5 μg·mL-1 FSH、5 μg·mL-1LH、1 μg·mL-1 17β-雌二醇、25.5 μg·mL-1丙酮酸钠、100 μg·mL-1谷氨酰胺、2.2 mg·mL-1碳酸氢钠、1%(v/v)双抗(10 000 U·mL-1青霉素和10 000 μg·mL-1链霉素)和10%(v/v)FCS的TCM199。将收集到的COCs分为4组，分别置于含0、10-8、10-7、10-6mol·L-1 PAF的IVM液中，每个双井皿1 000 μL IVM液放30个COCs，在饱和湿度、38.5 ℃、5% CO2的培养箱(MODEL 3111，Thermo Series II，美国)中体外成熟培养24 h，观测COCs周围卵丘细胞扩散程度判定卵母细胞的成熟情况，当COCs周围卵丘细胞扩散到61%~100%时卵母细胞成熟[31]。
1.3 牦牛COCs的体外受精根据Zi等[7]的方法进行体外受精(in vitro fertilization, IVF)。在无菌35 mm的培养皿中加入4~5个70 μL的G-IVF微滴，微滴用矿物油覆盖。将娟姗牛冻精细管在40 ℃水浴锅中轻微匀速震荡加热解冻45~60 s，然后将解冻后的精液(200 μL)加入含1 mL G-IVF液的离心管底部，将离心管60°倾斜放置在饱和湿度、38.5 ℃、5% CO2的培养箱中孵育30~60 min；取出离心管，缓慢匀速吸取上清液600 μL，1 500 r·min-1离心5 min后，弃掉上清液，保留离心管底部约50 μL精液供IVF使用。在体视显微镜下将经成熟培养的COCs移入G-IVF中清洗3次后，再以约30枚·滴-1的COCs置于G-IVF微滴中，加入获能精子(精子最终浓度为2×106个·mL-1)，在38.5 ℃、5% CO2、90% N2、饱和湿度的三气培养箱(MODEL 3131，Thermo Series Ⅱ，美国)中共培养24 h。
1.4 牦牛胚胎体外培养根据Zi等[7]的方法进行胚胎的体外培养(in vitro culture, IVC)。在每个35 mm的一次性无菌培养皿中加入8个40 μL的卵裂胚培养液(G-1)和囊胚培养液(G-2)微滴，微滴上覆盖矿物油。然后，将精卵共孵育24 h后的受精卵移入G-1微滴清洗3次，再以约20枚·滴-1的量转入另一个G-1微滴中，置于三气培养箱中培养72 h，统计卵裂率；随后，移入G-2微滴中清洗3次，再以约10枚·滴-1的量转入另一个G-2微滴中，置于38.5 ℃、5% CO2、90% N2、饱和湿度的三气培养箱中培养48 h，统计囊胚率。
1.5 RNA的提取与cDNA的合成根据Single Cell-to-CtTMKit使用说明步骤进行：在0.2 mL无RNA酶的优化薄壁管中加入1 μL Single Cell DNase I和9 μL Single Cell Lysis Solution；取成熟COCs、2-、4-、8-细胞、桑椹胚及囊胚(每个阶段取5枚)分别加入到上述10 μL的混合液中，室温孵育5 min；加入1 μL Single Cell Stop Solution，室温孵育2 min后立即将PCR管置于冰上，即为提取的RNA。在干净无RNA酶PCR管中加入1.5 μL Single Cell SuperScriptⓇRT和3 μL Single Cell VILO TM Mix，然后将这4.5 μL混合液加入提取的RNA中，在PCR仪进行反转录，反应程序为：25 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；85 ℃ 5 min。将反转录后的cDNA抽取1 μL于紫外分光光度计检测浓度和OD260 nm/OD280 nm值，OD260 nm/OD280 nm值在1.6~1.8之间的cDNA于－20 ℃保存备用。
1.6 定量PCR检测相关基因的表达根据GenBank数据库中检索的普通牛基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计扩增BAX、BCL-2、EGF、EGFR、c-fos、OCT-4、NANOG和GAPDH (内参)基因的8对引物(表 1)，引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。采用实时荧光定量PCR仪(CCFX96，Bio-RAD，美国)检测成熟卵母细胞和不同发育阶段胚胎中BAX、BCL-2、EGF、EGFR、c-fos、OCT-4、NANOG基因的mRNA表达水平。由于胚胎cDNA样品量有限，因此，本研究未检测不同发育阶段胚胎中c-fos基因的mRNA表达水平。反应体系为15 μL：9.5 μL Green Supermix，1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，无菌去离子水3.5 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；每个样品重复检测3次。
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表 1 定量PCR引物信息 Table 1 The information of primer used for real-time PCR |
通过SPSS软件对试验数据进行分析，以单因子方差分析对含有不同浓度PAF的IVM液中牦牛卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率进行差异显著性检验；牦牛成熟卵母细胞各个相关基因的表达差异定量分析以GAPDH基因的Ct值作为参考，采用比较阈值法(2-ΔΔCt法)进行相对定量分析[32]，结果以“平均数±标准误(Mean±SE)”表示；以4×5方差分析对含有不同浓度PAF的IVM液中不同发育阶段牦牛胚胎中基因表达水平进行差异显著性检验。
2 结果 2.1 IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞成熟率的影响在牦牛卵母细胞IVM液中添加不同浓度PAF，成熟培养24 h后，观察卵母细胞的成熟率(表 2)，结果发现，当IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1时，卵母细胞成熟率达到最高((92.16±0.19)%)，显著高于其他组(P < 0.05)；而当IVM液中PAF浓度达到10-6mol·L-1时，卵母细胞成熟率((80.23±0.24)%)反而降低，显著低于(P < 0.05)对照组((85.61±0.08)%)。
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表 2 IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞成熟率的影响 Table 2 Effect of PAF concentration in IVM medium on maturation rates of yak oocytes |
牦牛卵母细胞在含不同浓度PAF的IVM液中成熟培养后进行体外受精，分析统计卵裂率和囊胚率。结果发现，当IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1时，卵裂率和囊胚率最高，分别为(77.20±0.85)%和(46.71±0.68)%，显著高于其他组(P < 0.05)；而当IVM液中PAF浓度增高到10-6 mol·L-1时，卵裂率和囊胚率反而降低，分别为(56.41±0.82)%和(31.82±0.79)%，与对照组之间无显著差异(P>0.05，表 3)。
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表 3 IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞IVF后发育能力的影响 Table 3 Effects of PAF concentration in IVM medium on development of yak oocytes after IVF |
利用qPCR检测在含不同浓度PAF的IVM液中成熟的牦牛COCs中BAX、BCL-2、EGF、EGFR、c-fos、OCT-4、NANOG等基因的mRNA表达水平，结果如图 1所示，BAX在PAF浓度为10-6 mol·L-1组表的达量显著高于其他浓度组(P < 0.05)；BCL-2在PAF浓度为10-8、10-7、10-6mol·L-1组间表达量差异不显著(P>0.05)，但10-7mol·L-1组的表达量显著高于对照组(P < 0.05)；EGF和EGFR在PAF浓度为0、10-8、10-7mol·L-1组的表达量差异不显著(P>0.05)，但10-6mol·L-1组的表达水平显著低于10-7mol·L-1组(P < 0.05)；c- fos在10-8、10-7mol·L-1组间表达量差异不显著(P>0.05)，但0、10-6 mol·L-1组的表达水平显著低于10-8和10-7 mol·L-1组(P < 0.05)；OCT-4和NANOG在各组只有微量表达。
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同一基因不同组间，不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05) For the same gene, different letters mean significant difference (P < 0.05), and the same letter means no significant difference (P>0.05) among different groups 图 1 IVM液中PAF浓度对COCs中相关基因表达的影响 Fig. 1 Effects of PAF concentration in IVM medium on gene expression in yak COCs |
利用qPCR检测在含不同浓度PAF的IVM液中成熟卵母细胞经IVF后BAX、BCL-2、EGF、EGFR、c-fos、OCT-4和NANOG基因在不同发育阶段胚胎中的表达量见图 2。BCL-2在牦牛各阶段早期胚胎中均检测到表达，其表达水平在2-、4-、8-细胞时高于桑椹胚和囊胚，不同浓度组间表达量无显著差异(P＞0.05)；BAX也在牦牛各阶段早期胚胎中均检测到表达，但其表达水平亦随胚胎的发育呈逐步上升趋势，不同浓度组间表达量无显著差异(P＞0.05)。从2-细胞期发育到桑椹胚阶段，虽然PAF浓度为10-7mol·L-1组的EGF和EGFR表达量有较高的趋势，但各组间差异不显著；在囊胚期，10-7mol·L-1组EGF和EGFR表达量显著高于10-6mol·L-1(P < 0.05)。OCT-4在2-细胞期到4-细胞期的表达量低，从8-细胞期开始其表达量明显升高，10-7mol·L-1组囊胚中OCT-4的表达量显著高于10-8和10-6mol·L-1组(P < 0.05)。NANOG在不同浓度PAF组和胚胎发育的不同阶段间均无显著差异(P>0.05)。
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在同一发育阶段，不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05) At the same developmental stage of embryos, different letters mean significant difference (P < 0.05), and the same letter means no significant difference (P>0.05) 图 2 IVM液中PAF浓度对牦牛胚胎不同时期相关基因表达水平的影响 Fig. 2 Effects of PAF concentration in IVM medium on the expression of related genes in yak embryos of different stages |
PAF是由动物多种细胞和组织分泌的一种乙酰化甘油信号磷脂，具有广泛的生物学作用。动物的胚胎、卵巢、子宫、卵母细胞等繁殖相关组织和细胞都能分泌PAF，在动物排卵、受精、早期胚胎发育和附植等繁殖过程中发挥重要调节作用[13-14, 20-21, 33-34]。PAF还可以提高精子活力、顶体反应和穿卵力，在雄性动物繁殖活动中也发挥重要作用[35]。本研究证明，在体外培养液中添加适当浓度的PAF可以提高牦牛卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率，这种作用可能与其对COCs和胚胎中促凋亡(BAX)、抗凋亡(BCL-2)、表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)、转录因子(OCT-4和NANOG)和c-fos等基因的表达调控有关。
关于PAF改善早期胚胎质量方面的体内、体外研究结果基本一致，但对卵泡发育和受精以及早期胚胎发育能力方面的研究结果却不一致[13-17]。Fukuda和Breuel[15]研究发现，在小鼠排卵前4 d连续注射PAF对排卵率、受精率和卵裂率没有显著影响，但PAF可以显著提高扩张囊胚率。但是，Sakellariou等[20]研究则证明，在小鼠排卵前适当时间注射适量的PAF可以显著提高排卵率、受精率和扩张囊胚率。本试验比较研究了在IVM液中添加不同浓度PAF对牦牛卵母细胞体外成熟率以及用普通牛精子IVF后卵裂率和囊胚率的影响，结果发现，当IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1时，牦牛卵母细胞成熟率、IVF后的卵裂率和囊胚率均显著高于PAF高浓度组(10-6mol·L-1)和低浓度组(0、10-8mol·L-1)(P < 0.05)，即IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1是牦牛体外受精的最佳浓度。Kordan和Strze z · ek[35]试验证明，外源性PAF在1× 10-8~1×10-6mol·L-1浓度时，可显著增加新鲜和冷冻保存猪精子的运动能力，以1×10-7mol·L-1浓度为最佳，而高浓度的PAF则可破坏精子的原生质膜，从而对精子产生损伤作用。因此，IVM液中高浓度PAF对牦牛卵母细胞的成熟和胚胎发育不利可能也与PAF对细胞膜的损伤作用有关。Sakellariou等[20]研究证明，小鼠注射单位体重的PAF过高对卵母细胞排卵率、卵裂率、桑囊胚率和扩张囊胚率都有不良影响，主要原因是在活体动物中高浓度的PAF导致LH水平升高，从而导致卵母细胞黄体化，影响卵母细胞质量、发育和附植能力。Ryan等[36]发现，在小鼠胚胎培养液中添加1.86 ×10-7或1.86×10-6mol·L-1 PAF时对2-细胞胚胎的囊胚发育率和体外培养48或72 h扩张囊胚率没有显著影响，但是，高浓度的PAF(9.3×10-6和18.6×10-6mol·L-1)对胚胎发育起有害作用。Lee等[19]发现，虽然在IVC液中添加PAF不能提高猪IVF胚胎发育率，但能显著提高猪体细胞核移植(SCNT)胚胎的囊胚率。O’Neill[16]发现，在胚胎培养液中添加PAF能显著提高小鼠的卵裂率和囊胚率。这些研究结果的不一致可能与胚胎种类(体内受精、IVF、SCNT)和培养系统(单位体积培养液中胚胎数量)的差异有关。在胚胎培养过程中，胚胎自分泌PAF和IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、EGF等生长因子进入培养液，促进胚胎发育[13, 16]，而胚胎培养液中这些生长因子的浓度与胚胎种类和培养液中胚胎浓度有关[16]。虽然本研究未测定COCs和胚胎自分泌的PAF浓度，但是单位体积IVM液中COCs的数量(每1 000 μL 30枚)和IVC液中胚胎数量(每40 μL 30枚)符合牦牛和普通牛体外受精基本规程要求[3-9]，因此，筛选出的最佳PAF浓度对牦牛体外受精具有重要指导意义。
PAF对卵泡发育和胚胎发育的作用主要通过卵泡颗粒细胞和胚胎细胞上的PAF受体(PAFr)介导实现[19, 37]。但是目前，PAF与PAFr结合后对基因表达影响的机制还不清楚，因此，本研究对IVM液中PAF对COCs和胚胎中与细胞凋亡和增殖相关的一些重要基因表达调控进行了研究。在细胞凋亡过程中，抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX为细胞提供信号通路，细胞内两种力量的差异决定细胞凋亡与发育命运[23-25]。本研究发现，IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞IVM过程中BCL-2和BAX的表达有一定影响，IVM中PAF浓度为10-6mol·L-1时促凋亡基因BAX表达量显著高于其他组，而10-7mol·L-1组抗凋亡基因BCL-2表达量最高，显著高于10-6mol·L-1组(P < 0.05，图 1)。说明IVM液中PAF浓度过高会促进卵母细胞凋亡，而浓度为10-7mol·L-1抗凋亡作用较强，有利于牦牛卵母细胞成熟。表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)、c-fos因子等能促进细胞的增殖和分化[8, 16, 26, 29]。10-7mol·L-1组COCs中这些基因的表达水平最高，显著高于10-6mol·L-1组(P < 0.05)，说明适当浓度的PAF可以通过促进细胞的增殖和分化，从而促进牦牛卵母细胞的体外成熟。有研究表明，IVM液中适宜浓度的FSH也是通过提高牦牛卵母细胞EGF、EGFR和BCL-2的表达及降低BAX的表达来提高牦牛卵母细胞的发育能力[38]。OCT-4和NANOG主要维持胚胎细胞的多能性[27-28]。与赵天等[39]的研究结果一致，OCT-4在牦牛COCs和早期胚胎发育过程中的各个时期均有表达，且不同时期该基因的表达量存在差异，说明OCT-4可能参与胚胎合子型基因转录激活的调控过程和维持囊胚内细胞团全能性的过程。
虽然IVM液中PAF浓度对IVF后续胚胎发育过程中BCL-2和BAX的表达无显著影响，但是，2-到8-细胞胚胎中抗凋亡基因BCL-2的表达量高于桑椹胚和囊胚，促凋亡基因BAX的表达量则随胚胎发育的进行而逐渐增加(图 2)，这可以在很大程度上阐释8-细胞期胚胎发育阻滞现象：早期胚胎抗凋亡基因BCL-2表达量高，促凋亡基因BAX表达量低，有利于胚胎发育；进入8-细胞期后抗凋亡基因BCL-2表达量下调而促凋亡基因BAX表达量上调，胚胎发育受阻。EGF与EGFR的外区域结合激活EGFR，引起一系列的细胞内反应，促进细胞分裂增殖活动[8, 16, 26]。从2-细胞发育到桑椹胚，10-7mol·L-1组EGF和EGFR的表达量有高于其他组的趋势，但各组间差异不显著，10-6mol·L-1组囊胚EGF和EGFR的表达量都显著低于10-7mol·L-1组(P < 0.05，图 2)，说明IVM液中高浓度的PAF不利于后续胚胎发育，而IVM液中适当浓度的PAF可以促进EGF与EGFR的表达，提高囊胚的质量和发育潜力。在小鼠胚胎发育过程中Oct-4被认为是内细胞团标记基因，在内细胞团的形成中起决定性作用[27-28]。本研究发现，2-和4-细胞牦牛胚胎中OCT-4的表达量低，8-细胞至囊胚的表达量高，这可能与合子基因组的启动有关。10-7 mol·L-1组囊胚OCT-4的表达量最高，显著高于10-6 mol·L-1组，说明适当浓度的PAF通过提高NANOG的表达，促进内细胞团的形成，从而提高囊胚率。不同浓度的PAF对不同发育阶段牦牛胚胎NANOG基因的表达无显著影响。这些研究结果初步从分子生物学水平为IVM液中PAF对牦牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的调控作用提供了一定理论基础，当然，卵母细胞的成熟和胚胎发育是受众多基因特定时空程序表达调控的复杂过程[7, 40]，因此，PAF对牦牛卵母细胞成熟与胚胎发育的分子调控机制还有待进一步深入研究。
4 结论含10-7mol·L-1PAF的IVM液有利于牦牛卵母细胞的成熟和胚胎发育，促进卵母细胞抗凋亡基因和细胞增殖相关基因(EGF、EGFR、c-fos和NANOG)的上调表达及促凋亡基因(BAX)的下调表达，促进囊胚中细胞增殖和分化相关基因(EGF、EGFR和OCT-4)的上调表达。
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