2. 山西农业大学动物科技学院, 太谷 030801
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)是下丘脑分泌的神经肽，其受体为G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)家族。基于CART对牛卵泡发育的重要调控作用[1-2]，为了进一步阐明其调控卵泡发育的作用机理，对CART的受体展开筛选和研究，对后期CART受体的鉴定及调控卵泡发育相关药物的设计具有重要意义。对影响卵泡发育相关蛋白的研究较多，其中CART影响卵泡发育的功能是明确的[3-5]。然而，到目前还没有CART受体被成功克隆。Vicentic等[6-7]报道，125 I-CART62-102和小鼠垂体瘤细胞系AtT20能够特异性结合。Keller等[8]研究表明，CART55-102能够与绿色荧光蛋白标记的下丘脑细胞结合。Lakatos等[9]研究发现，CART55-102诱导细胞系AtT20细胞外信号调节激酶(Erk-1和Erk-2)的激活是通过GPCRs介导的，这表明AtT20细胞内存在一个明显的CART受体。目前已发现的神经肽受体，除心房钠尿肽(ANP)受体外，所有已克隆的神经肽受体都属于鸟核苷酸调节蛋白，即GPCRs，其共同特征是受体蛋白的肽链形成7个α螺旋区段并跨膜7次，在大多数情况下要通过细胞内的第二信使产生效应。ANP受体比较特殊，其本身就是膜上的鸟苷酸环化酶(cGMP)，该受体激活时直接引起细胞内cGMP含量增加，不需要G蛋白的介导[10]。
本研究通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)筛选与CART相互作用的GPCRs，并通过同源建模和分子对接来评价该GPCRs作为CART受体的可能性。本研究应用Co-IP、生物信息学技术和函数评价筛选CART受体，并对该GPCRs在牛卵泡的表达和定位进行研究，初步分析其在牛卵泡发育中的调控作用，也为进一步鉴定CART的受体提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集Co-IP试验用动物及样品采集方法详见参考文献[11]。qRT-PCR和免疫组化试验样品来自于实验室保存，详细方法见参考文献[2]。
1.2 试验方法 1.2.1 蛋白组分亚细胞定位Co-IP、LC-ESI-Q-TOF质谱分析、数据库搜索及参数设定方法详见参考文献[11]。获得蛋白组数据后，通过CELLO V2.5在线软件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)对全部蛋白进行亚细胞定位，筛选相关膜蛋白[12]。
1.2.2 G蛋白偶联受体的预测获得10个膜蛋白氨基酸的FASTA格式(NCBI数据库)。应用HMMTOP V2.0(Prediction of transmembrane helices and topology of proteins Version 2.0)[13]对Co-IP和质谱分析中(111个蛋白)筛选出的10个膜蛋白进行G蛋白偶联受体预测。
1.2.3 SWISS-MODEL和PDB数据库对CART和CMKLR1同源建模通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)运行RCSB PDB(PDB蛋白质数据库http://www.rcsb.org/pdb/results/static.do)，分别输入牛CART和CMKLR1蛋白质FASTA序列，分析目标蛋白质Cα原子坐标，获得优化结构和评估数据后，输出PDBQT文件用于后续分析。
1.2.4 ZDOCK分子对接程序进入ZDOCK SERVER界面(http://zdock.umassmed.edu/)，输入CART和受体蛋白PDBQT文件，不选择残基跳跃，然后提交输入结果。根据受体、配体的结构特征和结合部位，分别选择受体、配体的模拟结合网格和结合位点；ZDOCK自动默认参数设定为：蛋白分子结合距离小于6Å，预测数量为1 000，评分函数值由高到低，显示结合构象为前5个预测结果；JAVA程序运行JMol可视化图像预测结果的立体结合构象。
1.2.5 qRT-PCR检测选取6头10月龄青年母牛，注射PGF2α(前列腺素F2α)同期发情，此间每12 h用B超仪检测并记录卵泡的生长状况，出现优势化卵泡后屠宰摘除卵巢，分离获得DF和SF。依据qRT-PCR检测要求，设定生物重复(n=3)、技术重复(n=3)和内参基因RPLP0(表 1)校正。按照标准曲线和目的基因扩增条件进行qRT-PCR反应。反应条件：95 ℃变性15 s，60 ℃ 1 min，45个循环。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 qRT-PCR primer sequences |
参照参考文献[2]的方法，连续切片厚度5 μm。设定阳性对照组、阴性对照组和试验组；试验组滴加100倍稀释兔抗CMKLR1多抗(ab156597，Abcam)，4 ℃孵育12 h；阳性对照组由PBS替代一抗；阴性对照组由一抗与10 μg·mL-1 CMKLR1活性肽(ab152289，Abcam)4 ℃预孵育12 h后替代一抗。
1.3 统计分析采用△△CT法计算CMKLR1 mRNA相对表达量，基因相对表达水平=2-△△CT。结果采用“均值±SE”表示，经RPLP0表达量校正，以CART基因在DF的表达量作为对照组[2]，SPSS(V 18.0)进行t检验分析。
2 结果 2.1 蛋白亚细胞定位分析本研究中，LC-ESI-Q-TOF质谱鉴定出111个蛋白质组分，经CELLO V2.5亚细胞定位预测数据库分析进行亚细胞定位，结果显示(图 1)，定位于细胞核的蛋白占32.03%，细胞质蛋白占21.09%，叶绿体蛋白占0.78%，胞外蛋白占21.09%，线粒体蛋白14.84%，内质网蛋白占2.34%，膜蛋白占7.84%。其中，膜蛋白有10个，分别为A2M、C5、CMKLR1、COX2、DDOST、HEATR5A、B3AT、ADT2、RPN2、SLC4A1。
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图 1 亚细胞定位预测 Fig. 1 Subcellular localization prediction |
应用HMMTOP V2.0在10个膜蛋白中仅筛选出CMKLR1含有7个跨膜α螺旋区(36~60、73~ 96、111~130、151~172、220~239、256~276、291~315 aa)，表明CMKLR1属于G蛋白偶联受体。
2.3 目标序列的搜索建模经SWISS-MODEL搜索(表 2)，牛CART立体结构与人源1hy9.1.A同源性最高，为100%，其中，包含2个β折叠及6个半胱氨酸形成的3个二硫键。牛CMKLR1立体结构与人源4n6h.1.A同源性最高，为31.43%。二者同源性均大于30%，可作为蛋白模型建立的分子坐标。
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表 2 SWISS-MODEL建模蛋白结果 Table 2 SWISS-MODEL protein modeling results |
通过QMEAN4评分函数对目标蛋白总体模型质量和每个氨基酸残基的模型质量(global and per-residue model quality，GMQE)进行评价(图 2)。结果表明，总体模型中绝大部分原子Z-score的绝对值小于1，只有少数原子Z-score的绝对值大于2；整体QMEAN4平均得分的绝对值为1.32，全部原子Z-score平均得分的绝对值为1.39；在溶解状态下，全部原子Z-score平均得分的绝对值为1.41；在侧链发生旋转时，全部原子Z-score平均得分的绝对值为1.42。
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右图为CMKLR1整体模型QMEAN4评分数值，上端表示正值，下端表示负值 Right figure is the QMEAN4 score value of CMKLR1 overall model, the top is positive and the bottom is negative 图 2 总体模型质量评价图 Fig. 2 Overall model quality evaluation chart |
图 3A是对构建模型CART中每个氨基酸残基模型质量的评价，图 3A可知，每一个氨基酸残基(76~116 aa)的评分均为正值，这说明构建模型中每一个氨基酸残基都处于可信合理的空间位置。图 3B为CMKLR1构建模型的质量评价曲线，图 3B可知，所构建模型的每一个氨基酸残基(36~315 aa)的评分均为正值，这说明构建模型中每一个氨基酸残基都处于可信合理的空间位置。
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A. CART；B. CMKLR1 图 3 蛋白模型质量评价 Fig. 3 Protein model quality estimate |
ZDOCK分子对接后，在结果输出界面获得1 000个在“Grid”内对接结果的评分，选择最大评分作为两蛋白结合的最佳模型(表 3)，其评分值接近2 000，符合ZDOCK筛选相互作用蛋白的要求。CART与CMKLR1形成最大评分值复合体的立体空间模型见图 4，由图可见, CMKLR1以桶状结构模式与配体CART紧密结合，且结合部位位于CMKLR1的跨膜区。
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表 3 分子对接最高评分输出 Table 3 ZDOCK max score output |
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深色. CART；白色. CMKLR1 Dark. CART; White. CMKLR1 图 4 蛋白复合体立体空间模型 Fig. 4 Protein complex three-dimensional space model |
qRT-PCR分析结果见图 5，由图可见，CMKLR1 mRNA在SF的表达量显著高于DF(P < 0.05)。
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*. P < 0.05 图 5 CMKLR1在牛DF与SF中的表达差异分析 Fig. 5 The expression difference of CMKLR1 in bovine DF vs SF |
免疫组化分析结果显示，CMKLR1在牛DF和SF颗粒层(GC)和膜层(TC)细胞均有表达(图 6B, E)，在DF阳性和阴性对照组(图 6A, C)、SF阳性和阴性对照组(图 6D, F)中均无特异性显色反应；从显色强度上可看出SF颗粒层和膜层细胞CMKLR1表达量均高于DF，这与qRT-PCR分析结果相一致。
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A、B、C分别为优势卵泡阳性对照组、试验组和阴性对照组；D、E、F分别为从属卵泡阳性对照组、试验组和阴性对照组。GC.颗粒细胞；TC.膜细胞；比例尺为20 μm A, B, C. Control group, experiment group and negative control group of DF, respectively; D, E, F. Control group, experiment group and negative control group of SF, respectively. GC. Granulosa cells; TC. Theca cells; Scale=20 μm 图 6 CMKLR1在牛DF与SF的免疫组化分析(400×) Fig. 6 Immunohistochemical analysis of CMKLR1 in bovine DF vs SF (400×) |
CART作为神经递质与进食、体重、药物成瘾、应激以及神经内分泌控制有关[14-16]。研究表明，CART在卵泡颗粒细胞上有表达，且CART在一定FSH浓度下，对体外培养的卵泡GCs生长和增殖具有显著影响[17-19]。尽管CART的作用及细胞活性已得到明确证实，但是与CART结合的具体受体尚不清楚。
CART是动物下丘脑分泌的神经肽，属于经典激素类，其受体为GPCRs。目前，预测蛋白三维结构的方法有3种：折叠识别法、从头预测法和同源建模法。同源建模又称比较建模，是最实用和可信度较高的蛋白结构预测方法[20-22]。蛋白质同源建模的理论基础就是依据生物在进化过程中，蛋白质立体空间结构保守性远大于氨基酸序列保守性，因此，当蛋白质之间的同源性大于30%时，其空间骨架结构基本不发生变化[23-25]。1969年，首次以蛋清溶菌酶结构为基础，成功对α-乳清蛋白三维结构手工建模[26]。从Blundell等[27-28]正式提出同源蛋白三维结构预测之后，相继出现了大量通过同源建模、参数设定成功预测各种蛋白三维结构的报道[29-30]。本研究通过HMMTOP V2.0对跨膜α螺旋进行分析获得GPCRs，利用SWISS-MODEL同源建模技术对CART和CMKLR1进行分子建模，利用分子动力学能量最小化原理优化和QMEAN4评分函数验证表明所构建的CART和CMKLR1分子模型合理可信。
分泌型蛋白CMKLR1也称ChemR23，在动物体内广泛表达[31-33]。CMKLR1在调节蛋白激活以及调控炎性部位趋药性方面具有重要作用，经动物体外和在体试验研究表明，CMKLR1在组织炎性或损伤部位受信号通路调节，促使CMKLR1在细胞中过表达并参与炎性组织消炎[34-35]。发情期动物卵泡发育过程涉及卵泡的生长、增殖和分化，该过程受到生长因子、促性腺激素和细胞内因子等的严格调控，同时，卵泡各细胞之间的相互调节也对类固醇激素的分泌和DF的形成至关重要[36-37]。大量研究证实，CMKLR1对人和大鼠的生殖生理过程发挥重要调控作用[38-39]；通过长期对大鼠模型给予雄激素刺激，结果表明，卵巢和循环系统的趋化素分泌量显著提高，卵泡内高水平的CMKLR1会抑制FSH诱导的GCs类固醇激素生成[40]。本研究通过qRT-PCR和免疫组化分析表明，CMKLR1在牛SF GCs的表达量显著高于DF，推测CMKLR1可能是通过抑制牛卵泡GCs类固醇激素分泌来促进卵泡闭锁的。
GPCRs是一个庞大的跨膜蛋白受体家族，目前，已经发现800多个成员，广泛参与感知、生殖、发育、生长、神经和精神等多种生命活动以及内分泌和代谢等多种生理过程；同时，与糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫和感染性疾病、神经与精神疾病等重要疾病的发生、发展及治疗密切相关。基于GPCRs在生理病理过程中的重要生物作用，这一蛋白家族也是目前最重要的药物作用靶标库，超过50%的临床用药物以及正在研发中的药物都作用于GPCRs。因此，对CART受体展开研究，不仅为进一步分析单胎家畜卵泡闭锁提供理论依据，也可以为提高单胎家畜的排卵率和优良种畜扩繁等提供技术支持。鉴于GPCRs结构的特殊性，通过肽段合成、重组表达等技术难以获得有活性的蛋白，给配体-受体结合试验造成很大困难。本研究通过对CART受体的筛选，为后期CART受体的鉴定及其作用机理研究奠定了基础。
4 结论本研究结果显示，蛋白同源建模和分子对接技术应用于受体筛选是可行的。CMKLR1作为神经肽CART的候选受体，在SF的表达量显著高于DF。在牛卵泡发育过程中，CMKLR1可能通过抑制牛卵泡GCs类固醇激素分泌来促进卵泡闭锁的。
| [1] | SMITH G W, SEN A, FOLGER J K, et al. Putative role of cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CARTPT) in dominant follicle selection in cattle[J]. Soc Reprod Fertil Suppl, 2010, 67: 105–117. |
| [2] |
李鹏飞, 毕锡麟, 王锴, 等. CART在不同发育阶段牛卵泡颗粒细胞中的表达和定位[J]. 中国农业科学, 2016, 49(12): 2389–2396.
LI P F, BI X L, WANG K, et al. Research on the expression and localization of CART in bovine granulosa cells at different developmental stages[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(12): 2389–2396. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.12.014 (in Chinese) |
| [3] | HOU S N, HAO Q L, ZHU Z W, et al. Unraveling proteome changes and potential regulatory proteins of bovine follicular granulosa cells by mass spectrometry and multi-omics analysis[J]. Proteome Sci, 2019, 17: 4. DOI: 10.1186/s12953-019-0152-1 |
| [4] | HAO Q L, ZHU Z W, XU D M, et al. Proteomic characterization of bovine granulosa cells in dominant and subordinate follicles[J]. Hereditas, 2019, 156: 21. DOI: 10.1186/s41065-019-0097-5 |
| [5] | LI P F, MENG J Z, ZHU Z W, et al. Detection of genes associated with follicle development through transcriptome analysis of bovine ovarian follicles GCs[J]. Curr Bioinform, 2018, 13(2): 127–140. DOI: 10.2174/1574893612666170403165746 |
| [6] | VICENTIC A, LAKATOS A, KUHAR M J. CART (cocaine-and amphetamine-regulated transcript) peptide receptors:specific binding in AtT20 cells[J]. Eur J Pharmacol, 2005, 528(1-3): 188–189. DOI: 10.1016/j.ejphar.2005.11.041 |
| [7] | VICENTIC A, LAKATOS A, JONES D. The CART receptors:background and recent advances[J]. Peptides, 2006, 27(8): 1934–1937. DOI: 10.1016/j.peptides.2006.03.031 |
| [8] | KELLER P A, COMPAN V, BOCKAERT J, et al. Characterization and localization of cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) binding sites[J]. Peptides, 2006, 27(6): 1328–1334. DOI: 10.1016/j.peptides.2005.10.016 |
| [9] | LAKATOS A, PRINSTER S, VICENTIC A, et al. Cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide activates the extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway in AtT20 cells via putative G-protein coupled receptors[J]. Neurosci Lett, 2005, 384(1-2): 198–202. DOI: 10.1016/j.neulet.2005.04.072 |
| [10] | ROCHE J F, MIHM M, DISKIN M G, et al. A review of regulation of follicle growth in cattle[J]. J Anim Sci, 1998, 76(S3): 16–29. |
| [11] |
李鹏飞, 孟金柱, 刘岩, 等. 免疫共沉淀筛选牛卵泡CART相互作用蛋白的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(12): 2169–2175.
LI P F, MENG J Z, LIU Y, et al. Screening proteins interacting with cocaine-and amphetamine-regulated transcript in bovine follicles by co-immunoprecipitation[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2015, 46(12): 2169–2175. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.007 (in Chinese) |
| [12] | HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc, 2009, 4(1): 44–57. DOI: 10.1038/nprot.2008.211 |
| [13] | TUSNÁDY G E, SIMON I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server[J]. Bioinformatics, 2001, 17(9): 849–850. DOI: 10.1093/bioinformatics/17.9.849 |
| [14] | HUNTER R G, PHILPOT K, VICENTIC A, et al. CART in feeding and obesity[J]. Trends Endocrinol Met, 2004, 15(9): 454–459. DOI: 10.1016/j.tem.2004.09.010 |
| [15] | KUHAR M J, JAWORSKI J N, HUBERT G W, et al. Cocaine-and amphetamine-regulated transcript peptides play a role in drug abuse and are potential therapeutic targets[J]. AAPS J, 2005, 7(1): E259–E265. DOI: 10.1208/aapsj070125 |
| [16] | MO C H, LV C, HUANG L, et al. Regulation of pituitary cocaine-and amphetamine-regulated transcript expression and secretion by hypothalamic gonadotropin-releasing hormone in chickens[J]. Front Physiol, 2019, 10: 882. DOI: 10.3389/fphys.2019.00882 |
| [17] | SEN A, BETTEGOWDA A, JIMENEZ-KRASSEL F, et al. Cocaine-and amphetamine-regulated transcript regulation of follicle-stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells[J]. Endocrinology, 2007, 148(9): 4400–4410. DOI: 10.1210/en.2007-0332 |
| [18] | LI P F, MENG J Z, JING J J, et al. Study on the relationship between expression patterns of cocaine-and amphetamine regulated transcript and hormones secretion in porcine ovarian follicles[J]. Biol Res, 2018, 51(1): 6. DOI: 10.1186/s40659-018-0154-y |
| [19] | LI P F, YU X J, XIE J S, et al. Expression of cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) in hen ovary[J]. Biol Res, 2017, 50(1): 18. DOI: 10.1186/s40659-017-0123-x |
| [20] | STERNBERG M J E. Protein structure prediction:a practical approach[M]. New York: Oxford Academy Press, 1996. |
| [21] | SÁNCHEZ R, ŠALI A. Comparative protein structure modeling in genomics[J]. J Comput Phys, 1999, 151(1): 388–401. DOI: 10.1006/jcph.1999.6200 |
| [22] | SIMPKIN A J, THOMAS J M H, SIMKOVIC F, et al. Molecular replacement using structure predictions from databases[J]. Acta Crystallogr D Struct Biol, 2019, D75(12): 1051–1062. |
| [23] | DODGE C, SCHNEIDER R, SANDER C, et al. The HSSP database of protein structure-sequence alignments and family profiles[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(1): 313–315. DOI: 10.1093/nar/26.1.313 |
| [24] | VETRIVEL I, DE BREVERN A G, CADET F, et al. Structural variations within proteins can be as large as variations observed across their homologues[J]. Biochimie, 2019, 167: 162–170. DOI: 10.1016/j.biochi.2019.09.013 |
| [25] | HOU J, WU T Q, CAO R Z, et al. Protein tertiary structure modeling driven by deep learning and contact distance prediction in CASP13[J]. Proteins, 2019, 87(12): 1165–1178. DOI: 10.1002/prot.25697 |
| [26] | BROWNE W J, NORTH A C T, PHILLIPS D C, et al. A possible three-dimensional structure of bovine α-lactalbumin based on that of hen's egg-white lysozyme[J]. J Mol Biol, 1969, 42(1): 65–86. DOI: 10.1016/0022-2836(69)90487-2 |
| [27] | BLUNDELL T L, SIBANDA B L, STERNBERG M J E, et al. Knowledge-based prediction of protein structures and the design of novel molecules[J]. Nature, 1987, 326(6111): 347–352. DOI: 10.1038/326347a0 |
| [28] | BLUNDELL T, CARNEY D, GARDNER S, et al. 18th sir Hans Krebs Lecture[J]. Eur J Biochem, 1988, 172(3): 513–520. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13917.x |
| [29] | WESSON L, EISENBERG D. Atomic solvation parameters applied to molecular dynamics of proteins in solution[J]. Protein Sci, 1992, 1(2): 227–235. |
| [30] | MACARTHUR M W, THORNTON J M. Conformational analysis of protein structures derived from NMR data[J]. Proteins, 1993, 17(3): 232–251. DOI: 10.1002/prot.340170303 |
| [31] | GANTZ I, KONDA Y, YANG Y K, et al. Molecular cloning of a novel receptor (CMKLR1) with homology to the chemotactic factor receptors[J]. Cytogenet Cell Genet, 1996, 74(4): 286–290. DOI: 10.1159/000134436 |
| [32] | HE R, SONG Y, YIN W, et al. The Chemerin-CMKLR1 axis aggravates staphylococcus aureus skin infection via inhibition of IL-33-induced neutrophil recruitment[J]. Eur J Immunol, 2019, 49(Supp3): 1137–1138. |
| [33] | KUMAR V, LAJEVIC M, PANDRALA M, et al. Novel CMKLR1 inhibitors for application in demyelinating disease[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 7178. DOI: 10.1038/s41598-019-43428-8 |
| [34] | MARIANI F, RONCUCCI L. Chemerin/chemR23 axis in inflammation onset and resolution[J]. Inflamm Res, 2015, 64(2): 85–95. DOI: 10.1007/s00011-014-0792-7 |
| [35] | ROURKE J L, DRANSE H J, SINAL C J. Towards an integrative approach to understanding the role of chemerin in human health and disease[J]. Obes Rev, 2013, 14(3): 245–262. DOI: 10.1111/obr.12009 |
| [36] |
朱芷葳, 郝庆玲, 侯淑宁, 等. 牛卵泡TEDDM1表达特点及其功能分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(6): 1189–1197.
ZHU Z W, HAO Q L, HOU S N, et al. Expression characteristic and function analysis of TEDDM1 in bovine follicle[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(6): 1189–1197. (in Chinese) |
| [37] |
郝庆玲, 景炅婕, 侯淑宁, 等. 基于Label-free技术分析牛卵泡蛋白质组分及关键调控蛋白[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(5): 983–992.
HAO Q L, JING J J, HOU S N, et al. Proteomic analysis of follicular components and key regulatory proteins in bovine based on label-free technology[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(5): 983–992. (in Chinese) |
| [38] | KIM J Y, XUE K, CAO M J, et al. Chemerin suppresses ovarian follicular development and its potential involvement in follicular arrest in rats treated chronically with dihydrotestosterone[J]. Endocrinology, 2013, 154(8): 2912–2923. DOI: 10.1210/en.2013-1001 |
| [39] | GARCES M F, SANCHEZ E, ACOSTA B J, et al. Expression and regulation of chemerin during rat pregnancy[J]. Placenta, 2012, 33(5): 373–378. DOI: 10.1016/j.placenta.2012.02.007 |
| [40] | WANG Q, KIM J Y, XUE K, et al. Chemerin, a novel regulator of follicular steroidogenesis and its potential involvement in polycystic ovarian syndrome[J]. Endocrinology, 2012, 153(11): 5600–5611. DOI: 10.1210/en.2012-1424 |