2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education/Sichuan Province, Chengdu 610041, China
随着生活水平的提高，人们对生活质量有着更高的要求，羊肉因具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特性越来越受人们的喜爱。研究表明，畜禽的产肉性能和肉品质离不开对骨骼肌生长发育及肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量的研究。肌内脂肪是影响肉质的重要因素之一，羊肉IMF的沉积受多种因素影响，其中功能基因和信号通路在这个过程中发挥着重要调控作用[1]，比如肉碱脂酰转移酶Ⅰ (carnitine palmityl transferaseⅠ，CPT1)和瘦素蛋白受体基因(obesa receptor，OBR)等功能基因[2-3]，以及Wnt/β-catenin信号通路和TGF-β等信号通路[4]。其中，TGF-β信号通路是脂肪细胞分化和脂代谢的经典通路之一。
Smads蛋白家族在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导，是TGF-β家族的直接作用底物[5]。研究表明，Smad家族多种蛋白参与人和小鼠肌肉生长的调控，还有调节细胞的增殖、分化、凋亡和成熟等功能[6-7]。研究表明，大多数TGF-β调节的R-Smad转录活性和生物学作用与Smad3相关[8]，Li等[9]研究发现，Smad3的过表达抑制正常和TGF-β1表达上调的鸡系卫星细胞中MyoD和肌细胞生成素的表达；Yang等[10]研究表明，Smad3的强制表达降低了化学诱导鼠模型对肝细胞癌的易感性；Ashcroft等[11]研究表明，缺乏Smad3的小鼠可以加速伤口愈合和局部炎症反应受损。Hu等[12]研究表明，Smad3介导TGF-β诱导α-平滑肌肌动蛋白的表达。在脂肪方面的研究指出，全反式脂肪酸通过TGF-β1/Smad3信号通路抑制脂肪多糖的牛脂肪细胞炎症反应[13-16]；有研究指出，TGF-β/Smad3抑制小鼠3T3-F442A脂肪细胞的分化[9, 17]，Zhang等[18]研究表明，Kruppel样转录因子6(Kruppel like factors 6, KLF6)、KLF15、KLF7及骨髓锌指1(myeloid zinc finger 1, MZF1)通过与Smad3基因核心启动子区结合，促使Smad3基因表达反式激活，进而调控牛肌肉细胞和前体脂肪细胞的生长发育; Li等[9]研究发现，TGF-β1可下调Smad3的表达，从而通过TGF-β1/Smad3信号通路负反馈调控鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，过表达Smad3基因可抑制肌卫星细胞中MyoD(成肌分化抗原，参与形成肌肉细胞和肌细胞分化过程)和肌生成素的表达；Islam等[19]研究发现，Smad3蛋白介导TGF-β1调控猪膀胱上皮细胞转化为间充质细胞，结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶-9在细胞纤维化的发生、发展过程中均依赖于Smad3蛋白的参与；Lin等[20]研究发现，CXCL-12诱导的结缔组织生长因子表达被SIS3(Smad3抑制剂)和Smad3 siRNA减弱；Lu等[21]研究发现，1, 25(OH)2D3通过限制HLP大鼠的TGF-β/Smad信号通路来改善脂代谢、肝功能和动脉粥样硬化损伤。但目前尚未见关于Smad3基因对山羊脂肪细胞影响的报道。
本试验以简州大耳羊为研究对象，利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列，利用实时荧光定量PCR技术检测Smad3基因在山羊不同组织和不同分化阶段脂肪细胞中的表达模式，探讨干扰Smad3对山羊肌内和皮下前体脂肪细胞的影响及可能的作用途径，为最终阐明Smad3基因调控山羊脂肪细胞分化的分子机理提供重要的数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究所用试验动物为体况良好的1周岁简州大耳羊(n=5)，空腹24 h后进行屠宰，取其心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、腹间脂肪和皮下脂肪储存在液氮中带回实验室。
1.2 试验试剂大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞、gDNAse、DNA MarkerⅢ (MD103)购自天根生化科技有限公司(北京)，Trizol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit购自Thermo公司(美国)，QuantiFastTMSYBR Green PCR Kit、限制性核酸内切酶Hind Ⅲ购自TaKaRa公司(大连)，胎牛血清(FBS)购自Gemini公司，Gel Extraction kit和高纯度质粒小提中量试剂盒购自QIANGEN公司(德国)。
1.3 试验方法 1.3.1 Smad3基因克隆和生物信息学分析利用Trizol试剂提取背最长肌组织总RNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，利用分光光度计NanoDrop ND-1000 (Agilent，美国)测定RNA样品浓度，A260 nm/A280 nm值范围为1.9~2.1。使用Thermo公司反转录试剂盒，取1 μg总RNA为模板进行反转录，将获得的cDNA置于-20 ℃保存。
根据GenBank的山羊预测序列(XM_013966776.2)，用Primer Premier 5.0设计引物(表 1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成引物。先用RT-PCR法对目的基因进行克隆，PCR反应体系:ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，Taq聚合酶12.5 μL，上下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL。克隆程序:98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以Gel Extraction Kit回收目的片段；构建pClone007载体后转化DH5α感受态细胞；挑取阳性菌落进行PCR鉴定(PCR条件同基因克隆PCR)，最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
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表 1 引物序列信息 Table 1 The information of primer sequence |
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表 2 siRNA的引物序列 Table 2 The information of siRNA sequence |
通过NCBI网站的ORF Finder寻找开放阅读框(open reading frame，ORF)；通过ProtParam在线分析编码蛋白的理化性质；利用DNAMAN软件比较不同生物的氨基酸序列。采用MEGA 5.0构建进化树；利用The CD search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析生物学功能。利用STRING (https://string-db.org/)交互式数据库分析Smad3蛋白的互作蛋白。
1.3.2 Smad3的组织和细胞时序表达取出低温保存的原代山羊肌内和皮下脂肪细胞，进行细胞复苏及传代培养，诱导分化前用完全培养基(包含谷氨酰胺和HEPES的DMEM/F12，10% FBS，1% Opti)进行传代培养。当传至F3代后加入诱导分化液(完全培养基+50 μmol·L-1油酸)进行诱导分化，并分别收集0、12、24、36、48、60和96 h的细胞，提取总RNA，合成cDNA。根据前面获得的山羊Smad3基因序列设计特异性引物，qPCR的引物信息见表 1。以上述cDNA为模板分析Smad3基因在肌内和皮下脂肪细胞和组织的相对表达水平。通过使用SYBR Green(TaRaKa)试剂盒和CFX96(Bio-Rad)进行扩增，选择泛表达转录子基因(UXT)作为试验的内参基因[22]，反应体系为20 μL:SYBR Green 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL，RNase-free H2O 7 μL。qPCR程序:95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共39个循环。每个待测样本设2个重复。
1.3.3 干扰Smad3对山羊脂肪细胞分化的影响 1.3.3.1干扰效率的检测：取出低温保存的原代肌内和皮下脂肪细胞，进行细胞复苏及传代培养，当脂肪细胞汇合到60%~80%时进行两次传代培养，传至F3代时加入诱导分化液(50 μmol·L-1油酸)进行诱导分化，在Invitrogen公司合成的两种siRNA分别命名为siSmad3-1和siSmad3-2(表 2)，并分别转染肌内和皮下脂肪细胞，转染方法：24孔板每孔加入225 μL Opti，放入培养箱饥饿处理；4 h后取出加入25 μL Opti，1.5 μL RNAimax，1 μL siRNA；培养6 h后换诱导液，48 h后收集细胞。
1.3.3.2形态学检测(油红O染色)干扰Smad3对山羊脂肪细胞分化的影响：将肌内和皮下脂肪细胞培养在24孔板中，用PBS洗涤两次后，再用200 μL甲醛溶液固定30 min，并用300 μL油红O溶液染色20 min，在显微镜下观察并拍照。最后每孔加入250 μL异丙醇溶液提取细胞内脂质，测量492 nm处的吸光度。
1.3.3.3干扰Smad3对分化标志基因及Smads和TGF-β1的影响：为了探讨Smad3调控山羊脂肪细胞分化的机制，本研究利用qPCR检测了干扰Smad3后脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF15及Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1表达的变化。反应体系以及反应程序参照上述组织表达方法。
1.3.4 统计分析qPCR结果利用2-ΔΔCt法进行分析[23]。使用SPSS20.0软件对数据进行分析，所有数据用“均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 山羊Smad3基因的克隆与生物信息学分析以山羊背最长肌cDNA为模板，通过克隆获得山羊Smad3基因序列1 499 bp，通过序列分析得到山羊Smad3基因的CDS为1 278 bp(登录号：MN197543)，编码425个氨基酸，山羊Smad3蛋白分子量(MW)是48.08 ku，等电点(PI)是6.73，比例最高的氨基酸种类是Leu(8.7%)，负电荷氨基酸碱基(天冬氨酸D+谷氨酸E)数量为43，正电荷氨基酸碱基(精氨酸R+赖氨酸K)数量为41。预测发现有一个锌指结构(图 1)。对各个物种进行Smad3氨基酸序列比对发现，该基因序列高度保守，山羊Smad3的氨基酸序列与绵羊、小鼠、人的氨基酸序列基本一致，与牛的氨基酸序列相似性达99%(图 2C)，根据这些氨基酸序列绘制系统进化树，可见山羊与绵羊的亲缘关系最近，牛次之，其次是牦牛与猪，与原鸡亲缘关系最远(图 2D)。Smart在线软件分析显示，该蛋白可能与FYVE结构域蛋白9(zinc finger FYVE domain-containing protein 9, ZFYVE9)、FYVE结构域蛋白16(zinc finger FYVE domain-containing protein 16, ZFYVE16)、激活素2A型受体(activin receptor type-2A, ACVR2A)、激活素1型受体(activin receptor type-1, ACVR1)、激活素1B型受体(activin receptor type-1B, ACVR1B)、激活素2B型受体(activin receptor type-2B, ACVR2B)、转录生长因子1(transforming growth factor, beta receptor 1, TGF-β1)、转录生长因子2(transforming growth factor, beta receptor 2, TGF-β2)、Smads蛋白2(drosophila mothers against decapentaplegic protein2, Smad2)、Smads蛋白4(drosophila mothers against decapentaplegic protein4，Smad4)存在相互作用(图 2E)。
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第一行是山羊Smad3的cDNA区的核苷酸序列，第二行是山羊cDNA区的氨基酸序列。实线框内序列代表正向引物，下划线序列代表预测的锌指结构，虚线框内序列代表反向引物 The first line is the nucleotide sequence of the cDNA region of goat Smad3, and the second line is the amino acid sequence of goat cDNA region. Sequence in solid box is the forward primer, sequence underlined is the predicted zinc finger structure, sequence in dashed box is the reverse primer 图 1 山羊Smad3 cDNA区核苷酸和氨基酸序列 Fig. 1 Sequence of nucleotides and amino acids of goat Smad3 cDNA region |
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A. Smad3克隆的凝胶电泳图；B. Smad3克隆的菌液PCR凝胶电泳图；C.不同物种间Smad3蛋白的系统进化树；D.山羊Smad3氨基酸序列与其他物种生物学功能的相似性；E.预测的与山羊Smad3相互作用的蛋白 A. Gel electropherogram of the Smad3 clone; B. PCR gel electropherogram of bacterial strain of Smad3 clone; C. Phylogenetic tree of Smad3 protein among different species; D. The similarity of biological function of goat Smad3 with the other species; E. Predicted interacting proteins with goat Smad3 图 2 山羊Smad3基因的序列分析 Fig. 2 Sequence analysis of goat Smad3 gene |
以UXT为内参，心脏组织为校准样本，其余组织为测试样本，利用2-ΔΔCt法计算Smad3基因在各组织中相对表达量，结果显示，Smad3基因在山羊各组织中存在广泛表达，且在肾脏中表达水平最高，极显著高于其他组织(P < 0.01)，其次是腹脂和臂三头肌中也存在较高水平的表达(图 3A)。Smad3基因在山羊肌内和皮下脂肪细胞两种细胞中的表达趋势相似，均是在分化后低于未分化的表达水平，且在36 h表达水平达到最低(P < 0.01，图 3B、3C)。
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A. Smad3的山羊组织表达谱；B. Smad3在山羊肌内脂肪细胞分化过程中的时序表达；C. Smad3在山羊皮下脂肪细胞分化过程中的时序表达。*. P < 0.05，**. P < 0.01，下同 A. The expression profile of Smad3 gene in different tissues of goat; B. The temporal expression of Smad3 during intramuscular adipocyte differentiation; C. The temporal expression of Smad3 during subcutaneous adipocyte differentiation. *. P < 0.05, **. P < 0.01, the same as below 图 3 山羊Smad3在组织和细胞的时序表达水平 Fig. 3 The temporal expression levels of Smad3 in goat tissues and cells |
分别转染两对Smad3-siRNA入山羊肌内和皮下前体脂肪细胞并诱导分化48 h，利用qPCR检测Smad3干扰效率，结果显示，与Negative Control(NC)组相比，肌内脂肪细胞的siSmad3-1干扰效率为36%，siSmad3-2干扰效率为64%，皮下脂肪细胞的siSmad3-1干扰效率为61%，siSmad3-2干扰效率达到72%(图 4A、4B)，因此，后续试验均以siSmad3-2进行。
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A.肌内脂肪细胞分化48 h干扰Smad3后，通过qPCR检测Smad3的相对表达水平；B.皮下脂肪细胞分化48 h干扰Smad3后，通过qPCR检测Smad3的相对表达水平；C.肌内脂肪细胞分化期间油红O染色，在492 nm处检测的OD值；D.皮下脂肪细胞分化期间油红O染色，在492 nm处检测的OD值；E.肌内脂肪细胞分化期间感染对照siRNA(上)和siSmad3-2(下)细胞的油红O染色图片(200×)；F.皮下脂肪细胞分化期间感染对照siRNA(上)和siSmad3-2(下)细胞的油红O染色图片(200×) A. Relative mRNA expression of Smad3 detected by qPCR after interfering Smad3 for 48 h during intramuscular adipocyte differentiation; B. Relative mRNA expression of Smad3 detected by qPCR after interfering Smad3 for 48 h during subcutaneous adipocyte differentiation; C. The OD value detected at 492 nm after Oil red O staining during intramuscular adipocyte differentiation; D. The OD value detected at 492 nm after Oil red O staining during subcutaneous adipocyte differentiation; E. The photographs of Oil red O stained from the cells infected control siRNA (up) and siSmad3-2 (down) during intramuscular adipocyte differentiation (200×); F. The photographs of Oil red O stained from the cells infected control siRNA (up) and siSmad3-2 (down) during subcutaneous adipocyte differentiation (200×) 图 4 干扰Smad3对脂肪细胞分化的影响 Fig. 4 The effect of interfering Smad3 on adipocyte differentiation |
油红O染色结果显示，肌内和皮下脂肪细胞的492 nm的OD值显著升高(P < 0.05)(图 4C、4D)，siSmad3-2组脂滴积聚增加，并明显多于对照组(图 4E、4F)。
2.4 干扰山羊Smad3对分化标志基因表达的影响由形态学观察可见干扰Smad3促进山羊前体脂肪细胞分化，为了明确其可能发挥作用的途径，本研究检测了干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因：CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、脂蛋白酶(LPL)、前脂肪细胞因子1(Pref-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、脂肪细胞结合蛋白2(AP2)及Kruppel样转录因子(Kruppel-like factors，KLF，包括KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15)表达的影响。干扰Smad3使山羊肌内和皮下脂肪细胞中LPL、SREBP1、AP2、C/EBPα、C/EBPβ、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的相对表达水平显著上升(P < 0.05)，Pref-1的相对表达水平极显著下降(P < 0.01，图 5A、5B)。但干扰Smad3后山羊肌内和皮下脂肪细胞的PPARγ和KLF6、KLF7的相对表达水平没有发生显著变化。
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A.干扰Smad3对山羊肌内脂肪细胞中C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15相对表达水平的影响；B.干扰Smad3对山羊皮下脂肪细胞中C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15相对表达水平的影响 A. The effect of interfering Smad3 on the relative expression level of C/EBPα, C/EBPβ, LPL, SREBP1, AP2, PPARγ, Pref-1, KLF3, KLF4, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10 and KLF15 during intramuscular adipocyte differentiation; B.The effect of interfering Smad3 on the relative expression level of C/EBPα, C/EBPβ, LPL, SREBP1, AP2, PPARγ, Pref-1, KLF3, KLF4, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10 and KLF15 during subcutaneous adipocyte differentiation 图 5 干扰Smad3对山羊肌内和皮下脂肪细胞中相关基因表达的影响 Fig. 5 Effects of interfering Smad3 on the expression of related genes in goat intramuscular and subcutaneous adipocytes |
根据与山羊Smad3互作的蛋白质预测结果以及Smad2、Smad4和Smad7在山羊肌内和皮下脂肪细胞的时序表达趋势(图 6A、6B、6C)，推测，Smad2和Smad4可能与Smad3蛋白存在相互作用，为了探讨Smad3基因调控山羊前体脂肪细胞分化的作用机制，本研究检测了Smad2、Smad4及TGF-β1、TGF-β信号传导的有效抑制剂Smad7的表达水平变化。结果发现，干扰Smad3后山羊肌内和皮下脂肪细胞中Smad2、Smad4和Smad7的相对表达水平极显著下降(P < 0.01)，但TGF-β1基因表达变化不显著(图 6D)。
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A. Smad2在山羊肌内(左)和皮下(右)脂肪细胞分化过程中的时序表达；B. Smad4在山羊肌内(左)和皮下(右)脂肪细胞分化过程中的时序表达；C. Smad7在山羊肌内(左)和皮下(右)脂肪细胞分化过程中的时序表达；D.干扰Smad3对肌内(左)和皮下(右)脂肪细胞分化过程中Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1相对表达的影响 A. Temporal expression of Smad2 during intramuscular (left) and subcutaneous (right) adipocytes differentiation in goats; B.Temporal expression of Smad4 during intramuscular (left) and subcutaneous (right) adipocytes differentiation in goats; C. Temporal expression of Smad7 during intramuscular (left) and subcutaneous (right) adipocytes differentiation in goats; D. Effects of interfering Smad3 on relative expression level of Smad2, Smad4, Smad7 and TGF-β1 during intramuscular (left) and subcutaneous (right) adipocytes differentiation 图 6 干扰Smad3对Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1相对表达水平的影响 Fig. 6 The effect of interfering Smad3 on the relative expression level of Smad2, Smad4, Smad7 and TGF-β1 |
Zhang等[18]研究报道，Smad3基因是肌肉和脂肪组织生长和发育的负调节因子。Smad3可以与MyoD的碱性螺旋-环-螺旋结构域结合并阻断MyoD-E12/47二聚体的形成[24]，从而抑制脂肪形成。因此，探讨Smad3在山羊脂肪细胞中的作用机制显得尤为重要。
本研究克隆得到山羊Smad3基因序列，SMART分析发现，Smad3蛋白同ACVR1A和ACVR2B等激酶存在相互作用，而ACVR1A和ACVR2B等是丝氨酸/苏氨酸激酶[25]，并且丝氨酸与苏氨酸在脂肪和脂肪酸的调控作用中有着重要的作用，所以推测，Smad3基因可能与脂肪和脂肪酸代谢调控密切相关。为了明确山羊Smad3的组织表达特性，本研究利用qPCR技术检测了山羊Smad3在山羊不同组织中的相对表达水平，结果发现，Smad3在肾脏中表达水平最高。同时发现，Smad3在腹脂和股二头肌中也存在较高水平的表达，推测Smad3可能参与山羊肌肉生长和脂肪细胞分化等相关生理过程。本研究结果与其他学者在其他物种中的报道存在相似及不同之处，如Mitsui等[26]指出，Smad3在牛的重瓣胃、瘤胃和背最长肌中存在高水平表达，程萱等[27]研究表明，Smad3在小鼠骨骼肌、肾和大脑中高水平表达，刘育林[28]研究发现，Smad3在鸡心脏、胃和脑中表达量较高。综合上述报道，推测Smad3的组织表达可能具有物种特异性。
3.2 Smad3对山羊脂肪细胞分化的影响研究表明，Smad3蛋白可以调控脂肪生成[27]，然而具体机制尚不清楚，因此，本研究探讨了Smad3在山羊前体脂肪细胞生成及调节中的作用。结果发现，Smad3基因在山羊肌内和皮下脂肪细胞诱导分化36 h的表达量最低，在获得其表达模式的基础上本研究同时研究了干扰Smad3对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响，结果表明，干扰Smad3对山羊肌内和皮下脂肪细胞脂质积累都有影响，脂质积累呈上升趋势，492 nm处的OD值升高，结果表明，Smad3基因可能负调控山羊脂肪细胞分化。Tsurutani等[29]研究证明，TGFβ-SMAD3信号通路抑制前体脂肪细胞群中的脂肪形成，Zhang等[18]研究发现，Smad3基因抑制牛前体脂肪细胞的分化，Choy等[13]研究表明，Smad3在3T3-F442A细胞中表达，但mRNA水平在分化期间没有显著变化；Zhou等[30]研究发现，TGF-β/Smad3信号通路可抑制人骨髓基质细胞脂肪细胞生成。这些报道与本研究的结果存在相似及不同之处，由此推测，Smad3基因在不同物种的脂肪细胞调控过程中可能存在物种特异性。
3.3 Smad3基因对脂肪细胞分化可能的作用机制本研究明确了干扰Smad3可以促进山羊肌内和皮下脂肪细胞脂滴的积聚，为了进一步阐明其可能的作用途径，本研究检测了在山羊皮下和肌内脂肪细胞中干扰Smad3后脂肪细胞分化标志基因的表达变化，结果发现，干扰Smad3导致LPL、SREBP1、AP2、C/EBPα、C/EBPβ、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的相对表达水平上升，Pref-1的相对表达水平明显下降。在之前的研究中证明，C/EBPα为脂肪分化的关键基因，由C/EBPβ和C/EBPδ激活[31]，与PPARγ和SREBP1结合，同时调节AP2、LPL和脂肪酸合成酶(FAS)的表达[32-33]；有研究表明，转录因子KLF6、KLF15、KLF7和MZF1可能是Smad3基因的顺式作用元件，对其表达量有调节作用，研究发现，KLFs是调节脂肪分化的关键因子[34-35]，KLF4、KLF8和KLF15可促进脂肪分化[36-40]，KLF3、KLF9和KLF10抑制脂肪分化[41-42]，表明干扰Smad3的相对表达水平被KLF3、KLF9和KLF10拮抗，干扰Smad3的相对表达水平对KLF4、KLF8和KLF15具有正反馈调节，说明Smad3的转录活性可能依赖于KLF3、KLF4、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15转录因子的调控。蛋白互作预测发现，ZFYVE9、ACVR2A和ACVR2B蛋白与Smad3相互作用，Liu和Inman等[43-44]研究发现，ZFYVE9促进Smad信号传导的有效调节，ZFYVE9最初被认定为Smad2/3的配偶体，研究表明，ZFYVE9可以调节TGF-β信号进而调节脂肪的生成。Olsen等[25]研究发现，激活素蛋白受体是TGF-β配体家族的成员，经典ALK4-ACVR2受体复合物通过激活素A激活转录因子Smad2和Smad3进而调控脂肪的分化。为了探讨Smad3与上述蛋白之间可能的作用机制，本研究同时探讨了干扰Smad3对Smads和TGF-β1表达的影响，发现在干扰Smad3的山羊肌内和皮下脂肪细胞中Smad2、Smad4和Smad7的相对表达水平明显下降。有研究报道，干扰人胎儿间质干细胞的Smad3基因表达未对Smad2的相对表达水平产生显著影响[45-46]，马松林等[47]研究报道，在人胰腺纤维化组织中Smad3与Smad7的表达水平呈负相关，这可能是由于Smad3基因在调控脂肪分化中具有物种特异性。同时有研究报道，Smad4激活TGF-β信号通路，从而抑制脂肪的分化[48]，表明Smad4抑制脂肪的分化，所以干扰Smad3对Smad4的表达可能具有正反馈效应。Smad3蛋白质存在2Fe-2S铁氧还蛋白型铁硫结合区，其能与Isu1和Jac1结合为Jac1-Holo-Isu1复合体，此复合体能结合ATP调节生物化学反应，因此推测，干扰Smad3蛋白可通过调节ATP生物化学反应来进一步调节脂肪和脂肪酸的代谢，这需要通过体内和体外试验进一步研究Smad3蛋白在脂肪生成中更深层的作用机制。
4 结论本研究成功克隆得到了山羊Smad3基因cDNA序列，其中CDS区长1 278 bp，编码425个氨基酸；Smad3基因在山羊各个组织广泛表达，其中在肾脏中相对表达水平最高；Smad3在山羊肌内和皮下脂肪细胞成脂诱导分化36 h表达水平最低；干扰Smad3后促进山羊肌内和皮下脂肪细胞分化，可能通过调控C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等的表达，并通过Smad2、Smad4和Smad7促进山羊肌内和皮下脂肪细胞分化，本研究结果为进一步阐明Smad3基因调控山羊不同部位脂肪沉积的分子机理提供重要的理论依据。
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