产肠毒素型大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起初生仔猪腹泻的重要病原菌^[1]。ETEC感染仔猪后可引起肠道炎症，造成肠系膜淋巴结出血、肿大等^[2]。小鼠灌服ETEC后其肠道结构受到严重损伤，外周血炎性因子表达量升高，因此该模型可作为研究肠炎的理想模型^[3]。肠道损伤诱导产生的出血、炎症等反应与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)和核转录因子NF-κB信号通路密切相关^[4]。白介素6(IL-6)是组织损伤的重要炎性介质，参与机体的应激反应和免疫应答^[5]。MAPK家族蛋白由ERK1/2、P38和JNK组成，介导胞外信号引起的核反应信息传递，参与应激刺激、细菌产物、炎症介质等引起的细胞反应^[6-7]。

抗生素作为促生长药物饲料添加剂即将退出历史舞台，对饲料原料目录中天然植物的相关研究引起了大家的广泛关注。黄芩具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗过敏等作用^[8]，可用于治疗动物的炎性肠病。但是黄芩对小鼠肠炎模型损伤修复的调控机制未见报道。基于以上理解，本文用ETEC感染小鼠建立肠炎模型并灌服不同剂量的黄芩水提液, 从空肠的组织形态、组织损伤相关信号通路表达等方面，探讨黄芩对小鼠肠炎模型空肠损伤修复的作用，为黄芩治疗动物炎性肠病提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验样品及来源

中药药材：黄芩(陕西产区，生药)，采购于湛江市大参林药店；ETEC冻存菌液(中国兽医药品监察所，CVCC ETEC strain 200)；6周昆明系小白鼠30只，雌、雄混合饲喂。

1.2 主要试剂

苏木精染液、伊红染液购自Labcoms^TM Life Science公司，Trizol reagent购自美国Invitrogen公司(货号15596-026)，超纯水、Oligo(dT)18、dNTPs (10 mmol·μL^-1)、RNasin(40 U·μL^-1)、M-MLV逆转录酶缓冲液(5×Buffer)、M-MLV逆转录酶(200 U·L^-1)、2×SG Fast qPCR试剂盒等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 黄芩水提液的制备

用纯净水没过药材，煎煮黄芩30 min，倒出后加水再次煎煮30 min，将2次煎煮药液合并。将合并的药液继续煎煮，浓缩至1.5 g·mL^-1(低剂量组)，3 g·mL^-1(中剂量组)和6 g·mL^-1(高剂量组)，备用。

1.4 动物分组及处理、样品采集

将30只昆明系小鼠随机分为五组，即对照组、模型组、黄芩水提液的低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6只。适应性生长7 d后开始试验，每天定时称小鼠体重。对照组和模型组内每只小鼠每天灌胃0.2 mL生理盐水，黄芩水提液组每只小鼠每天灌胃0.2 mL黄芩水提液(低剂量组0.3 g·d^-1, 中剂量组0.6 g·d^-1，高剂量组1.2 g·d^-1), 连续灌胃6 d。第7天开始，对照组每只小鼠每天灌胃0.4 mL生理盐水，模型组和黄芩水提液组小鼠灌服0.4 mL浓度为3×10⁸ CFU·mL^-1的ETEC菌液，持续灌服3 d。第10天试验结束，摘除眼球采血，将采集到的血液样品进行血常规检测；脱臼处死小鼠并剖检，取空肠组织，用生理盐水洗净后，分段备用。

1.5 组织切片和HE染色

将分段的空肠置于中性福尔马林液中固定72 h后制作石蜡切片，并进行HE染色，中性树胶封片。光镜下详细观察各组内小鼠空肠组织结构形态的变化情况，用Olympus Image Analysis System图像分析系统拍照。用Image J软件测量视野内空肠绒毛的高度和隐窝深度(绒毛根数n>5)，计算绒毛高度与隐窝深度的比值。

1.6 RNA提取、反转录及荧光定量PCR

分段的空肠分割成绿豆粒大小放入冻存管，液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存。取出后置于带有液氮的研钵中，研磨至粉状。用TRIzol总RNA提取试剂盒提取小鼠空肠总RNA。用两步法进行RNA逆转录，总反应体系为25 μL。首先配备反应体系13 μL(总RNA模板1.0 μg，Oligo (dT) 18为1.0 μL，DEPC水11 μL)，PCR仪中70 ℃进行变性反应5 min，立即冰浴3 min。接着，在反应体系中加入以下试剂：1.25 μL的dNTPs (10 mmol·μL^-1)，0.5 μL的RNasin (Ribonuclease Inhibitor, 40 U·μL^-1)，5.0 μL的M-MLV逆转录酶缓冲液5 × Buffer，1.0 μL的M-MLV逆转录酶(200 U·L^-1)，以及4.25 μL的DEPC水。PCR仪中42 ℃反应1 h，将产物cDNA立即使用或-20 ℃保存。

用荧光定量PCR (SYBR Green I)的方法对各组内空肠IL-6、ERK、JNK和P38 mRNA的表达量进行测定。目的基因IL-6、ERK、JNK和P38及内参基因β-actin的引物序列见表 1。

按照SYBR Green qPCR试剂盒说明书配制20 μL反应的体系：Mix (2 ×) 10 μL，cDNA模板+DEPC水8.0 μL，上、下游引物各1.0 μL。反应体系混匀后立即放入实时荧光定量PCR仪中，反应条件如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40次；72 ℃再延伸8 min。熔解曲线反应条件如下：95 ℃ 1 min；58 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。

基因相对表达量计算公式如下：

相对含量=2^-ΔΔCt，ΔΔCt =处理组ΔCt (目的基因-β-actin) -对照组ΔCt (目的基因-β-actin)。

1.7 统计学分析

运用Microsoft Excel做统计学处理，应用统计软件SPSS 20.0进行两个独立样本的t检验。试验结果采用Origen6.0绘图软件制图。

2 结果 2.1 小鼠体重及外周血淋巴细胞比率变化

与对照组相比，模型组小鼠的体重和外周血淋巴细胞比率没有显著差异(图 1)。与模型组相比，黄芩水提液高剂量组的小鼠体重第8天和第9天显著升高(P < 0.05)。小鼠外周血常规结果发现，仅有外周血淋巴细胞比率发生了变化。与模型组相比，黄芩水提液低剂量组小鼠外周血淋巴细胞比率显著升高(P < 0.05)，中剂量组和高剂量组的淋巴细胞比率极显著升高(P < 0.01)，表明黄芩水提液促进了小鼠外周血淋巴细胞的增殖。

2.2 IL-6 mRNA表达量变化

结果如图 2所示，与对照组相比，模型组空肠IL-6 mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)。相比于模型组，黄芩水提液低、中、高剂量组内小鼠空肠IL-6 mRNA表达量均极显著下降(P < 0.01)，表明黄芩水提液显著降低了ETEC诱导的空肠IL-6 mRNA的表达。

2.3 空肠形态观察

正常情况下，小鼠空肠绒毛结构完整，排列有序，肠隐窝结构正常(图 3A)。与对照组相比，模型组小鼠空肠绒毛结构受到严重破坏，空肠绒毛多从根部脱落(图 3B)，模型组空肠绒毛高度与隐窝深度的比值极显著下降(图 4，P < 0.01)。与模型组相比，黄芩水提液低剂量组小鼠空肠绒毛结构受到的破坏较为严重(图 3C)；中剂量组小鼠空肠绒毛结构相对保持完整，仅在绒毛顶端断裂少许(图 3D)；高剂量组空肠肠绒毛分布较为整齐，有大量的绒毛包裹成团脱落至肠腔，肠隐窝结构正常(图 3E)。与模型组相比，黄芩水提液中剂量组(P < 0.01)和高剂量组(P < 0.05)空肠绒毛高度与隐窝深度比值显著升高(图 4)。

2.4 空肠MAPKs mRNA表达变化

由图 5A可知，与模型组相比，黄芩水提液低剂量组、中剂量和高剂量组JNK mRNA表达量显著降低(P < 0.05)。由图 5B可知，与模型组相比，黄芩水提液低剂量组ERK mRNA表达量显著下降(P < 0.05)，中、高剂量组ERK mRNA表达量极显著下降(P < 0.01)。各组间小鼠空肠P38 mRNA表达量无显著变化。

3 讨论

前人研究发现，用1.0×10⁷CFU·mL^-1和1.0×10⁹ CFU·mL^-1的ETEC菌液，连续3 d给小鼠灌胃0.2 mL，均可成功建立小鼠肠炎模型^[3]。本文采用3×10⁸ CFU·mL^-1的ETEC菌液，每天0.2 mL，连续4 d给小鼠灌胃，接种菌液浓度符合制备小鼠肠炎模型的条件。IL-6是组织损伤的重要炎性介质，还可加重炎症反应和功能障碍^[9]。与对照组相比，小鼠肠炎模型组空肠IL-6 mRNA表达量显著升高，提示空肠发生了炎症反应；相比于模型组，黄芩水提液各剂量组空肠IL-6 mRNA的表达量显著下降，表明黄芩水提液发挥了抗炎作用。研究表明，黄芩的主要成分黄芩苷可通过抑制NF-κb信号通路、低表达细胞间黏附分子1等途径发挥抗炎作用^[10-11]，因此，黄芩苷是黄芩水提液发挥抗炎作用的主要力量。黄芩水提液显著升高了小鼠外周血中淋巴细胞比率，这可能是黄芩苷显著促进了淋巴细胞的增殖所致^[12]。此外，黄芩苷还可通过调节免疫-内分泌网络促进胚胎着床和胎儿的生长发育^[13]，证实了黄芩水提液可对机体免疫系统进行调控。

与对照组相比，模型组小鼠空肠绒毛上皮脱落，空肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低，绒毛结构受到严重损伤，与前人结果相符^[14]。相比于模型组，黄芩水提液低、中、高剂量组的小鼠空肠结构也受到一定程度的破坏，但服用黄芩水提液的小鼠空肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著升高，绒毛结构也趋于完整，表明黄芩对ETEC诱导的空肠结构损伤起到了保护作用。研究表明，黄芩苷可促进猪肠道上皮细胞的增殖^[10]，含黄芩苷的术芩提取液(黄芩苷含量1.5%)对LPS损伤的猪肠道上皮细胞也具有增殖作用^[15]，表明黄芩水提液可通过促进肠上皮细胞增殖的方式对空肠损伤进行修复。黄芩苷还能上调肠道上皮细胞间紧密连接的表达^[16]，这可能也是黄芩对空肠损伤进行修复的一种潜在途径。此外，肠道结构完整使得ETEC分泌的内毒素无法进入血液，也就不能激活内皮细胞释放细胞因子与炎性因子^[17]，从而进一步降低了空肠的炎症反应。本试验发现，高剂量黄芩水提液组小鼠肠绒毛结构完整，肠腔中有不断脱落的绒毛团，作者认为完整的肠道结构和降低的炎症反应是造成该组小鼠体重显著增长的重要原因。

在热应激条件下，激活的JNK/MAPK信号通路对大鼠的小肠黏膜结构造成损伤^[18]；JNK通路在细胞炎症过程中也发挥了重要的调控作用^[19]。本研究发现，与模型组相比，黄芩水提液组小鼠空肠炎性因子IL-6 mRNA的表达量显著下降，肠道结构得到显著改善，且JNK mRNA相对表达量显著降低，提示黄芩水提液可从降低肠道炎症因子的表达、抑制JNK信号通路两方面来维持肠道结构的完整性。有研究表明，丁酸反应因子可通过ERK / MAPK信号通路下调缓解脂多糖诱导的炎症^[20]。与模型组相比，黄芩水提液组空肠的炎症反应降低，ERK mRNA相对表达量降低，表明黄芩水提液在发挥抗炎作用时受到ERK信号通路的调控。黄芩的主要活性成分黄芩素可降低ERK蛋白的磷酸化以降低炎症^[21]，活化的ERK蛋白在细胞分化、增殖和存活过程中发挥了关键作用^[18]，因此，ERK蛋白磷酸化可能是黄芩水提液发挥抗炎作用、修复肠道损伤的重要途径，但具体的调控机制还有待于深入研究。黄芩水提液并未改变小鼠空肠内P38 mRNA的表达量，表明黄芩对空肠组织的损伤修复未经P38 MAPK信号通路。

4 结论

在小鼠肠炎模型中，黄芩水提液可通过降低空肠炎症反应和下调JNK/ERK mRNA的表达改善肠道组织结构，促进空肠的损伤修复。