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引用本文
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板芩桔甘合剂对传染性支气管炎病毒人工感染雏鸡的临床疗效分析
林春发1, 罗艺晨1, 王忠清1, 冯静波3, 刘娟1,2     
1. 西南大学动物科学学院, 重庆 402460;
2. 重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新研发实验室, 重庆 402460;
3. 无锡正大生物股份有限公司动物保健品厂, 新吴 214112
收稿日期：2019-08-19
基金项目：国家科技基础专项(2013FY110600-03)
作者简介：林春发(1993-), 男, 福建福清人, 硕士生, 主要从事中兽医药研究, E-mail:linchunfa123@163.com.
通信作者：刘娟, 主要从事中兽药研发与药理毒理学研究, E-mail:liujuanb@163.com.
摘要：旨在探讨板芩桔甘合剂（BQJGHJ）对传染性支气管炎病毒（IBV）人工感染雏鸡的临床疗效。选取120只雏鸡随机分为空白组、模型组（感染病毒）、阳性药物组（感染病毒+甘胆口服液）和BQJGHJ高、中、低剂量组（感染病毒+BQJGHJ），每组20只。除空白组外，其他组感染IBV造模，4 d后，各组分别饮水给药，连用5 d。每天观察各组雏鸡临床症状，记录临床症状记分，统计有效率、治愈率；在造模后，给药第3、5天，及停药后第2天分别自翅下静脉采集血液，分离血清，ELISA法检测感染雏鸡血清中IFN-γ、IL-6、IL-10含量变化。结果显示：BQJGHJ高、中、低剂量组的治愈率分别为75.0%、80.0%、65.0%，有效率分别为90.0%、95.0%、80.0%。模型组雏鸡血清中IL-10含量降低，IL-6含量升高，与空白组比较，差异显著（P < 0.05或P < 0.01）；在给药第3、5天时，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组雏鸡血清中IFN-γ（第5天时，高剂量组差异极显著，P < 0.01，其他时间、其他组差异均不显著）、IL-10含量（第5天时差异极显著，P < 0.01）升高，雏鸡血清中IL-6含量降低，与模型组比较，均差异显著（P < 0.05）。在停药后2 d，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组雏鸡血清中IFN-γ、IL-10含量升高，雏鸡血清中IL-6含量降低，与模型组比较，均差异显著（P < 0.05或P < 0.01）；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IFN-γ、IL-6、IL-10含量，与阳性药物组相比，无显著性差异（P>0.05）。BQJGHJ可提高传染性支气管炎雏鸡血清中IFN-r、IL-10的含量，降低传染性支气管炎雏鸡血清中IL-6的含量，发挥治疗鸡传染性支气管炎的作用。
关键词：板芩桔甘合剂    IBV-M41    IFN-γ    IL-6    IL-10    
The Clinical Efficacy of BQJGHJ (a Traditional Chinese Medicine Compound Pharmaceutics) in the Treatment of Chickens Artificially Infected with Infectious Bronchitis Virus
LIN Chunfa1, LUO Yichen1, WANG Zhongqing1, FENG Jingbo3, LIU Juan1,2     
1. College of Animal Science, Southwest University, Chongqing 402460, China;
2. Chinese Veterinary Herbal Drugs Innovation Research Lab, University Veterinary Science Engineering Research Center in Chongqing, Chongqing 402460, China;
3. Wuxi Zhengda Biological Co., Ltd. Animal Health Products Factory, Xinwu 214112, China
Corresponding author: LIU Juan, E-mail:liujuanb@163.com.
Abstract: This study was conducted to investigate the clinical efficacy of BQJGHJ, a traditional Chinese medicine compound pharmaceutics, in the treatment of chickens artificially infected with Infectious bronchitis virus (IBV). One hundred and twenty chicks were divided into blank group, model group (IBV infection), positive drug group (IBV infection & Gan Dan oral liquid), and BQJGHJ high, middle and low dose groups (IBV infection & BQJGHJ), 20 chicks in each group. Except for the blank group, the other groups were modeled by infecting IBV-M41 strain, 4 days after modeling, the medicines were administrated through drinking water for 5 days. The clinical symptoms of each group were observed every day, the scores of clinical symptoms were recorded, the effective rate was counted, and the cure rate was used as the evaluation index. On the 3rd, 5th and 7th day post the first administration, the blood samples were collected from the wing vein and the serum were separated. The contents of IFN-γ, IL-6 and IL-10 in chicks serum were detected by ELISA. The results indicated that the cure rates of BQJGHJ high, middle and low dose groups were 75.0%, 80.0% and 65.0%, and the effective rates were 90.0%, 95.0% and 80.0%, respectively. The content of IL-10 in serum of chicks in model group decreased and the content of IL-6 increased, which was significantly different from that in blank group (P < 0.05 or P < 0.01). On day 3 and 5 of administration, the contents of IFN-γ (P < 0.01 at day 5 in high dose group, P>0.05 for others) and IL-10(P < 0.01 at day 5 in eath BQJGHJ gruop and positive drug group) in serum of chicks in BQJGHJ high, middle and low dose groups and positive drug groups increased, while the contents of IL-6 in serum of chicks decreased, which were significantly different from those in model group (P < 0.05). On the 2nd day after withdrawal, the contents of IFN-γ and IL-10 in serum of chicks in BQJGHJ high, middle and low dose groups and positive drug groups increased, while the contents of IL-6 in serum decreased, which were significantly different from those in model group (P < 0.05 or P < 0.01); There was no significant difference in the contents of IFN-γ and IL-6, IL-10 in serum of chicks between each BQJGHJ group and the positive drug group (P>0.05). BQJGHJ can increase the content of IFN-γ, IL-10 in serum of chicks with infectious bronchitis, reduce the content of IL-6 in serum of chicks with infectious bronchitis, so as to achieve the effect of treating infectious bronchitis in chicks.
Key words: BQJGHJ    IBV-M41    IFN-γ    IL-6    IL-10    

传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是鸡的一种急性、高度接触传染的病毒性呼吸道和泌尿生殖道疾病，其特征是咳嗽、喷嚏、气管啰音和呼吸道黏膜呈浆液性卡他性炎症[1]。雏鸡常表现呼吸困难、流鼻液等呼吸道症状，有时会发生死亡；产蛋鸡则以产蛋量减少和蛋白品质下降较为常见[2]。本病一年四季都可发生，但以气候寒冷的季节较为严重，在现代养殖业中，由于养殖密度大、通风不良、过热、过冷、缺乏维生素和矿物质、饲料中的营养成分配比失当及其他不良应激因素会促进本病的发生，IB倍受兽医工作者的重视[3]。雏鸡感染传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)后，容易出现畏寒扎堆、甩头、打喷嚏、流鼻涕、双翅下垂、气管啰音等现象。雏鸡细胞免疫和体液免疫常发生一定程度的降低[4]。感染过程中伴随着炎症反应和免疫病理反应，涉及多种炎性细胞、炎症介质、免疫细胞和细胞因子，其中T淋巴细胞是主要的免疫细胞，其数量与比例是衡量机体免疫水平的重要指标[5]。IFN-γ、IL-6、IL-10在免疫调节、抗病毒和介导炎症反应等方面发挥着重要的生物学功能[6-7]。中兽医认为该病主要是由于感受风热，内侵于肺致肺失宣发和肃降，宜清热解毒、宣肺止咳、祛痰散结。板芩桔甘合剂(BQJGHJ)主要由板蓝根、黄芩、桔梗、甘草等中药提取制成，具有清肺化痰、止咳平喘的功能。本试验拟通过探究BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡疗效与血清中IFN-γ、IL-6、IL-10含量的影响，探讨板芩桔甘合剂治疗鸡传染性支气管炎的可能作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

21日龄健康三黄雏鸡，120羽，分笼饲养，饲养舍温度28~30 ℃，湿度55%~65%，自由饮水，试验前适应性饲养一周。饲喂以雏鸡配合饲料(510)，产品标准为GB/T 10262-1996，主要成分：粗蛋白质18.0%、粗灰分8.0%、粗纤维6.0%、粗脂肪2.5%、钙1.2%、赖氨酸0.8%、氯化钠0.8%、总磷0.5%、蛋氨酸0.3%。BQJGHJ：由无锡正大生物股份有限公司动物保健品厂提供，批号161215，包装100 mL·瓶-1，规格1 mL相当于原生药1.08 g。阳性对照药物：甘胆口服液，批号1807021B，北京生泰尔科技股份有限公司生产，包装200 mL·瓶-1，规格100 mL相当于原生药24.4 g。IFN-γ、IL-6、IL-10检测试剂盒购自厦门惠嘉生物技术有限公司，批号201811。试验毒株: IBV-M41毒株购自中国兽医微生物菌种保藏中心，批号AV1511。

1.2 主要仪器设备

高速离心机(THERMO公司ST16R)；隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司GNP-9080)；荧光定量PCR仪(Roche公司LightCycler 96)；-86 ℃超低温冷冻冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司DW-HL678)；酶标仪(BIO-RAD公司iMark)等仪器。

1.3 试验方法 1.3.1 雏鸡分组及处理

将适应性饲养一周的雏鸡120只随机分为空白组、模型组、阳性药物组和BQJGHJ高、中、低剂量组，每组20只。适应性喂养结束后，除空白组外，其余各组鸡给予IBV-M41株进行造模[8-11]；造模4 d后，除空白组、模型组自由饮水外，BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡分别进行饮水给药，每升饮水添加2.0、1.0和0.5 mL BQJGHJ；阳性药物组雏鸡饮水给药，每升饮水添加0.7 mL甘胆口服液，1次·d-1，连续给药5 d。各组雏鸡喂以基础日粮，自由采食。各组雏鸡在造模后、给药第3、5天及停药后第2天分别自翅下静脉采集血液(空白组同时采血)，每组均采集同号10只雏鸡，3 500 r·min-1离心10 min，分离血清，于-80 ℃条件下保存，备用。

1.3.2 临床症状观察

试验期间，根据临床诊断标准，观察试验鸡采食、饮水以及精神状况，有无畏寒扎堆，甩头，流鼻涕，打喷嚏等现象，双翅有无下垂，是否伴有咳嗽症状，气管是否有啰音(尤其夜间最为明显)，呼吸是否正常等，并记录。

1.3.3 板芩桔甘合剂对传染性支气管炎雏鸡临床症状评分与疗效评定

参考《兽医传染病学》及临床病例纳入标准，制定实验性临床评价记分标准，见表 1；疗效及疗效判定标准见表 2，观察鸡的临床症状变化，对其症状评分，进行记分计算，评价板芩桔甘合剂对鸡传染性支气管炎的疗效，计算总有效率，有效率=(痊愈数+显效数+好转数)/总发病数×100%。

表 1 传染性支气管炎实验性临床评价记分 Table 1 The experimental clinical evaluation score of infectious bronchitis
表 2 疗效判定标准 Table 2 The criteria for judging curative effect
1.3.4 病毒检测

RT-PCR法检测支气管组织是否有特异性条带，根据GenBank中参照IBV-M41的N基因设计一对引物，正向引物: 5′-ATACGCCTACTCAATCGC-3′，反向引物: 5′-TTTCCAGTTGCCTTACCG-3′，扩增子长度239 bp，引物由上海生物工程有限公司合成。

试验结束后，各组分别随机选取3只雏鸡采集支气管，严格按照试剂盒使用说明书要求进行总RNA的提取、cDNA的合成和PCR扩增[12]，取5 μL DNA Marker和8 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，于凝胶成像系统拍照记录，根据扩增条带，判断模型组雏鸡支气管上是否有IBV-M41病毒。

1.3.5 BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IFN-γ、IL-6、IL-10含量的影响

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-6、IL-10和IFN-γ的含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，以空白孔调零，在450 nm波长检测各孔的OD值，计算各样本的含量。

1.3.6 统计分析

用SPSS20.0软件进行数据处理。试验数据采用图表和柱状图形式表示，采用单因素方差分析和多重比较。

2 结果 2.1 BQJGHJ对雏鸡传染性支气管炎不同时间段治疗症状记分的影响

由图 1可知，模型组雏鸡症状记分一直处于较高水平，BQJGHJ高、中、低剂量组和阳性药物组雏鸡症状记分随着治疗进程而降低，BQJGHJ高、中、低剂量组与阳性药物组雏鸡治疗症状记分，与模型组相比，差异显著(P < 0.05)；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡治疗症状记分，与阳性药物组相比，无显著性差异(P>0.05)。BQJGHJ高、中、低剂量组与阳性药物组临床治疗效果相一致。

图中未标注差异性 Difference is not marked in the figure 图 1 BQJGHJ对传染性支气管炎雏鸡不同时间段治疗症状记分 Fig. 1 The symptom score of infectious bronchitis chicks treated with BQJGHJ in different periods
2.2 BQJGHJ对传染性支气管炎雏鸡的临床治疗效果

在造模第4天，模型组雏鸡陆续出现食欲下降，畏寒扎堆、皮温升高、饮水增加，甩头，流鼻涕，双翅下垂，伴有咳嗽、呼吸急促，气管出现明显啰音(尤其夜间最为明显)等现象；模型组雏鸡在造模第4天后，无药物治疗第2天死亡2只，第4天死亡1只；BQJGHJ高剂量组雏鸡在药物治疗第2天死亡2只，BQJGHJ低剂量组和阳性药物组雏鸡在药物治疗第3天各死亡2只，BQJGHJ中、低剂量组雏鸡在药物治疗第4天各死亡1只。阳性药物组雏鸡治愈率、有效率分别为70%、80%；BQJGHJ高剂量组雏鸡治愈率、有效率分别为75.0%、90.0%；BQJGHJ中剂量组雏鸡治愈率、有效率分别为80.0%、95.0%；BQJGHJ低剂量组雏鸡治愈率、有效率分别为65.0%、80.0%；BQJGHJ高、中剂量组雏鸡治愈率和有效率高于阳性药物组，详见表 3。随机采集各组3只雏鸡支气管，模型组雏鸡支气管样品的PCR扩增显示明显核苷酸条带，阳性药物组、BQJGHJ高、中、低剂量组和空白组雏鸡支气管样品未出现条带，详见图 2。该结果表明，雏鸡经过药物治疗后能有效降低其支气管中IBV-M41病毒水平。

表 3 BQJGHJ对传染性支气管炎雏鸡的临床治疗效果 Table 3 The clinical effect of BQJGHJ on chicks with infectious bronchitis
M.DNA相对分子质量标准；1~3.模型组；4~5.阳性药物组；6~8.BQJGHJ高剂量组；9~11.BQJGHJ中剂量组；12~14.BQJGHJ低剂量组；15.空白组 M.DNA marker; 1-3. Model group; 4-5. Positive drug group; 6-8. BQJGHJ high dose group; 9-11. BQJGHJ middle dose group; 12-14. BQJGHJ low dose group; 15. Blank group 图 2 各组雏鸡的IBV-M41检测 Fig. 2 IBV-M41 detection of each group
2.3 BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IFN-γ含量的影响

由图 3可知，模型组雏鸡血清中IFN-γ含量降低，但与空白组相比，无显著性差异(P>0.05)；在造模后到给药第5天，BQJGHJ高剂量组雏鸡血清中IFN-γ含量升高，与模型组相比，在给药后第5天差异极显著(P < 0.01)；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IFN-γ含量，与阳性药物组相比，无显著性差异(P>0.05)。在停药后第2天，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组雏鸡血清中IFN-γ含量升高，与模型组相比，差异极显著(P < 0.01)；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IFN-γ含量，与阳性药物组相比，无显著性差异(P>0.05)。

模型组vs空白组，*. P < 0.05，**. P < 0.01；各药物组(阳性药物组及不同剂量BQJGHJ)vs模型组，Δ. P < 0.05，ΔΔ. P < 0.01。下同 The model group vs the blank group, *. P < 0.05, **. P < 0.01;the drug groups (positive drug and different doses of BQJGHJ) vs the model group, Δ. P < 0.05, ΔΔ. P < 0.01. The same as below 图 3 不同时间段BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IFN-γ含量的影响 Fig. 3 The effect of BQJGHJ on the content of IFN- γ in serum of chicks artificially infected with IBV-M41 at different time points
2.4 BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IL-6含量的影响

由图 4可知，模型组雏鸡血清中IL-6含量升高，与空白组相比，差异显著(P < 0.05)；在给药第3、5天以及停药后第2天，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组雏鸡血清中IL-6含量降低，与模型组相比，差异显著(P < 0.05)；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IL-6含量，与阳性药物组相比，无显著性差异(P>0.05)。

图 4 不同时间段QJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IL-6含量的影响 Fig. 4 The effect of QJGHJ on IL-6 content in serum of chicks artificially infected with IBV-M41 at different time points
2.5 BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IL-10含量的影响

由图 5可知，模型组雏鸡血清中IL-10含量降低，与空白组相比，差异显著或极显著(P < 0.05或P < 0.01)。在给药第3天，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组鸡血清中IL-10含量升高，与模型组相比，无显著性差异(P>0.05)。在给药第5天和停药后第2天，BQJGHJ高、中、低剂量组、阳性药物组雏鸡血清中IL-10含量升高，与模型组相比，差异极显著(P < 0.01)；BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IL-10含量，与阳性药物组相比，无显著性差异(P>0.05)。

图 5 不同时间段BQJGHJ对人工感染IBV-M41雏鸡血清中IL-10含量的影响 Fig. 5 The effect of BQJGHJ on IL-10 content in serum of chicks artificially infected with IBV-M41 at different time points
3 讨论

肺主一身之表，外合皮毛，当外邪侵犯机体时，主要由皮毛侵入，肺先受之[13-14]。雏鸡感染IBV后，热毒内蕴，热盛雍肺，热伤津液，痰涎阻肺，肺失肃降引发咳喘、呼吸困难，鼻腔有鼻汁，气管有啰音等[15-16]，治疗宜清热解毒、止咳祛痰。中草药中，用于防治鸡传染性支气管炎的药物主要包括清热药、解表药、化痰止咳平喘药等三类[17-18]，清热药主要有板蓝根、连翘、金银花、生石膏[19]，解表药主要有麻黄、白芷、荆芥、防风[20]，化痰止咳平喘药主要有桔梗、贝母、百部[21]。BQJGHJ主要由板蓝根、黄芩、桔梗、甘草等中药提取制成，具有清肺化痰、止咳平喘的功能。方中板蓝根清热解毒，消肿利咽，为治咽要药，咽通则气顺；桔梗辛散，止咳祛痰、宣肺，与黄芩同用，有清热燥湿，宽胸利膈，祛胸膈之热功效[22-23]；且方中加入甘草，能缓能解，用于气虚诸证及减毒。全方配伍合理，标本兼治，清热为本，兼以化痰、止咳平喘之功效。本试验通过点眼滴鼻接种IBV-M41活化的鸡胚尿囊液0.4 mL·只-1造模发病，BQJGHJ治疗高、中、低剂量组的治愈率分别为75.0%、80.0%、65.0%，有效率分别为90.0%、95.0%、80.0%，阳性药物组的治愈率、有效率分别为70%、80%。张文彬等[24]用牛黄、板蓝根等作主耍药材制成的中药粒剂，其对传染性支气管炎的治愈率高达95%。本试验结果与文献[25]报道相一致。

IBV-M41感染雏鸡后，细胞免疫和体液免疫功能处于低下与失衡状态[26-27]。当机体受病毒刺激后，T淋巴细胞可产生多种细胞因子。根据CD4+Th细胞分泌的细胞因子不同，Th细胞分为Th0、Th1和Th2共3个亚群[28]。受细胞因子、抗原特性和激素等的影响，Th0细胞向Th1细胞或Th2细胞分化。Th1细胞主要分泌IFN-γ，可增强机体细胞免疫功能，在抗病毒感染中发挥积极作用[29]。Th2细胞主要分泌IL-6、IL-10等细胞因子，IL-6与炎症反应密切相关。在无病理状态下，机体内Th1/Th2处于平衡状态，对免疫调节起重要作用。IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子，IFN-γ和IL-6可分别作为Th1和Th2细胞的特征性细胞因子[30]，在机体发生炎症时，IL-6大量分泌，使血液和淋巴循环中的炎性细胞在病变组织或周围浸润积聚，进一步释放炎性因子等活性产物，加重感染症状并延长了病程[31]。通过检测这两种细胞因子可以了解Th1和Th2功能状态，更好地了解IBV-M41的发病机制[32]。本试验结果显示，BQJGHJ高、中、低剂量组雏鸡血清中IL-6水平降低，IFN-γ、IL-10水平升高，且BQJGHJ低剂量组IFN-γ含量也较模型组明显升高，而其对上述细胞因子的影响与阳性药物组比较无统计学差异，但BQJGHJ高剂量组明显优于低剂量组。表明BQJGHJ对人工感染IBV-M41模型雏鸡血清中IFN-γ、IL-6、IL-10的影响存在一定的量效关系，以BQJGHJ高剂量组效果最佳。以上研究结果提示，BQJGHJ可通过调节促炎与抗炎细胞因子动态平衡而发挥免疫调节作用，缓解IBV-M41对机体破坏，从而达到治疗传染性支气管炎的目的。

4 结论

板芩桔甘合剂对人工感染IBV-M41雏鸡有治疗效果，其作用机制与其降低传染性支气管炎雏鸡血清中IL-6的含量，升高雏鸡血清中IFN-γ、IL-10的含量，增强免疫有关。

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