2. 江西农业大学动物群发性疾病监测与防控研究所, 南昌 330045
2. Institute of Animal Population Health, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China
线粒体自噬是细胞自噬的一种,也是线粒体质量控制的重要机制,其可选择性地清除受损或功能不完整的线粒体[1-3]。外界刺激会导致线粒体去极化损伤,而受损伤的线粒体被自噬相关蛋白识别,进而被自噬体特异性包裹,再与溶酶体共同完成降解[4]。其中,PINK1/Parkin通路是线粒体自噬途径中重要的通路之一,同时也被认为是最成熟的介导哺乳动物线粒体自噬的机制[5-6]。研究表明,线粒体自噬参与维持细胞能量代谢等正常生理功能,但过度的线粒体自噬可导致多种器官损伤,同时线粒体自噬与心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病心肌病等病症关系紧密[7-8]。
铜作为机体必需微量元素之一,参与机体造血、脂类代谢,生物氧化还原等多种生理活动,是铜锌超氧化物歧化酶等多种酶的重要组成成分,但机体摄入过多的铜会造成器官损伤[9-10]。高铜可导致多种动物心肌细胞、肝细胞等产生不同程度的病理损伤[11-12]。此外,越来越多的研究显示自噬在铜毒性发生发展过程中起着关键作用[13-14],但高铜能否诱导大鼠心肌细胞发生线粒体自噬至今未见报道。本研究通过构建饲喂含高铜饲料的大鼠模型,检测其心肌细胞线粒体自噬相关基因及蛋白的表达,探究高铜对大鼠心肌细胞线粒体自噬的影响,为铜毒性分子病理学研究提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物与处理实验大鼠购于广东省医学实验动物中心,选用32只8月龄健康SD大鼠,随机分为4组,每组8只。碱式氯化铜作为铜源添加到饲料中,根据实验动物饲料营养标准GB14924-2010,将本试验日粮最终铜浓度设置为四个组:对照组(15 mg·kg-1),高铜Ⅰ组(30 mg·kg-1)、高铜Ⅱ组(60 mg·kg-1)、高铜Ⅲ组(120 mg·kg-1)。各组大鼠均自由饮水、采食,饲喂6个月后,用0.4%戊巴比妥按30 mg·kg-1剂量安乐死,剖开胸腔采集心组织,生理盐水清洗后,一部分浸泡于4%多聚甲醛,一部分经液氮处理后及时冻于-80 ℃备用。
1.2 实验试剂与仪器Trizol、PrimeScript RT Master Mix购自TaKaRa公司;2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司;PAGE凝胶快速制备试剂盒购于广州捷威斯生物科技有限公司;Parkin、PINK1、LC3B/LC3A、GAPDH蛋白一抗及相应二抗(鼠抗、兔抗IgG)均购于北京博奥森生物技术有限公司;ECL发光底物试剂盒购于上海圣尔生物科技有限公司;蛋白定量测试盒购于南京建成生物工程研究所;多聚甲醛购于Sigma公司;切片石蜡、中性树胶购于国药集团公司;其他试剂均为国产分析纯。
电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS,购于美国热电公司;TDZ5-WS型冷冻离心机,购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;LightCycler480型荧光定量PCR仪,购自美国Bio-Rad公司;5200型凝胶成像系统,购于上海医科大学仪器厂;Unique-R10型超纯水仪,购自厦门锐思捷科学仪器有限公司;DM1000型光学显微镜,购于广州德真科学仪器有限公司;DMi8型激光共聚焦显微镜,德国徕卡。
1.3 心组织中铜含量的测定取冷冻样品,通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS),按照食品安全国家标准GB5009.268-2016《食品中多元素的测定》中ICP-MS法测定心组织湿重情况下的铜含量。
1.4 病理切片的制作与HE染色组织样在4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h后,取合适大小的组织块滴水过夜,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡浸泡并包埋。组织蜡块切片并在烤片机上烘干,二甲苯脱蜡,经梯度酒精至水,苏木精染核,盐酸酒精分色,自来水返蓝,伊红复染,酒精脱色脱水,二甲苯透明,中性树胶进行封片,观察组织病理变化。
1.5 实时荧光定量PCR从GenBank中获得所测基因的序列,选用管家基因GAPDH作为内参基因。由上海生工生物有限公司合成。引物序列见表 1。
按照TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA,并用Nanodrop-2000超微量分光光度计检测RNA的总浓度和纯度。RNA反转录严格按照试剂盒说明书进行。将反转后的cDNA采用染料法进行RT-qPCR反应,反应体系为20 μL:SYBR premix Ex TaqTM10 μL,cDNA 2 μL,引物F/R均为0.8 μL。反应条件:预变性95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s;共进行40个循环,检测PINK1、Parkin、LC3A、LC3B和p62的mRNA转录水平。
1.6 免疫印迹取心组织20 mg,RIPA裂解液(RIPA:PSMF=100:1)提取总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白含量,使用RIPA裂解液稀释,稀释后的样品与4×LodingBuffer以3:1比例混匀。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白,将目标蛋白转至PVDF膜上,将膜于5%脱脂奶粉室温孵育2 h,蛋白一抗(Parkin、PINK1、GAPDH一抗均按照1:1 000稀释)4 ℃孵育过夜,蛋白二抗(鼠抗、兔抗均按照1:5 000稀释)室温孵育60 min,用发光液显影,凝胶成像系统成像。
1.7 免疫组织化学从4%的多聚甲醛溶液中取出固定好的心组织样品,修成合适大小,脱水包埋,切成4 μm的组织切片,贴于载玻片上37 ℃展片台烘干;二甲苯脱蜡;经梯度酒精至水;PBS(磷酸盐缓冲液)清洗;抗原修复;PBS清洗;抗原封闭;一抗孵育;PBS清洗;二抗(1:200)室温孵育,PBS清洗;二氨基联苯胺(DAB)显色剂室温显色,镜下观察显色情况,充分显色后用PBS冲洗终止反应;苏木精复染,PBS洗去苏木精,1%盐酸酒精分色,自来水洗返蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察并拍照。
1.8 免疫荧光从4%的多聚甲醛溶液中取出固定好的心组织,按照制作组织切片的方法常规制作切片。55 ℃烘片1 h;梯度酒精脱蜡;免疫染色清洗液清洗;抗原修复;画蜡圈;免疫染色清洗液清洗;10%马血清封闭1 h;一抗孵育过夜;免疫染色清洗液清洗;二抗孵育;免疫染色清洗液清洗;DAPI核染5 min;免疫染色清洗液清洗;滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
1.9 统计分析试验数据先用Excel2016初步处理,应用SPSS系统软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析进行检验,t检验进行差异显著性分析,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。应用GraphPadPrism 6.0软件作图。
2 结果 2.1 心组织铜含量采用GB5009.268-2016检测方法,检测心组织中的铜含量。结果显示,对照组心组织内的铜含量为(4.20±0.06) mg·kg-1,高铜Ⅰ组、高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组心组织内铜含量分别为(4.51±0.37)、(4.54±0.44)、(4.46±0.22) mg·kg-1。由此可知,随着日粮中铜含量的倍增,铜在大鼠心组织中的蓄积量组间差异不显著(P>0.05)。
2.2 心组织切片病理观察如图 1所示,对照组心肌纤维排列整齐,细胞间隙未见病理损伤。随着日粮中铜含量的增加,高铜各组均出现心肌纤维排列疏松、不规则的现象,尤其是高铜Ⅱ组和高铜Ⅲ组出现明显的纤维溶解现象。
如图 2所示,与对照组相比,随着日粮中铜含量的增加,线粒体自噬相关基因LC3A与LC3B的表达量有上升趋势,且LC3B的表达量在高铜Ⅱ组中显著升高(P<0.05);p62的mRNA表达量在高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组中极显著降低(P<0.001);而PINK1的mRNA表达量在高铜Ⅰ组、高铜Ⅱ组中极显著增加(P<0.001),在高铜Ⅲ组中表达量显著增加(P<0.05);同时随着日粮中铜含量的增加Parkin mRNA表达量有上升趋势,但差异不显著(P>0.05)。
如图 3所示, 与对照组相比,随着日粮中铜含量的增加,PINK1蛋白在高铜各组之间表现出上升趋势,且PINK1蛋白在高铜Ⅱ组中显著升高(P < 0.05)。与对照组相比,Parkin蛋白的表达量在高铜Ⅰ、Ⅱ组均显著增加(P<0.05或P < 0.01)。同时,随着日粮中铜含量的增加,大鼠心肌细胞LC3B/LC3A显著上调(P<0.01或P < 0.05)。
如图 4A所示,LC3B蛋白主要定位于细胞质中,阳性表达呈现棕色。结合分析软件Image-pro plus 6.0计算不同组别的平均光密度(IOD),所得结果如图 4B所示,与对照组相比,高铜Ⅰ组、高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组心肌细胞LC3B蛋白表达量极显著上升(P < 0.01)。
结合分析软件Image J检测图 5A荧光强度,所得结果如图 5B所示:高铜组较对照组平均光密度上升,且高铜Ⅰ、Ⅱ组阳性表达量极显著增加(P<0.01)。
铜作为机体所需的微量元素之一,在心、肝、肾、骨骼和免疫器官等均有分布,通过构成血浆铜蓝蛋白酶、细胞色素氧化酶等多种酶参与机体代谢过程,同时铜也是线粒体内关键酶的辅基[15-16]。研究发现,绝大部分的铜是通过消化道吸收进入体内,且铜含量与铜摄入量正相关,与此同时机体在一定程度上可通过控制内源性排泄量来防止体内铜过量蓄积[17-18]。本试验高铜各组大鼠心组织中铜含量相比于对照组有升高,但差异不显著。且在一项关于黄羽肉鸡饲料中铜营养需要量的研究中指出,当肝铜离子蓄积量达到饱和时,继续增加饲料中的铜含量会导致肝大量且迅速的释放铜离子[19]。因此推测大鼠心中存在相似的代谢机制,导致当大鼠日粮铜含量≥120 mg·kg-1时,心组织会通过某种途径迅速释放铜离子,降低心组织中铜离子的蓄积量。因此,当日粮中铜含量≥120 mg·kg-1时,心组织中的铜含量并没有随着铜浓度的升高而继续升高。此外,摄入过量的铜会造成多种靶器官受损,梁明振等[20]用含高剂量铜的饲粮饲喂健康成年猪,发现高铜会损害心脏细胞线粒体嵴的正常结构。本试验病理切片结果显示,高铜组中大鼠的心肌纤维排列疏松且不规则,当日粮中铜含量为60和120 mg·kg-1时心肌纤维出现明显的肌束溶解的现象。根据试验结果推断过多铜摄入可诱导大鼠心肌细胞产生病理损伤。
线粒体自噬是受多因子精密调节的特异性选择过程,是细胞清除体内受损线粒体,维持自身稳态的一种重要调节机制。该机制是由多个通路共同调节的复杂过程,其中PINK1/Parkin通路是调控线粒体自噬的重要通路之一,且PINK1和Parkin可通过相同途径促进线粒体自噬的发生[3]。当线粒体膜电位降低时,PINK1/Parkin通路被激活,细胞释放的PINK1蛋白积累在线粒体外膜上,而PINK1作为Parkin的上游因子,选择性地将Parkin蛋白招募到哺乳动物细胞功能失调的线粒体中,二者共同介导线粒体的吞噬和降解[21]。此外,LC3是自噬体膜的一种标记蛋白,在自噬过程中尤其是自噬体早期形成中起关键作用。它包括有活性的LC3B和无活性的LC3A。自噬发生后无活性的LC3A泛素化转变为有活性的LC3B,LC3B的表达量与其自噬体的数量成正比,且在自噬的研究中,LC3B和LC3A的比值通常被用来作为判断自噬水平高低的依据[22]。而p62先与细胞质内泛素化的蛋白质结合,进而再与LC3B结合成复合物,最后被自噬体、溶酶体产生的复合物降解。因此,自噬受到抑制后p62的表达量会升高,而自噬发生时p62的表达量会降低[23]。马飞洋等[14]采用硫酸铜拌料饲喂肉鸡并检测心肌线粒体自噬水平,发现心肌细胞内Parkin、PINK1的mRNA表达量显著上升。Seo等[24]发现经铜处理后的内皮细胞LC3B与LC3A的比值显著上升,而p62显著下降。本试验结果与他人的前期研究基本一致,与对照组相比,p62的mRNA表达量显著下降;PINK1和Parkin的mRNA表达量在高铜各组均呈现上升趋势,PINK1蛋白的表达量在60 mg·kg-1浓度组中显著升高,Parkin蛋白的表达量在高铜组中显著增加。同时,本试验蛋白结果显示,高铜组LC3B/LC3A蛋白表达量显著增加,且采用免疫组化、免疫荧光技术检测LC3B的表达量均显著上升。
4 结论高铜日粮可以上调大鼠心自噬相关基因及蛋白的表达,诱导线粒体自噬的发生。
[1] | MCWILLIAMS T G, PRESCOTT A R, ALLEN G F G, et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo[J]. J Cell Biol, 2016, 214(3): 333–345. DOI: 10.1083/jcb.201603039 |
[2] | BAKER M J, PALMER C S, STOJANOVSKI D. Mitochondrial protein quality control in health and disease[J]. Br J Pharmacol, 2014, 171(8): 1870–1889. DOI: 10.1111/bph.12430 |
[3] | RUGARLI E I, LANGER T. Mitochondrial quality control: a matter of life and death for neurons[J]. EMBO J, 2012, 31(6): 1336–1349. DOI: 10.1038/emboj.2012.38 |
[4] | OHSUMI Y. Historical landmarks of autophagy research[J]. Cell Res, 2014, 24(1): 9–23. DOI: 10.1038/cr.2013.169 |
[5] | KUBLI D A, ZHANG X X, LEE Y, et al. Parkin protein deficiency exacerbates cardiac injury and reduces survival following myocardial infarction[J]. J Biol Chem, 2013, 288(2): 915–926. DOI: 10.1074/jbc.M112.411363 |
[6] |
李瑞萌, 赵进, 刘岩. PINK1/Parkin介导的线粒体自噬[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2019, 35(10): 1072–1079.
LI R M, ZHAO J, LIU Y. PINK1/Parkin-mediated Mitophagy[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2019, 35(10): 1072–1079. (in Chinese) |
[7] |
李渊芳, 谢盈彧, 徐士欣, 等. 线粒体自噬与心脏能量代谢研究进展[J]. 中华老年心脑血管病杂志, 2019, 21(3): 320–323.
LI Y F, XIE Y Y, XU S X, et al. Advances in mitophagy and cardiac energy metabolism[J]. Chinese Journal of Geriatric Heart Brain and Vessel Diseases, 2019, 21(3): 320–323. DOI: 10.3969/j.issn.1009-0126.2019.03.025 (in Chinese) |
[8] |
高蓓蕾, 张国勇, 余文军, 等. Parkin介导的线粒体自噬在高糖高脂导致的心肌细胞损伤中的保护作用[J]. 心脏杂志, 2017, 29(4): 382–388.
GAO B L, ZHANG G Y, YU W J, et al. Protective role of Parkin-mediated mitophagy in cardiomyocyte injury induced by high glucose and high fat[J]. Chinese Heart Journal, 2017, 29(4): 382–388. (in Chinese) |
[9] |
刘好朋, 唐兆新, 苏荣胜, 等. 高铜日粮对肉鸡肝脏TrxR2基因mRNA表达和还原活性的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2011, 42(3): 423–428.
LIU H P, TANG Z X, SU R S, et al. Effect of high-level copper diet on expression of TrxR2 mRNA and reduction activity of TrxR2 of liver in broiler[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2011, 42(3): 423–428. (in Chinese) |
[10] |
崔伟, 李敏, 彭西, 等. 高铜对雏鸡肾脏组织结构及生化指标影响的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(1): 86–91.
CUI W, LI M, PENG X, et al. Effect of dietary high copper on tissue structure and biochemical parameters of kidney in chickens[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2010, 41(1): 86–91. (in Chinese) |
[11] |
崔恒敏, 陈怀涛, 邓俊良, 等. 实验性雏鸭铜中毒症的病理学研究[J]. 畜牧兽医学报, 2005, 36(7): 715–721.
CUI H M, CHEN H T, DENG J L, et al. Pathology of experimental copper toxicity in ducklings[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2005, 36(7): 715–721. DOI: 10.3321/j.issn:0366-6964.2005.07.015 (in Chinese) |
[12] |
裴若男, 杨帆, 廖建昭, 等. 高铜日粮对肉鸡肾氧化损伤和Nrf2信号通路相关基因表达的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1912–1919.
PEI R N, YANG F, LIAO J Z, et al. The effect of high dietary copper on oxidative damage and expression of Nrf2 signaling pathway related genes in the kidneys of broilers[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(9): 1912–1919. (in Chinese) |
[13] |
曹华斌, 苏荣胜, 李和平, 等. 铜对肉鸡肝细胞线粒体膜通透性及呼吸的影响[J]. 中国兽医科学, 2007, 37(4): 342–345.
CAO H B, SU R S, LI H P, et al. Effects of copper on membrane permeability and respiration of mitochondria from broiler hepatocyte[J]. Veterinary Science in China, 2007, 37(4): 342–345. (in Chinese) |
[14] |
马飞洋, 杨帆, 唐兆新, 等. 高铜对肉鸡心肌细胞线粒体自噬的影响[J]. 中国兽医科学, 2019, 49(5): 659–664.
MA F Y, YANG F, TANG Z X, et al. Effects of high dietary copper on mitophagy in cardiomyocytes of broilers[J]. Chinese Veterinary Science, 2019, 49(5): 659–664. (in Chinese) |
[15] |
郭剑英, 曹华斌, 苏荣胜, 等. 高铜日粮对肉鸡肝细胞线粒体呼吸功能的影响[J]. 中国家禽, 2008, 30(11): 11–14.
GUO J Y, CAO H B, SU R S, et al. Effect of high-level copper diet on mitochondrial respiratory function of liver in broiler[J]. China Poultry, 2008, 30(11): 11–14. (in Chinese) |
[16] | PEREIRA T C B, CAMPOS M M, BOGO M R. Copper toxicology, oxidative stress and inflammation using zebrafish as experimental model[J]. J Appl Toxicol, 2016, 36(7): 876–885. DOI: 10.1002/jat.3303 |
[17] | DOGUER C, HA J H, COLLINS J F. Intersection of iron and copper metabolism in the mammalian intestine and liver[J]. Compr Physiol, 2018, 8(4): 1433–1461. |
[18] |
程方方, 许雪魁, 杨连玉. 铜在体内代谢的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2012(5): 45–47.
CHENG F F, XU X K, YANG L Y. Advances in copper metabolism in vivo[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2012(5): 45–47. (in Chinese) |
[19] |
李龙, 蒋守群, 郑春田, 等. 1~21日龄黄羽肉鸡饲粮铜营养需要量的研究[J]. 动物营养学报, 2015, 27(2): 578–587.
LI L, JIANG S Q, ZHENG C T, et al. Copper requirement of yellow-feathered broilers aged from 1 to 21 days[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(2): 578–587. DOI: 10.3969/j.issn.1006-267x.2015.02.030 (in Chinese) |
[20] |
梁明振, 谢梅冬, 梁贤威, 等. 高铜饲粮对生长育肥猪心脏和肾脏组织的影响[J]. 饲料工业, 2004, 25(10): 28–30.
LIANG M Z, XIE M D, LIANG X W, et al. Effect of feed in rich coper on the heart and kidney for finishing pigs[J]. Feed Industry, 2004, 25(10): 28–30. DOI: 10.3969/j.issn.1001-991X.2004.10.007 (in Chinese) |
[21] | GLADKOVA C, MASLEN S L, SKEHEL J M, et al. Mechanism of parkin activation by PINK1[J]. Nature, 2018, 559(7714): 410–414. DOI: 10.1038/s41586-018-0224-x |
[22] | YANG F, LIAO J Z, PEI R N, et al. Autophagy attenuates copper-induced mitochondrial dysfunction by regulating oxidative stress in chicken hepatocytes[J]. Chemosphere, 2018, 204: 36–43. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2018.03.192 |
[23] | SCHLÄFLI A M, BEREZOWSKA S, ADAMS O, et al. Reliable LC3 and p62 autophagy marker detection in formalin fixed paraffin embedded human tissue by immunohistochemistry[J]. Eur J Histochem, 2015, 59(2): 2481. |
[24] | SEO Y, CHO Y S, HUH Y D, et al. Copper ion from Cu2O crystal induces AMPK-mediated autophagy via superoxide in endothelial cells[J]. Mol Cells, 2016, 39(3): 195–203. DOI: 10.14348/molcells.2016.2198 |