现如今干细胞与再生医学迅猛发展，其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因来源丰富，易提取，低免疫原性等优势[1-2]，为传统医学手段解决不了的疑难杂症提供了一种新的治疗途径和方法。BMSCs现已被应用于心血管疾病[3-5]、骨与软骨组织疾病[6-7]、修复皮肤创伤[8]、1型糖尿病[9-10]、炎症性肠病[11-12]等疾病的治疗研究中。以犬间充质干细胞(canine bone mesenchymal stem cells, cBMSCs)为基础的再生医学是当今兽医学研究的热点和前沿领域[13]。
在干细胞治疗过程中，干细胞的干性即自我复制和分化能力对治疗效果起着决定性作用，但随着BMSCs的生长，干细胞的干性会逐渐降低，从而影响治疗效果。细胞自噬作为一种平衡细胞物质能量代谢的机制，在细胞的生存中发挥着重要作用。有研究报道当自噬关键蛋白Atg 5缺乏时，小鼠造血干细胞的增殖分化能力明显下降[14]，还有研究指出自噬促进剂雷帕霉素可减轻钛颗粒对BMSCs成骨分化能力的抑制[15]。
结合以上分析，干细胞治疗中细胞的干性至关重要，而自噬与干细胞干性关系密切，但目前自噬对BMSCs干性影响机制的相关研究较少。本研究通过利用雷帕霉素增强细胞自噬和3-MA抑制细胞自噬后cBMSCs的干性基因转录水平以及成骨、成脂分化能力的变化来探讨自噬对干细胞的作用效果。本研究对维持cBMSCs “年轻化”和多向分化能力，以及为干细胞临床治疗提供优化细胞质量方法具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 试验材料茜素红染液(上海源叶生物有限公司)：0.05 g的茜素红溶于50 mL Tris-HCl(0.1 mol·L-1)中，配制成0.1%的茜素红工作液，pH调为4.2，过滤，除菌，备用。油红O染液(上海源叶生物有限公司)：油红干粉0.5 g溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇定容至100 mL，除菌，备用。雷帕霉素(上海源叶生物有限公司)，3-MA(上海源叶生物有限公司)，RNA逆转录试剂盒(TaKaRa公司)，DMEM/F 12培养基(Gibico公司)，胎牛血清(Gibico公司)，青链霉素溶液(Gibico公司)，4%多聚甲醛(中国Biosharp生物科技有限公司)，LC3B Antibody(Novus biologicals公司)。
倒置荧光显微镜(Olympus公司)，生物安全柜(美国Thermo scientific公司)，CO2培养箱(美国Thermo scientific公司)，XDS-2倒置显微镜(重庆光电仪器总公司)，BIO-RAD PCR仪(美国BIO-RAD公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 细胞分离培养鉴定及分组健康3月龄实验用比格犬(青岛博隆比格犬养殖有限公司)麻醉后，在无菌状态下抽取骨髓，用PBS制成单细胞悬液。吸取单细胞悬液加于等量的分离液液面上，400~550 g离心20~30 min。离心后，离心管中由上至下分为四层。转移第二层环状乳白色目的细胞层到另一离心管中，加入5~10 mL洗涤液，重悬细胞，400 g离心10 min，去上清。5 mL清洗液重悬所得细胞，250 g离心10 min，弃上清后，将分离所得的细胞用10 mL 10% FBS和1%双抗的DMEM/F 12培养基重悬，接种于细胞培养瓶中，置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱内培养。
取第3代cBMSCs，胰酶消化1~2 min，离心后PBS洗涤重悬2次，取1×106个cBMSCs于流式管中，分别加入荧光标记的抗CD 34、CD 44、CD 45、CD 90和CD 11a单克隆抗体，4 ℃孵育30 min，1 000 r·min-1离心6 min，弃掉上清后用PBS洗3次，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。抗体结合完成后用流式细胞仪检测细胞表面标记的表达量。
取第3代cBMSCs接种于六孔板中，待其生长稳定后，随机分为对照组、雷帕霉素组(终浓度100 nmol·L-1)和3-MA组(终浓度为5 mmol·L-1)，在药物作用12、24、48 h后收集细胞。
1.2.2 cBMSCs成骨及成脂诱导将cBMSCs以5×105个·孔-1浓度接种于12孔细胞培养板中，在37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞密度生长至80%时，加入药物培养48 h后，分别使用成骨和成脂培养基继续培养。
用工作浓度为0.25 μmol·L-1地塞米松，5 μg·mL-1抗坏血酸2-磷酸和10 mmol·L-1 β-甘油磷酸盐，10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养基进行成骨诱导，连续诱导16~21 d，待细胞出现较为明显的疑似钙化结节后进行茜素红染色鉴定。用工作液浓度为0.1 mmol·L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤，100 μmol·L-1吲哚美辛，1 μmol·L-1地塞米松和100 mg·mL-1胰岛素，10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养基进行成脂诱导，连续诱导21 d，待细胞出现脂滴后进行油红O染色鉴定。
1.2.3 细胞免疫荧光标记法检测微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(microtubul-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ，LC 3 Ⅱ)将cBMSCs调整密度为2×105个·mL-1接种于96孔细胞培养板后在37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞密度生长至80%时，加入药物作用细胞48 h；吸去培养基，用PBS洗涤2次后加入4%的多聚甲醛固定；加入0.3%~0.5% Triton X-100室温处理20~30 min，PBST清洗3次，静置3~5 min·次-1；在培养皿中每孔加入100 μL 5% BSA封闭液，室温封闭30~60 min；吸去封闭液，每孔滴加足量稀释好的一抗(LC3B兔单克隆抗体1:200倍稀释)，并放入湿盒，4 ℃孵育过夜，次日取出细胞培养板，吸去一抗，用PBST漂洗细胞3遍，静置3~5 min·次-1；每孔滴加50 μL二抗(FITC标记的羊抗兔IgG，1:200倍稀释)，室温避光孵育1 h，然后用PBST漂洗细胞3遍，静置3~5 min·次-1；每孔滴加一滴DAPI室温孵育5~10 min，PBST浸洗4次，每次5 min。吸干PBST后每孔加入一滴含抗荧光淬灭剂的封片剂，在荧光显微镜下观察采集图像。
1.2.4 荧光定量PCR检测相关基因mRNA的转录水平用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书操作进行反转录得到cDNA。设计LC 3、Beclin 1、自噬相关基因7(autophagy-related 7, Atg 7)、性别决定基因相关转录因子2[SRY-related high-monility-group(HMG)-box protein-2，Sox 2]、特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich sequence-binding ptotein 2，Satb 2)基因的引物，引物序列如表 1所示。反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TIi RNase Plus)(2×)10 μL，PCR Forward primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，PCR Reverse primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，模板2 μL，dH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃ 3 min; 95 ℃ 1 min, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min，扩增40个循环。运用2-△△Ct方法分析试验结果。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Realtime fluorescence quantitative PCR primers sequences |
所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 cBMSCs的分离鉴定及细胞形态观察取第3代的细胞进行流式细胞术分析，结果显示CD 44和CD 90强阳性，CD 34、CD 11a、CD 45为阴性(图 1)，符合间充质干细胞的细胞表面标记特点。
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图 1 细胞表面标记流式鉴定 Fig. 1 Flow cytometric identification of cell surface markers |
培养48 h后镜下可见正常组长梭形贴壁细胞cBMSCs。雷帕霉素组和3-MA组cBMSCs形态未见明显变化(图 2)。
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图 2 各组cBMSCs形态观察(400×) Fig. 2 The observation of cBMSCs in each group(400×) |
将cBMSCs第3代细胞分别进行成骨和成脂诱导试验。cBMSCs更换成骨诱导培养基后，细胞形态逐渐发生变化，聚集成团并形成钙化结节。在诱导的第16天进行茜素红染色，染色结果为阳性，可观察到被染成红色的钙化结节(图 3，见箭头所示)。成脂诱导的cBMSCs更换成脂诱导培养基后，形态逐渐变得不规则，开始出现脂滴，诱导的第21天进行油红O染色可观察到被染成红色的脂滴(图 4，见箭头所示)。
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箭头所指为茜素红染色的钙化结节 The arrows indicate calcified nodules stained by alizarin red 图 3 成骨诱导试验(茜素红染色，100×) Fig. 3 Osteogenesis induction test(Alizarin red staining, 100×) |
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箭头所指为油红O染色的脂滴 The arrows indicate lipid droplet stained by Oil red O 图 4 成脂诱导试验(油红O染色，100×) Fig. 4 Lipogenesis induction test(Oil red O staining, 100×) |
成骨诱导试验中相较于对照组雷帕霉素组钙化结节较大，3-MA组钙化结节面积更小(图 3)。成脂诱导试验中相较于对照组，雷帕霉素组的脂滴数量较少，3-MA组脂滴数量较多且聚集程度高(图 4)。
2.3 细胞免疫荧光标记法检测微管相关蛋白LC 3 Ⅱ与对照组相比，雷帕霉素组LC 3Ⅱ蛋白表达量明显升高；3-MA组LC 3Ⅱ蛋白表达量明显降低(图 5)。
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图 5 各组cBMSCs的LC 3Ⅱ蛋白的表达(200×) Fig. 5 The expression of LC 3Ⅱ protein in cBMSCs of different treatment groups (200×) |
雷帕霉素组基因mRNA表达水平如图 6所示，12 h时自噬相关基因LC 3、Atg 7及干性相关基因Sox 2的mRNA表达水平均极显著高于对照组(P < 0.01，图 6A、C、D)，自噬相关基因Beclin 1相较于对照组为差异显著(P < 0.05，图 6B)；所有自噬相关基因及干性相关基因mRNA表达水平在24 h均极显著高于对照组(P < 0.01)；48 h时自噬相关基因Beclin 1、Atg 7及干性相关基因Sox 2、Satb 2 mRNA表达水平均极显著高于对照组(P < 0.01，图 6B、C、D、E)，自噬相关基因LC 3差异显著(P < 0.05，图 6A)。
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与对照组比较，*.P < 0.05，**.P < 0.01，n=3 Compared with control group, *.P < 0.05, **.P < 0.01, n=3 图 6 各组cBMSCs LC 3、Beclin 1、Atg 7、Sox 2、Satb 2 mRNA表达水平的比较 Fig. 6 Comparison of LC 3, Beclin 1, Atg 7, Sox 2, Satb 2 mRNA transcription in cBMSCs of different treatment groups |
3-MA组基因mRNA表达水平如图 6所示，12 h时自噬相关基因LC 3、Atg 7及干性相关基因Sox 2、Satb 2的mRNA表达水平均极显著低于对照组(P < 0.01，图 6A、C、D、E)；所有自噬相关基因LC 3、Beclin 1及干性相关基因Sox 2、Satb 2的mRNA表达水平在24 h均极显著低于对照组(P < 0.01，图 6A、B、D、E)；48 h时自噬相关基因Beclin 1、Atg 7及干性相关基因Sox 2、Satb 2 mRNA表达水平均极显著低于对照组(P < 0.01，图 6B、C、D、E)。
3 讨论BMSCs的研究方兴未艾，现已广泛应用于神经修复[16]、呼吸系统[17]、修复股骨缺损[18]等方面疾病的临床治疗研究中。有研究报道神经修复治疗过程中BMSCs会不断地增殖分化，同时释放神经营养因子促进细胞旁分泌效应，进而加速内源性神经干细胞生长[16, 19]。
在干细胞治疗过程中，BMSCs的干性决定其增殖分化能力。而干性相关基因Sox 2、Satb 2在干细胞的干性维持中又有着重要作用。Sox 2基因是Sox家族的重要成员之一，在脊椎动物干细胞和中枢神经系统的神经祖细胞中普遍存在，参与调节干细胞分化多能性维持、细胞生长和癌症发展等生命过程[20-21]。Satb 2具有促进维持BMSC成骨分化和骨缺损再生的能力，在细胞染色质转录、皮质神经元分化和成骨细胞发育中发挥重要作用[22]。本研究发现cBMSCs中干性标记基因和自噬相关基因的变化趋势大体相一致，当自噬相关基因水平发生变化后，干性标记基因表达水平也随之发生同步变化。
自噬是真核细胞内存在主要降解途径之一。根据吞噬物进入溶酶体的途径，可将细胞自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三类。自噬在许多疾病中起着重要作用，包括癌症和神经变性，也是衰老和免疫的重要组成部分。自噬启动时细胞会先形成自噬泡，作为酵母自噬相关基因Atg 6/Vps 30的哺乳动物同源基因的Beclin 1在自噬泡形成过程中起重要作用。自噬启动后，Ⅰ型LC 3经泛素样加工修饰，与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合，转变为Ⅱ型LC 3并聚集到自噬体膜上，LC 3Ⅱ随自噬体膜的增多而增加。Atg 7在自噬过程中可激活两种泛素样分子Atg 8和Atg 12，并将它们转移到不同的E 2酶中[23-24]。当Atg 7敲除时，LC 3Ⅰ无法转换成LC 3Ⅱ，进而自噬过程被阻滞。有研究表明通过上调自噬基因Beclin 1、Atg 5和Atg 7的表达以及增加LC 3Ⅱ转换可促进自噬，试验中LC 3Ⅱ蛋白表达水平可反映细胞自噬情况[25]。为探讨细胞自噬与cBMSCs干性的相互作用，本研究选用LC 3、Beclin 1和Atg 7作为自噬标记因子，添加雷帕霉素后LC 3Ⅱ蛋白表达水平增加，自噬相关基因mRNA表达水平均显著上调，添加3-MA后LC 3Ⅱ蛋白及自噬相关基因mRNA表达水平均下降，表明体外建立cBMSCs自噬模型成功。
老龄化动物骨髓腔内发现骨量减少与脂肪细胞增多总是相伴发生。本研究中促进cBMSCs自噬后，细胞成骨分化能力增强而成脂分化能力降低；抑制其自噬结果则相反。与戚朦[26]用雷帕霉素和3-MA作用于小鼠OVX BMSCs后再进行成骨及成脂诱导的结果相一致。但与李军等[27]用不同浓度雷帕霉素作用于人BMSCs后再进行成骨诱导的研究结果相反，分析其原因可能与细胞来源、检测方法以及成骨分化阶段不同有一定关系，这有待进一步研究。也可能是因为骨髓腔内的脂肪细胞和成骨细胞均来源于骨髓间充质干细胞，二者具有相同的细胞表型，在一定条件下可以互相转换，并且存在此消彼长的关系。有研究表明促进成骨细胞自噬会增加成骨细胞数量，促进成骨细胞的生长；抑制自噬后，细胞则会通过上调促凋亡蛋白Bax、下调Bcl-2促使细胞凋亡[28-29]，这与本次研究的关系有待进一步的研究。
本研究首次在cBMSCs中进行细胞自噬对干细胞干性影响进行探讨，研究结果不仅可以丰富对自噬促进干细胞干性维持、分化的机制与途径的理解，提升自噬在犬类发育、衰老中的作用机制，还为cBMSCs的临床应用提供理论基础和技术支持。
4 结论在一定条件下体外促进cBMSCs自噬，可维持其干性并促进成骨分化，抑制成脂分化；抑制cBMSCs自噬则抑制其干性，抑制其成骨分化，促进细胞成脂分化。
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