犬弓首蛔虫(Toxocara canis，T. canis)属于弓首科(Toxocaridae)弓首属(Toxocara)的线虫，成虫寄生于犬的小肠，终末宿主因食入感染性虫卵而感染，幼虫经肝、肺移行，最后进入小肠发育为成虫[1-3]。在非特异性宿主体内时，感染性幼虫不能发育为成虫，而是移行到宿主的肌肉、内脏、神经系统等部位，成为滞育的感染性幼虫。当人摄入感染性虫卵后，幼虫在人体的各个组织和器官中移行，引起内脏幼虫移行症(visceral larva migrans, VLM)、眼睛幼虫移行症(ocular larva migrans, OLM)和神经幼虫移行症(nerval larva migrans, NLM)等[4-6]，导致严重的病理综合征。因此该病在兽医公共卫生学上具有重要意义。
软骨素蛋白多糖(chondroitin proteoglycans，CPGs)属于几丁质特异结合的蛋白质，广泛存在于动物、植物和微生物中[7]。每个软骨素蛋白多糖是由一个核心蛋白和一个或多个共价键连接的软骨素链复合而成。脊椎动物产生多种硫酸软骨素蛋白多糖，在促进中枢神经系统的发育成熟和损伤修复中扮演着重要的角色[8-11]。有研究表明，在无脊椎动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)中，软骨素蛋白多糖在胚胎发育和外阴的形态形成过程中发挥重要作用[12-14]。目前对于该蛋白的研究多集中于C. elegans，而在寄生虫中报道较少。
笔者根据T. canis转录组中的软骨素蛋白多糖1基因(chondroitin proteoglycans 1 gene，Tc-cpg-1)数据，进行Tc-cpg-1基因的克隆、原核表达、几丁质结合试验以及组织差异表达分析等研究，以期为进一步研究犬弓首蛔虫软骨素蛋白多糖的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料犬弓首蛔虫采自西南大学荣昌校区动物医院某患病犬。经形态学鉴定后，放置于用DEPC水预处理的冻存管，液氮速冻，-80 ℃保存备用。
大肠杆菌DH5α、Transetta(DE3)、Amp+、X-Gal、IPTG购自Transgen公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit、DL2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)Vector克隆载体、rTaq DNA Polymerase、Agarose Gel DNA Purification Kit、表达载体pET-32a(+)、SYBR Premix E×TaqTM Ⅱ荧光染料购自TaKaRa公司；His标签单抗和羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；Chitin购自Sigma公司；Ni-NTA 1 mL(Pre-Packed Gravity Column)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成根据T. canis转录组数据Tc-cpg-1基因的序列，采用Primer Premier 5.0软件设计克隆、表达和荧光定量PCR特异性引物，同时选取的内参基因为18S rRNA，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，GGATCC为BamH Ⅰ酶切位点，AAGCTT为Hind Ⅲ酶切位点(表 1)。
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表 1 引物扩增序列 Table 1 Primers sequence used for amplification in the study |
采用Trizol试剂分别对T. canis雌虫、雄虫及雌虫生殖道、肠道、体壁的总RNA进行提取，采用核酸测定仪检测总RNA的浓度和纯度，以提取的T. canis总RNA为模板，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明合成cDNA。
1.2.3 Tc-cpg-1基因的克隆以T. canis 的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系(25 μL)：10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.0 μL，Mg2+(25 mmol ·L-1)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol ·L-1)2.0 μL，上、下游引物(10 μmol ·μL-1)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，rTaq酶0.5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、30个循环，72 ℃最后延伸10 min。
按照TaKaRa的Agarose Gel DNA Purification Kit胶回收试剂盒进行PCR产物的回收，与pMD19-T (simple)载体进行连接，转化DH5α感受态细胞，涂布于含IPTG(24 mg·mL-1)和X-gal(20 mg·mL-1)的LB/Amp琼脂平板中，于37 ℃恒温培养箱培养12~14 h，然后对阳性克隆进行菌液PCR鉴定。
1.2.4 重组TcCPG1蛋白的原核表达将测序正确的质粒命名为Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)，将Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)和pET-32a(+)用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，将酶切产物进行切胶回收纯化，构建Tc-cpg-1/pET-32a(+)重组表达质粒，经菌液PCR、双酶切验证后，转入大肠杆菌Transetta(DE3)菌株，同时转化pET-32a(+)质粒。提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于LB(Amp+/Camr)的液体培养基中，分别于16、30、37 ℃下225 r·min-1振荡培养，测菌液OD600 nm值为0.6~1.0，加入0.6 mmol·L-1的IPTG诱导4 h，将菌液于4 ℃，6 000 r·min-1离心5 min，收集菌体，超声波破碎，分别收集上清和沉淀，并进行SDS-PAGE电泳检测。检测到目的蛋白后，再分别进行时间和IPTG浓度的优化。
1.2.5 重组TcCPG1蛋白的纯化及鉴定采用镍柱亲和层析的方法对重组蛋白进行纯化，分别用20、50、100、250、500 mmol·L-1的咪唑梯度进行洗脱，分别收集各步骤溶液，SDS-PAGE检测最适纯化结果，以最佳咪唑浓度对蛋白进行纯化。将纯化的TcCPG1蛋白进行Western blot鉴定，一抗为His标签单抗，二抗为羊抗兔IgG抗体。在电压25 V，电流1.3 A条件下转膜；转膜结束后，取出膜，放置于5%的脱脂奶粉中，静置过夜封闭；进行一抗(1:5 000)孵育，室温振荡1 h，用PBST(20 mmol ·L-1 Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol·L-1 NaCl，0.05% Tween 20)洗涤3次；二抗(1:5 000)孵育，室温振荡1 h，PBST洗涤3次；DAB显色；记录，风干并保存。
1.2.6 重组TcCPG1蛋白与几丁质的结合试验采用Bradfard方法对重组TcCPG1蛋白进行定量，测定重组TcCPG1的蛋白浓度。方法见表 2。
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表 2 Bradfard法检测重组TcCPG1蛋白浓度 Table 2 The method of Bradfard to detect the concentrations of recombinant TcCPG1 protein |
取10 μL重组TcCPG1蛋白，在空白孔中按10 μL·孔-1做3个重复，然后每孔加入200 μL Bradfard工作液。将加完样品的96孔板置于37 ℃恒温箱孵育30 min，在595 nm波长下检测各孔吸光度。根据所测得的数据绘制标准曲线，分别计算出TcCPG1的浓度。
参照Wijffels等[15]的方法进行重组TcCPG1蛋白与几丁质的结合试验。将1 μg纯化的重组TcCPG1蛋白和5 mg几丁质在25 ℃的条件下结合1 h，12 000 r ·min-1离心5 min，将上清转移至新的离心管中。沉淀采用无水乙醇悬浮混匀，12 000 r ·min-1离心5 min，重复5次。干燥后加入蛋白上样缓冲液，煮沸30 min，将所获得的上清、沉淀进行SDS-PAGE检测。
1.2.7 Tc-cpg-1基因转录水平的性别和组织差异表达采用qRT-PCR技术对Tc-cpg-1基因在T. canis雌虫、雄虫以及雌虫的各组织mRNA水平的差异表达进行分析。以各组织的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，每个样品设置三个重复，反应体系(15 μL)：SYBR Premix Ex Taq 7.5 μL、上下游引物(10 μmol·μL-1)各0.8 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 4.9 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s、94 ℃变性5 s、56 ℃退火30 s，40个循环，最后从60 ℃按0.5 ℃增值升温至95 ℃。采用比较△Ct法对Tc-cpg-1在各组织的相对表达量进行计算，以“平均值±标准差(x±s)”数据形式呈现各基因相对表达水平。
2 结果 2.1 Tc-cpg-1基因编码cDNA的克隆及原核表达载体的构建分别对T. canis雌虫、雄虫的cDNA模板进行PCR扩增，电泳检测显示仅在以雌虫cDNA为模板的PCR产物中可见一条约1 300 bp的特异性条带(图 1A)。将该序列克隆至pMD19-T(simple)Vector载体，测序结果显示序列长度为1 251 bp(含限制性内切酶识别序列和保护碱基)；通过ORF Finder预测Tc-cpg-1基因的开放阅读框，可知该基因从第1个碱基到第1 251个碱基为一个完整的CDS，共编码417个氨基酸，编码的蛋白为TcCPG1。将该CDS序列克隆至pET-32a(+)表达载体，经双酶切鉴定，结果表明目的基因成功连接到pET-32a(+)载体上(图 1E)。
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A.Tc-cpg-1基因的PCR产物扩增(1.雌虫；2.雄虫；3.阴性对照)；B. Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)质粒的PCR鉴定(1~4为阳性质粒)；C. Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)和pET-32a(+)质粒酶切(1. Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)质粒，2. pET-32a(+)质粒)；D.重组Tc-cpg-1/pET-32a质粒的PCR鉴定(1~2为阳性质粒)；E. Tc-cpg-1/pET-32a质粒双酶切(1.未酶切质粒；2.酶切重组质粒Tc-cpg-1/pET-32a；3.重组质粒Tc-cpg-1/pET-32a的PCR鉴定)；M. DNA相对分子质量标准 A. PCR amplification of Tc-cpg-1 gene (1. Female; 2. Male; 3. Negative control); B. PCR identification of recombinant plasmids Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)(1-4 were positive recombinant plasmids); C. The double enzyme digestion of Tc-cpg-1/pMD19-T(simple) and pET-32a (+) plasmids (1. Tc-cpg-1/pMD19-T(simple)plasmid; 2. pET-32a(+) plasmid); D. PCR amplification of Tc-cpg-1 from recombinant plasmids Tc-cpg-1/pET-32a (1-2 were positive recombinant plasmids); E. Enzyme digestion of recombinant plasmid Tc-cpg-1/pET-32a (1. Undigested recombinant plasmid Tc-cpg-1/pET-32a; 2. Digested recombinant plasmid Tc-cpg-1/pET-32a; 3. PCR identification of recombinant Tc-cpg-1/pET-32a); M. DNA molecular weight marker 图 1 重组Tc-cpg-1/pET-32a质粒构建 Fig. 1 The construction of recombinant plasmid Tc-cpg-1/pET-32a |
将阳性重组质粒Tc-cpg-1/pET-32a转化至大肠杆菌Transetta (DE3)感受态细胞后，在IPTG诱导下重组蛋白TcCPG1以包涵体形式表达，蛋白的大小约为70 ku，与理论预测值相符(图 2)。对诱导表达条件进行优化，诱导温度为16 ℃，时间为14 h以及IPTG浓度为0.8 mmol ·L-1作为诱导最佳条件，目的蛋白表达效率较高(图 3)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1. pET-32a空载体诱导上清；2. Tc-cpg-1/pET-32a未诱导上清；3. Tc-cpg-1/pET-32a 16 ℃诱导上清；4. Tc-cpg-1/pET-32a 30 ℃诱导上清；5. Tc-cpg-1/pET-32a 37 ℃诱导上清；6. Tc-cpg-1/pET-32a未诱导沉淀；7. Tc-cpg-1/pET-32a 16 ℃诱导沉淀；8. Tc-cpg-1/pET-32a 30 ℃诱导沉淀；9. Tc-cpg-1/pET-32a 37 ℃诱导沉淀 M. Protein molecular weight marker; 1. The supernatant of IPTG-induced pET-32a (empty); 2. The supernatant of non-induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a;3. The supernatant of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 16 ℃; 4. The supernatant of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 30 ℃; 5. The supernatant of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 37 ℃; 6. The precipitation of non-induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a;7. The precipitation of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 16 ℃; 8. The precipitation of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 30 ℃; 9. The precipitation of induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a under 37 ℃ 图 2 重组蛋白TcCPG1的SDS-PAGE分析 Fig. 2 The SDS-PAGE analysis of the recombinant protein TcCPG1 |
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A.时间条件优化(M.蛋白质相对分子质量标准；1. pET-32a诱导上清；2. Tc-cpg-1/pET-32a未诱导沉淀；3~8.诱导时间分别为4、6、8、10、12、14 h的沉淀)；B. 16 ℃ IPTG浓度优化(M.蛋白质相对分子质量标准；1. pET-32a诱导上清；2. Tc-cpg-1/pET-32a未诱导沉淀；3~7. IPTG浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的诱导沉淀) A. Optimization of induction time(M. Protein molecular weight marker; 1. The supernatant of IPTG-induced pET-32a;2. The precipitation of non-induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a;3-8. The precipitation of TcCPG1 from induction time were 4, 6, 8, 10, 12, 14 h, respectively); B. Optimization of IPTG concentration under 16 ℃(M. Protein molecular weight marker; 1. The supernatant of IPTG-induced pET-32a;2. The precipitation of non-induced recombinant Tc-cpg-1/pET-32a;3-7. The precipitation of TcCPG1 from IPTG concentration were 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol·L-1, respectively) 图 3 重组蛋白TcCPG1表达条件优化 Fig. 3 Optimization of expression condition of the recombinant protein TcCPG1 |
利用优化的条件大量诱导表达重组蛋白，采用生工生物的镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，通过20、50、100、250、500 mmol·L-1的咪唑浓度梯度进行洗脱，结果显示当咪唑浓度达到250 mmol·L-1时能洗脱大量的目的蛋白，洗脱后经检测在70 ku处有目的蛋白，与预期大小相符(图 4A)。将纯化的重组TcCPG1蛋白进行Western blot鉴定，结果显示，在70 ku处出现目的条带，与预测的重组TcCPG1蛋白大小相近(图 4B)。
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A.重组TcCPG1蛋白的纯化(M.蛋白质相对分子质量标准；1.重组TcCPG1蛋白；2.结合缓冲液；3~7.咪唑浓度分别为20、50、100、250、500 mmol·L-1洗脱)；B.重组TcCPG1蛋白的鉴定(M.蛋白质相对分子质量标准；1.重组TcCPG1蛋白) A. Purification of the TcCPG1 protein(M. Protein molecular weight marker; 1. TcCPG1 protein; 2. Binding buffer; 3-7. Imidozale concentration of 20, 50, 100, 250, 500 mmol·L-1, respectively); B. Identification of the TcCPG1 protein(M. Protein molecular weight marker; 1. TcCPG1 protein) 图 4 重组蛋白TcCPG1的纯化和鉴定 Fig. 4 Purification and identification of the protein TcCPG1 |
采用Bradfard法测定蛋白浓度并绘制标准曲线，将所测样品吸光度值带入公式得出重组TcCPG1蛋白浓度为0.24 mg·mL-1。利用1 μg纯化的重组TcCPG1蛋白与5 mg几丁质进行结合试验，结果表明，重组TcCPG1蛋白能够较好地结合几丁质(图 5)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.结合TcCPG1上清；2.结合TcCPG1沉淀；3. TcCPG1未结合对照 M. Protein molecular weight marker; 1. Binding of the supernatant of TcCPG1;2. Binding of the precipitation of TcCPG1;3. Un-binding TcCPG1 control 图 5 重组蛋白TcCPG1的几丁质结合验证 Fig. 5 Chitin-binding of the recombinant protein TcCPG1 |
采用qRT-PCR方法对T. canis雌虫、雄虫，以及雌虫生殖道、肠道、体壁各组织进行转录组差异分析。结果显示Tc-cpg-1在雌虫中高量表达，尤其在雌虫的生殖组织中表达量最高，而在雄虫、雌虫体壁和肠道中基本无表达(图 6)。
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A. Tc-cpg-1雌虫、雄虫差异表达；B. Tc-cpg-1雌虫组织差异表达 A. Differential-expression analysis of the relative mRNA expression levels of Tc-cpg-1 in female and male adults; B. Differential-expression analysis of the relative mRNA expression levels of Tc-cpg-1 in different tissues from female adults 图 6 Tc-cpg-1在雌、雄虫及雌虫各组织中的mRNA相对表达水平 Fig. 6 Relative mRNA expression levels of the Tc-cpg-1 in female, male adults and different tissues of female adults |
在脊椎动物中，硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)为蛋白多糖与硫酸软骨素链共价结合的糖蛋白，是作用于血管和中枢神经系统的重要物质[16-18]。目前，线虫的CPGs研究多集中于模式生物C. elegans中，研究发现该结构主要由蛋白多糖与软骨素链共价结合，软骨素链相对于脊椎动物缺乏硫酸化；CPGs不仅是C. elegans细胞外基质的结构成分，同时还大量存在于成虫的子宫和生殖腺中[12]，并且在C. elegans早期胚胎期间采用RNAi技术阻断软骨素的合成，或者采用酶降解软骨素后，可导致胚胎分裂的逆转或分裂细胞融合为多核体[19-21]，最终造成胚胎的死亡，说明CPGs在线虫的胚胎细胞质分裂和细胞分裂过程中起重要作用。
几丁质是无脊椎动物外骨骼和昆虫围食膜的重要组成成分，许多蛋白结合几丁质在生物体内发挥着保护、组织形成、信号传导等生理功能[22-23]。已经报道的能与几丁质结合的蛋白主要包括30K蛋白、几丁质酶、表皮蛋白、ATP合成酶等。这些蛋白均含有几丁质结构域(chitin binding domain，ChBD)，ChBD一般由长度为40个左右的氨基酸组成，具有6个半胱氨酸基序并形成3个二硫键。ChBD存在于大多数无脊椎动物的几丁质酶、围食膜蛋白和一些其他的蛋白中，研究已证实这些蛋白与几丁质的结合特性。Dong等[24]鉴定到家蚕表皮中有8个Gasp-Obstructor家族(具有1个或3个ChtBD2)的表皮蛋白能够与几丁质结合，其中包括3个CPAP1类和5个CPAP3类的蛋白；Hashimoto等[25]对环状芽胞杆菌WL-12几丁质酶A1的ChBD进行了研究，研究发现该ChBD有45个氨基酸，能够高度专一性的结合几丁质，且结合具有一定的可逆性。Deng等[26]发现家蚕BmWCP4蛋白的R&R-2结构域与几丁质结合过程中，其结构域中的芳香族氨基酸起到了关键作用。对TcCPG1蛋白进行序列分析，发现该蛋白含有4个ChBD2结构域，其保守的氨基酸也是芳香族氨基酸，暗示了芳香族氨基酸的确在与几丁质的结合过程中起到了重要作用。与TcCPG1有相似结构域的C. elegans CPG1位于卵壳的内胚层，几丁质位于卵壳的中胚层，其CPG1可以与几丁质进行结合，证实了CPG1的几丁质结合特性[20]。本试验采用TcCPG1蛋白与几丁质进行结合试验，结果显示该蛋白与几丁质具有较好的结合作用，推测TcCPG1可能通过与卵壳中几丁质的相互作用从而影响T. canis的胚胎和生殖发育过程。
软骨素蛋白多糖作为细胞外基质中的重要组成部分，在线虫生殖和/或胚胎发育过程中发挥着重要的作用。Mizuguchi等[12]发现C. elegans的软骨素蛋白多糖大量表达于生殖腺和子宫中，在卵母细胞、贮精囊和受精卵中也检测到软骨素的富集，而表皮组织中没有软骨素的表达。在本试验中，Tc-cpg-1在T. canis雌虫生殖组织中的表达量最高，而在雄虫、雌虫体壁和肠道中基本无表达，我们的研究结果与上述报道相一致，但是cpg-1基因在T. canis和C. elegans两个物种的组织表达模式还是不完全相同，究其原因可能是雌雄同体的C. elegans的生殖道结构和受精过程与T. canis的有性生殖过程存在一定差异[27-28]。有性生殖个体的输卵管具有极其复杂而精细的生理功能，对卵子受精、受精卵输送及早期胚胎的生存和发育起着重要作用；而C. elegans的受精并不发生于输卵管，而是输精管，胚胎则在子宫处发育。Olson等[20]采用RNAi沉默个别的软骨素蛋白多糖对胚胎的生存能力没有影响，但同时损耗CPG-1和CPG-2则导致生成多核单细胞胚胎，引起胚胎死亡，表明软骨素蛋白多糖在胚胎发育过程中起着重要作用。Tc-cpg-1在T. canis雌虫以及生殖组织中的特异性表达说明Tc-cpg-1参与了T. canis雌虫的生殖相关进程，这一结果为后续进行TcCPG1的生物学功能及作用机制研究奠定了基础。
4 结论成功构建了重组表达质粒Tc-cpg-1/pET-32a，诱导的重组蛋白TcCPG1能够与几丁质结合；Tc-cpg-1在雌虫的生殖组织中表达量最高，表明Tc-cpg-1可能参与了T. canis雌虫的生殖过程，推测TcCPG1可能通过与卵壳中几丁质的相互作用从而影响T. canis的胚胎和生殖发育过程。
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