禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)不仅给养禽业造成重大经济损失，而且因APEC复杂的致病性，对人类公共健康造成巨大的潜在威胁[1]。禽致病性大肠杆菌致病机制复杂，关键在于其具有诸多毒力因子(VFs)，主要有黏附素、温度敏感血凝素、摄铁系统、侵袭因子等[2]。鞭毛是细菌特有的结构，能依靠转动鞭毛马达，带动细菌鞭毛实现运动功能[3]。直接影响了细菌的趋化性，有助于细菌运动至适宜环境，从而实现对宿主细胞的黏附定植，是禽致病性大肠杆菌重要的毒力因子[4]。
非编码RNA-RyhB能快速调整自身的毒力基因表达和生理特征来适应变化的环境，从而利于致病菌在宿主中的侵染和存活，对细菌致病性的调节发挥重要作用[5]。铁吸收调节蛋白Fur是细菌中重要的全域调节因子，RyhB与Fur之间存在着负反馈调节的关系，当环境中铁浓度较低时，Fur失活，RyhB转录水平上升并调控细菌的铁吸收转运蛋白的表达；反之，Fur激活，RyhB转录水平下降[6]。铁是生物体内重要的营养物质，是很多生物过程中所必需的，但是过多的铁吸收会产生活性氧从而无差别地损伤细菌[7]。因此我们猜想作为细菌铁稳态的重要调节因子，Fur/RyhB是否会对APEC的鞭毛组装以及运动性产生影响，并拟通过基因敲除对Fur/RyhB调控APEC运动机制进行初步研究。
1 材料与方法 1.1 材料禽致病性大肠杆菌AE17野生株，为本实验室保存的O2血清型临床分离株；△RyhB由本实验室前期构建[5]。Red同源重组所需质粒：pKD46(同源重组的协助质粒，氨苄青霉素抗性)；pKD3(携带可被FLP重组酶识别的FRT位点，氯霉素抗性)；pCP20(42 ℃可表达FLP重组酶，用于消除FLP位点间的氯霉素抗性基因)；以上质粒均为安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室保存。高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司。
运动性培养基：胰蛋白胨10 g·L-1，氯化钠5 g·L-1，葡萄糖8 g·L-1，琼脂2.5 g·L-1。
1.2 禽致病性大肠杆菌缺失株△Fur、△Fur/RyhB的构建利用Red同源重组的方法[8]将pKD46电转入AE17感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，28 ℃过夜培养，次日挑取单菌落于LB培养基中，PCR验证pKD46成功转化到AE17中，得到AE17-PKD46。将PCR扩增的Fur同源臂片段电转入AE17-PKD46感受态细胞中进行敲除，在氯霉素抗性的LB固体培养基中筛选阳性重组子。用Fur-out-F、Fur-out-R引物进行PCR验证，最后将pCP20电转入正确的重组子中消除氯霉素抗性片段。在△Fur的基础上敲除RyhB, 方法同上。敲除所用引物见表 1(P1、P2为扩增Fur同源臂片段引物；P3、P4为扩增RyhB同源臂片段引物)。将阳性重组子送至上海生工生物工程有限公司测序并比对。
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表 1 基因缺失及验证所用的引物 Table 1 Primers for gene deletion and validation |
取四株菌OD600 nm=1.0的菌液提取total RNA，质检合格后通过Ribo-zero试剂盒去除rRNA来富集mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs(dNTP中的dTTP用dUTP取代)、DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA，之后用USER酶降解含有U的cDNA第二链。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1 ng·μL-1，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度(insert size)进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2 nmol·L-1)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，参考APEC O2-211(CP006834.1)基因组进行差异基因表达分析(阈值设定为|log2(FoldChange)| > 1且Q value < 0.005)并进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析。
1.4 AE17、△Fur、△RyhB以及△Fur/RyhB运动性的测定从平板上挑取四株菌单菌落接种到LB液体培养基静置培养至浑浊。1:100转接LB液体培养基中置于37 ℃静置培养至OD600 nm=1.0，3 000 r·min-1离心10 min，弃培养基并用无菌PBS缓冲液调整OD600 nm =2.0，移液枪吸取2 μL菌液点于运动性培养基中心，置于37 ℃培养箱静置培养6~8 h，观察细菌运动情况，并测量菌圈大小。
1.5 AE17、△Fur、△RyhB以及△Fur/RyhB鞭毛的透射电镜观察培养方法同“1.4”，用PBS缓冲液清洗3次后，将样品送至安徽农业大学生物科技中心进行透射电镜观察。
1.6 AE17、△Fur、△RyhB和△Fur/RyhB鞭毛相关基因的荧光定量PCR检测参照Trizol法提取四组细菌的总RNA。核酸蛋白浓度测定仪检测RNA浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用反转录试剂盒对RNA进行反转录。选取五个转录组学数据中差异显著的鞭毛相关基因，通过嵌入式荧光染料法进行荧光相对定量检测，测试样品重复三管，引物序列见表 2。
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表 2 荧光定量PCR所用引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time PCR |
从平板上挑取四株菌单菌落接种到LB液体培养基过夜培养。按1:100转接LB液体培养基中，将四株菌培养至对数生长期，调整OD600 nm至0.03，以LB作阴性对照组，接种于96孔板置于28 ℃培养48 h，每组3个重复。弃培养基并用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗3次，10%甲醇固定15 min后于0.1%结晶紫溶液中染15 min，弃去结晶紫并用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，用33%乙酸溶解并于酶标仪中测定OD595 nm数值。
1.8 AE17、△Fur、△RyhB以及△Fur/RyhB生物被膜的扫描电镜观察同“1.7”将四株菌培养至对数生长期，调整OD600 nm至0.03，接于12孔板中并将消毒的玻璃爬片置于孔板中，28 ℃静置培养48 h。取出爬片，PBS清洗3遍，晾干，2.5%戊二醛固定2 h，PBS缓冲液清洗3遍，3%戊二醛4 ℃再固定6 h，用无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次20 min；乙醇梯度脱水，最后置换到100%丙酮置于4 ℃，重复2次，每次20 min。将处理好的样本浸泡在100%丙酮中备于真空冷冻干燥，用导电胶将干燥后的样品固定于样品台上，在不导电的样品表面喷镀一层10 nm左右的贵金属，进样观察。
2 结果 2.1 缺失株△Fur、△Fur/RyhB的鉴定PCR验证△Fur、△Fur/RyhB内外侧引物(图 1、2)，结果显示△Fur内侧无条带，外侧条带减少约400 bp；△Fur/RyhB两个基因的内侧引物均无条带，外侧条带分别减少约400和100 bp。将测序结果与AE17中相关基因比对，结果显示敲除成功。
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M. DNA相对分子质量标准；1.AE17-Fur-in；2. △Fur-Fur-in；3. AE17-Fur-out；4. △Fur-Fur-out M. DNA marker; 1.AE17-Fur-in; 2. △Fur-Fur-in; 3. AE17-Fur-out; 4. △Fur-Fur-out 图 1 △Fur内、外侧的PCR鉴定 Fig. 1 Inner and outer PCR identification for △Fur |
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M. DNA相对分子质量标准；1. AE17-RyhB-in；2. △Fur/RyhB-RyhB-in；3. AE17-RyhB-out；4. △Fur/RyhB-RyhB-out；5. △Fur/RyhB-Fur-in；6. △Fur/RyhB-Fur-out M. DNA marker; 1. AE17-RyhB-in; 2. △Fur/RyhB-RyhB-in; 3. AE17-RyhB-out; 4. △Fur/RyhB-RyhB-out; 5. △Fur/RyhB-Fur-in; 6. △Fur/RyhB-Fur-out 图 2 △Fur/RyhB内、外侧PCR鉴定 Fig. 2 Inner and outer PCR identification for △Fur/RyhB |
转录学组学结果(图 3)显示△Fur有1 286个差异基因(DEGs)，其中649个上调，637个下调；△RyhB有1 001个差异基因，其中459个上调，542个下调；△Fur/RyhB有1 266个差异基因，其中668个上调，598个下调。Fur影响的差异基因主要富集在氧化还原过程(oxidation-reduction process)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)和辅因子结合(cofactor binding)，但差异显著的基因富集在纤毛或鞭毛依赖性细胞运动(cilium or flagellum-dependent cell motility)等与细胞运动相关的基因上，与后续运动性表型试验结果(见“2.3”)相符。RyhB影响的差异基因主要富集在有机物生物合成过程(organic substance biosynthetic process)、细胞生物合成过程(cellular biosynthetic process)、生物合成过程(biosynthetic process)。Fur/RyhB影响的差异基因主要富集在氧化还原过程(oxidation-reduction process)，同样的，与细胞运动性相关的基因差异最显著(如图 4)。
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有显著性差异表达的基因用红色点(上调)和绿色点(下调)表示，无显著性差异表达的基因用蓝色点表示；横坐标代表基因在不同样本中表达倍数变化；纵坐标代表基因表达量变化差异的统计学显著性 Note: Genes with significant differential expression are indicated by red dots (up-regulated) and green dots (down-regulated). Genes with no significant differential expression are represented by blue dots; abscissas represent fold change of genes in different samples; ordinate Representing the statistical significance of the difference in gene expression changes 图 3 差异表达基因火山图 Fig. 3 Volcano map of differentially expressed genes |
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纵坐标为富集的GO term，横坐标为该term中差异基因个数。不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能，带“*”为显著富集的GO term The ordinate is the enriched GO term, and the abscissa is the number of differential genes in the term. Different colors are used to distinguish biological processes, cellular components, and molecular functions, with "*" being a significantly enriched GO term 图 4 显著差异表达基因的GO功能分类 Fig. 4 GO functional classification map of significantly differentially expressed genes |
转录组学显示△Fur和△Fur/RyhB鞭毛相关差异表达基因非常相似，均有34个且均为下调，其中下调倍数较大的是FliC、FlgE、FliF、MotA。△RyhB中与鞭毛相关的差异基因有7个且均为下调，但下调倍数不大(表 3)，△Fur和△Fur/RyhB几乎影响了APEC鞭毛相关的所有基因(图 5)。
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表 3 部分鞭毛差异表达基因信息表 Table 3 Information of partial expressed difference flagellar genes |
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方框内为基因名称，方框内绿底表示该物种特有基因，绿色边框表示下调 The name of the gene is in the box, the green background in the box indicates the specific gene of the species, and the green border indicates the down regulation 图 5 大肠杆菌鞭毛调控KEGG通路 Fig. 5 KEGG pathway map of flagella regulation in Escherichia coli |
四株菌的运动性结果如图 6所示，△Fur的运动直径相比AE17有极显著的减小，△RyhB的运动直径与AE17无明显差异，△Fur/RyhB的运动直径介于△Fur与△Fur/RyhB之间且极显著小于AE17。
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a图为细菌运动产生的菌圈大小比较图；b图为菌圈直径差异图。***.P < 0.001 Figure a is a comparison of the size of the bacteria circle produced by bacterial movement; Figure b is the comparison of the diameter of bacterial movement circle.***.P < 0.001 图 6 运动性结果图 Fig. 6 Figure of athletic results |
电镜结果(图 7)显示AE17与△RyhB均能观察到明显的鞭毛，其中AE17的鞭毛数量略微多于△RyhB，△Fur/RyhB的鞭毛较AE17数量明显减少且长度明显缩短，而△Fur菌体上基本不见鞭毛，这与运动性结果与转录组学数据基本一致。
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图 7 鞭毛电镜图(8 000×) Fig. 7 Flagella electron micrograph(8 000×) |
△Fur和△Fur/RyhB鞭毛相关基因的荧光定量结果(图 8)与转录组学趋势基本一致，△RyhB鞭毛一些相关基因(如FliC、FliH)的转录水平与预期结果不相符，但是差异倍数较小且运动型表型结果中△RyhB与AE17差异并不显著，可能转录组学存在一定的误差。
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**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 8 鞭毛基因差异表达图 Fig. 8 Differential expression of flagellar genes |
四株菌生物被膜形成能力与运动能力的趋势基本一致，△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力较AE17极显著增强，而△RyhB极显著减弱，这可能是其他原因导致。扫描电镜(图 9)可观察到△Fur形成了致密的立体状的生物被膜结构，△Fur/RyhB生物被膜形成弱于△Fur，且有分布均匀的空隙，可能是双缺株影响了生物被膜的完整性。
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图a、b为结晶紫染色结果；图c为生物被膜电镜观察结果；图a中A表示AE17，F表示△Fur，R表示△RyhB，FR表示△Fur/RyhB，C为对照组 Figures a and b show the results of crystal violet staining; Figure c shows the results of electron microscopy of biofilms; In the figure a, A indicates AE17, F indicates ΔFur, R indicates ΔRyhB, FR indicates ΔFur/RyhB, and C is a control group 图 9 生物被膜形成能力比较 Fig. 9 Comparison of biofilm formation ability |
鞭毛是细菌运动的动力，在定植黏附并感染宿主细胞过程中发挥重要作用[9]。对细菌本身而言，运动性与趋化性、定植黏附息息相关，细菌为了更好地生存并增殖，会感应外界环境并游动趋向至高浓度的营养环境，从而提高生存能力[4, 10-11]。如果细菌的运动能力减弱，趋化性降低，便要承受自己产生的代谢产物的压力，为了适应这种由于丧失运动能力带来的不良环境，细菌会增加生物被膜的形成来应对这种困境，而生物被膜与细菌的耐药性紧密相关，因此我们认为鞭毛是细菌重要的毒力因素[12-15]。
从本文APEC的运动性表型试验和转录组学结果上来看，APEC鞭毛组装主要受Fur影响。如图 5所示，除了FliQ和FliR外所有关于鞭毛组装通路中的基因都显著下调，其中差异最显著的基因是FliC、FlgE和FliF，它们分别负责鞭毛三个主要结构：基体、鞭毛钩(hook)和鞭毛丝的组成。有报道称实质上铁是鞭毛生物合成的重要调节剂，几乎所有鞭毛成分都被铁激活[16]。Fur是细菌整体的铁调节蛋白，其缺失破坏了菌体内的铁稳态，使细菌本身营养代谢紊乱，产生的结果与报道一致[17]。RyhB虽然是细菌重要的外界环境感受器，但是它似乎并不影响APEC鞭毛相关基因的表达，可能是在富铁环境下RyhB缺失后APEC对铁的吸收补偿作用较强导致鞭毛组装不受较大影响。双缺株在鞭毛组装(flagellar assembly)KEGG通路中数据与△Fur相差无几也证实了这一点。双缺株的运动能力相比Fur单缺株有所增加，可能是Fur缺失后RyhB的缺失使铁的吸收得到一定的控制，铁稳态得到一定的恢复从而补偿了菌株的运动性，但是其中调控通路还不清楚。因此Fur直接影响了APEC鞭毛结构的组装导致细菌运动功能的失调，RyhB可能通过维持APEC铁稳态参与运动机制的调控。
除了细菌的运动性，鞭毛蛋白也参与细菌的致病过程。鞭毛特异性Ⅲ型分泌系统(F-T3SS)能分泌效应蛋白通过不同途径传递给宿主细胞影响宿主细胞的相关通路发挥毒力作用[18-19]。Fur缺失后鞭毛基因差异最显著的FliC在鼠伤寒沙门菌中过表达后能显著增强鞭毛蛋白特异性免疫蛋白IgG的应答，是开发候选疫苗的特别有吸引力的靶标[20]。在铜绿假单胞菌中FlgE蛋白含有两个宿主上皮细胞结合肽的位点，提示鞭毛在定植于宿主上皮细胞的重要作用，同时重组FlgE蛋白刺激人细胞系和鼠肺器官培养物中的促炎细胞因子产生，提示鞭毛相关蛋白在宿主与病原菌互作中起到一定作用[21]。因此作者猜想Fur能通过维持铁稳态保证鞭毛的合成及鞭毛蛋白的表达从而调控APEC感染宿主产生免疫应答，而RyhB作为受Fur负调控的基因可能通过补偿铁稳态参与该致病途径，但是不排除在低铁环境下会有不一样的现象和结果，这也是本文研究的后续内容之一。
4 结论Fur在禽致病性大肠杆菌(APEC)鞭毛组装过程中有重要作用，缺少Fur使APEC运动性能显著降低，进而增强APEC生物被膜的形成能力。受Fur负调控的RyhB缺失并不显著影响APEC的运动性，但在Fur缺失的条件下，RyhB的缺失对APEC的运动性有一定的补偿作用。因此，Fur和RyhB都参与了APEC的运动。
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