2. 北京市大兴区动物疾病控制中心, 北京 102600;
3. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
2. Beijing Daxing Center for Animal Disease Control, Beijing 102600, China;
3. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis, F. tularensis)是一种革兰阴性球杆菌，可感染包括哺乳动物、鸟类、节肢动物及人类在内的300个以上物种，引起宿主的土拉热[1]。土拉弗朗西斯菌极易通过呼吸道感染，加之感染剂量低、致病力强，二战及冷战时期，日本、苏联及美国均将其作为生物武器进行研发，美国CDC将其与炭疽、鼠疫等并列为A类生物战剂[2-4]。目前，土拉弗朗西斯菌被分为四个亚种，即土拉亚种(subspecies tularensis)、全北区亚种(subspecies holarctica)、新杀手亚种(subspecies novicida)及中亚亚种(subspecies mediasiatica)[4]。其中，土拉亚种对人的致病力最强，少则10个细菌即可引起人和动物的严重感染，如未及时治疗可引起30%以上的死亡率[5]，主要分布于北美地区[6]；新杀手亚种对人的致病力较弱，仅可感染免疫力低下的病人且一般不致死，但对小鼠的致病力极强，可导致小鼠出现同土拉亚种感染相似的症状，加之本亚种与土拉亚种的基因组相似性在97.7%以上[1]，因此常被用于土拉亚种研究的模型菌株。
土拉弗朗西斯菌是一种兼性细胞内寄生菌，可以在多种类型宿主细胞中增殖，其中巨噬细胞是其主要的靶细胞[7]。土拉弗朗西斯菌缺乏鞭毛、外毒素、芽胞等细菌经典的致病因子，入侵细胞及细胞内增殖能力是其主要的致病基础[8]。但由于对土拉弗朗西斯菌的研究在21世纪初才被重视，目前对其分子致病机制仍不清楚，已经明确功能的毒力因子主要包括毒力岛[9]、FipB[10]、FipA[11]、FmvB[12]、MsrB[13]、Fba[14]、FptB[15]、Slt[16]等。研究者们利用小鼠模型或细胞模型筛选获得了大量土拉弗朗西斯菌毒力相关基因，但其中多数基因的功能仍未知[17-22]。
本实验室在土拉弗朗西斯菌疫苗株LVS中的研究发现，FTN_0109基因转座子插入突变株在小鼠体内的存活能力大幅度下降[20]，但由于转座子中含有终止序列[23]，因此对于FTN_0109蛋白的致病机制仍需进一步确定。本研究以对人类无致病力的土拉弗朗西斯菌新杀手亚种U112为模型菌株，构建FTN_0109基因缺失株及其反式回补株，通过一系列试验表明，FTN_0109是一种内膜脂蛋白，它的缺失可以延长土拉弗朗西斯菌体外生长适应期，降低土拉弗朗西斯菌在巨噬细胞和小鼠体内的增殖能力，并削弱土拉弗朗西斯菌对小鼠的致病力。
1 材料与方法 1.1 实验动物6~8周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华公司。
1.2 菌株、细胞及质粒土拉弗朗西斯菌新杀手亚种U112(F. tularensis subspecies novicida U112, 以下简称U112)、pMP633::pTac、pMOD2EZTN-FT-Kmr质粒均由清华大学张敬仁教授惠赠；RAW264.7(小鼠单核细胞)、J774.1(小鼠肺泡巨噬细胞)细胞系均购自北京协和细胞库，BMDM(小鼠骨髓源巨噬细胞)由本实验室制备。
1.3 主要化学试剂及血清抗生素均购自Sigma公司；RMPI 1640培养基、胎牛血清均购自Gibco公司；TSB培养基、TSA培养基、脱脂奶均购自BD公司；鼠抗FTN_0109蛋白血清、鼠抗FopA蛋白血清及鼠抗IglC蛋白血清由本实验室制备并保存；HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。
1.4 FTN_0109的亚细胞定位土拉弗朗西斯菌及其衍生菌株均在含0.1%半胱氨酸的TSB液体培养基(TSBC)或TSA固体培养基(TSAC)培养，根据菌株特性加入卡那霉素(50 μg·mL-1)、潮霉素(200 μg·mL-1)；RAW264.7、J774.1细胞系及BMDM原代细胞均在含10%FBS(胎牛血清)的RMPI 1640培养基中培养。
参考文献方法[3]进行FTN_0109蛋白的亚细胞定位。过夜培养U112，调整其OD600 nm=1.0，取1 mL菌悬液离心(8 000 × g，5 min)，沉淀重悬于100 μL 0.01 mol·L-1 PBS(pH7.4)中，以此作为全菌体对照。
亚细胞定位样品制备方法如下：取1 mL菌悬液离心(8 000 × g，5 min)，沉淀重悬于1 mL 20 mmol·L-1 Tris-HCl(含20%蔗糖，pH 8.0)，加入终浓度15 mmol·L-1 EDTA、200 μg·mL-1溶菌酶，冰上静置40 min后，4 ℃ 8 000 × g离心20 min，收集上清，即为周质间隙蛋白(periplasm)，PBS等体积重悬沉淀，沉淀即为原生质体(protoplast)；取30 mL菌悬液离心(8 000 × g，20 min)，并用PBS洗涤两次，重悬菌液进行超声破碎(300 W，10 min)，4 ℃ 10 000 × g离心30 min，上清经0.45 μm滤膜过滤后，4 ℃ 100 000 × g离心1 h，收集上清，即为细胞质蛋白(cytoplasm)，沉淀重悬于1%十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)中，室温静置30 min后，4 ℃ 100 000×g离心1 h，收集上清，即为内膜蛋白(inner membrane)，等体积PBS重悬沉淀，即为外膜蛋白(outer membrane)。
将上述样品加入蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min后进行Western blot检测。选取土拉弗朗西斯菌主要外膜蛋白FopA作为外膜蛋白对照，毒力岛细胞质部分蛋白IglC作为细胞质蛋白对照[3]，以排除操作误差对结果的影响。鼠抗FTN_0109血清、鼠抗IglC血清均1 000倍稀释，鼠抗FopA蛋白5 000倍稀释，HRP羊抗鼠IgG 5 000倍稀释。
1.5 FTN_0109基因缺失株、回补株构建及体外生长检测利用同源重组构建FTN_0109基因缺失菌株[1]。分别利用引物0109UF/0109UR、0109DF/0109DR(见表 1)从U112基因组中扩增FTN_0109基因的上、下游序列，利用引物Kan0F/Kan0R从pMOD2EZTN-FT-Kmr中扩增卡那霉素抗性基因，然后利用融合PCR连接以上三个片段，并将连接片段电击转化进入U112感受态[24]，电击电压为1.8 kV(0.1 cm电转杯)，利用卡那霉素抗性进行阳性克隆筛选，获得的阳性克隆命名为ΔFTN_0109。
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表 1 本研究中使用的引物 Table 1 Primers used in this study |
利用引物0109comF/0109comR(见表 1)从U112基因组中扩增FTN_0109基因全序列，利用引物groESL0F/groESL0R(见表 1)从pMP633::pTac质粒中扩增groEL启动子，然后利用融合PCR连接以上两个片段，将连接好的片段经BamHⅠ/KpnⅠ双酶切后，连接进入pMP633::pTac质粒，最后将构建的FTN_0109回补质粒电击转化进入U112感受态[24]，电击电压为1.8 kV(0.1 cm电转杯)，利用潮霉素抗性进行阳性克隆筛选，获得的阳性克隆命名为ΔFTN_0109::FTN_0109。
过夜培养U112及其突变菌株，用TSBC调整OD600 nm=0.1，1 000倍稀释后，接种于细菌培养板(200 μL·孔-1)。将细菌培养板置于全自动细菌生长曲线分析仪(Bioscreen C)进行培养，培养条件设置：37 ℃、中速、间隔30 min读数(OD600 nm)。
1.6 细胞感染小鼠骨髓源巨噬细胞(BMDM)参考文献中方法制备[25]。分别将BMDM、RAW264.7及J774.1接种24孔细胞培养板(2×105细胞·孔-1)，37 ℃ 5% CO2培养至细胞铺满80%左右进行试验。将U112及其衍生菌株培养至对数中期(OD600 nm=0.6~1.0)，用无血清的RMPI 1640培养基调整细菌的OD600 nm=0.3[(3~5)×108 CFU·mL-1]，按照感染复数(MOI)100:1(细菌:细胞)进行细胞感染(0 h)[3]。细菌与细胞共感染2 h后，加入50 μg·mL-1的四环素处理1 h以杀灭未入侵的细菌。在感染后3、24 h，去除细胞培养上清，加入冰冷的纯水破碎细胞，将细菌与细胞碎片混合物适当稀释后涂布TSAC平板，37 ℃培养24 h后进行细菌计数。
1.7 BALB/c小鼠感染为检测FTN_0109蛋白缺失后，U112对小鼠致病力的变化，将40只6~8周龄雌性BALB/c小鼠均分为8组，分别皮下感染不同剂量的U112或ΔFTN_0109，每天观察小鼠的临床症状及死亡情况，连续观察21 d，根据Reed-Muench法计算细菌LD50。
为进一步分析U112及其衍生菌株在小鼠体内的分布，将50只6~8周龄的雌性BALB/c小鼠均分为10组，分别皮下感染U112(5.5 × 103 CFU)、ΔFTN_0109(4.7 × 105 CFU)及ΔFTN_0109::FTN_0109(4.5 ×103 CFU)，在感染后1、2、4和6 d，脱颈处死小鼠，分别取其肝、脾、肺进行匀浆，适当稀释后涂布TSAC平板，37 ℃培养24 h进行细菌计数。
1.8 统计学分析文中图表均采用GraphPad Prism 6软件制作，如无特别说明，图表数据均为平均值±标准差(x±s)，统计学分析均采用独立样本t检验(*示P < 0.05; **示P < 0.01; ***示P < 0.001)。
2 结果 2.1 FTN_0109是一种内膜脂蛋白通过对FTN_0109蛋白的生物信息学分析发现，FTN_0109蛋白在土拉弗朗西斯菌各亚种高度保守(氨基酸相似性>96%)且均功能未知，在其他亲缘细菌中亦未发现有高度同源的蛋白(氨基酸相似性 < 30%)(http://www.uniprot.org/blast/)；进一步分析表明，FTN_0109蛋白包含一段脂蛋白信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP)，但不含跨膜螺旋区(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。FTN_0109信号肽与枯草芽胞杆菌、大肠杆菌中已知脂蛋白信号肽氨基酸序列比对发现，氨基酸相似性在18%~44%，信号肽切割位点均含有一个保守的半胱氨酸(简称C)“脂蛋白框”[26](见图 1A)，它是半胱氨酸酰基化靶点，同时也是成熟脂蛋白N端起始氨基酸，表明FTN_0109蛋白是一种脂蛋白。
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A.采用BioEdit软件比较土拉弗朗西斯菌的FTN_0109蛋白与其他菌株脂蛋白信号肽的相似性；B.Western blot分析土拉弗朗西斯菌FTN_0109蛋白的定位，FopA作为外膜蛋白对照，IglC作为细胞质蛋白对照，蛋白质相对分子质量标记于图片右侧(ku) A. Alignment of signal peptides of FTN_0109 and several lipoproteins using BioEdit software; B. Location analysis of FTN_0109 in F. tularensis by Western blot. Outer membrane protein FopA and Cytoplasm protein IglC were used as controls. The sizes of the protein are indicated at the right in kDa 图 1 Western blot检测FTN_0109蛋白在土拉弗朗西斯菌中的分布 Fig. 1 Location detection of FTN_0109 in F. tularensis by Western blot |
为确定FTN_0109蛋白在土拉弗朗西斯菌中的细胞位置，本研究采用超速离心技术对细菌亚细胞成分进行了分离。Western blot检测表明，FTN_0109蛋白是细菌原生质体成分，并且主要分布于细菌细胞内膜中(见图 1B)。结合生物信息学分析，FTN_0109蛋白是一种内膜脂蛋白。
2.2 FTN_0109基因缺失延长土拉弗朗西斯菌体外培养的适应期PCR检测结果显示，通过同源重组，ΔFTN_0109菌株中FTN_0109基因已被卡那霉素抗性基因替换(见图 2A)；同时，Western blot分析表明ΔFTN_0109菌株未表达FTN_0109蛋白(见图 2B)。对回补菌株ΔFTN_0109::FTN_0109检测结果表明，该菌株既包含卡那霉素抗性基因，也含有FTN_0109基因(见图 2A)，并可正常表达FTN_0109蛋白(见图 2B)。体外培养检测结果显示，ΔFTN_0109菌株的适应期延长，但进入对数生长期后，细菌繁殖状态回复，与亲代相似(见图 2C)。
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A.U112及其衍生菌株的FTN_0109基因缺失PCR鉴定(M为DNA相对分子质量标准)，DNA相对分子质量标于图片左侧(bp); B. U112及其衍生菌株的FTN_0109蛋白检测，相对分子质量标记于图片右侧(ku)；C. U112及其衍生菌株的生长曲线 A. Deletion of FTN_0109 was identified by PCR in U112 and its derivatives, sizes of DNA are indicated at the left in bp; B. Loss of FTN_0109 was identified with polyclonal antibody against recombinant FTN_0109 protein by Western blot in U112 and its derivatives, size of protein is indicated at the right in kDa; C. Growth curve of U112 and its derivatives 图 2 土拉弗朗西斯菌FTN_0109基因缺失突变株的构建及体外生长检测 Fig. 2 Construction of FTN_0109 mutant strain and growth detection in vitro |
土拉弗朗西斯菌主要感染宿主巨噬细胞，细菌在巨噬细胞内的繁殖与其致病力直接相关。细胞感染结果显示，在RAW264.7细胞中，ΔFTN_0109与U112对细胞的入侵无显著差异，但感染24 h后，ΔFTN_0109在细胞内菌量几乎没有增长，且显著低于亲代U112及ΔFTN_0109::FTN_0109(见图 3A)。J774.1及BMDM细胞感染试验进一步证明FTN_0109基因缺失可以完全抑制土拉弗朗西斯菌的细胞内增殖(见图 3B、C)。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01 图 3 FTN_0109基因缺失显著降低土拉弗朗西斯菌在宿主细胞内的繁殖 Fig. 3 Deletion of FTN_0109 abolished intracellular replication of F. tularensis |
将ΔFTN_0109突变株培养物经系列稀释感染小鼠，结果显示，感染102 CFU亲代U112即可引起小鼠死亡(见图 4)，计算U112的LD50为102.17 CFU。与此对应，小鼠感染107 CFU的ΔFTN_0109突变株在21 d内均未出现死亡(LD50>107 CFU)，相比于亲代U112，ΔFTN_0109突变株对小鼠的LD50上升了10 000倍以上。
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图 4 U112和FTN_0109缺失株对BALB/c小鼠的致病力 Fig. 4 Pathogenicity of U112 and ΔFTN_0109 to BALB/c mice |
为进一步分析土拉弗朗西斯菌在BALB/c小鼠体内的分布，本研究采用皮下感染小鼠，并检测感染后不同时间点小鼠肝、脾、肺中的细菌载量。由于预试验中未在103 CFU FTN_0109缺失株感染的小鼠脏器中分离到细菌，本研究采用105 CFU FTN_0109缺失株感染小鼠。结果显示，小鼠经皮下途径感染103 CFU的亲代U112后2~6 d，肝、脾和肺组织的细菌载量呈现上升趋势(见图 5A~C)，载菌量均达到106 CFU；与此相比，ΔFTN_0109突变株感染小鼠后2~6 d，肝、脾中的细菌呈现下降趋势，且最高载菌量在103 CFU以下，肺中始终未分离到该菌，而回补株ΔFTN_0109::FTN_0109在感染后4 d可达到野毒株U112的感染水平，但在感染后6 d细菌载量开始下降，推测可能与回补株中反式互补菌株在没有抗生素的选择压力下质粒表达水平下降有关。综合结果表明，FTN_0109基因的缺失可导致土拉弗朗西斯菌在感染小鼠体内的繁殖显著降低。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 5 土拉弗朗西斯菌U112及其衍生突变株在感染小鼠脏器中的动态分布 Fig. 5 Dissemination of U112 and its derivatives in organs of BALB/c mice |
土拉弗朗西斯菌的致病力与其对巨噬细胞的入侵及细胞内生存与增殖密切相关，目前利用巨噬细胞、小鼠等模型已筛选获得了大量土拉弗朗西斯菌的毒力相关基因，但其中多数基因的功能仍未知。FTN_0109蛋白在土拉弗朗西斯菌的各个亚种中高度保守，但在其他菌株中仅有非常有限的氨基酸相似性(< 30%)，因此无法通过其他菌株的同源蛋白对FTN_0109进行功能预测。鉴于此，本研究通过对FTN_0109蛋白生物信息学分析、亚细胞定位及FTN_0109基因缺失株表型分析，初步鉴定了FTN_0109在细胞内分布、对土拉弗朗西斯菌生长及致病力的影响，为进一步对其功能鉴定奠定基础。
原核微生物的脂蛋白不仅与其多种生理功能相关(包括膜稳定性、细胞分裂、营养摄取、信号转导等)[27]，而且也影响其致病性(包括细胞黏附、定植、入侵等)[28]。一般认为，脂蛋白信号肽C端含有4个氨基酸残基的“脂蛋白框”，这也是对其进行生物信息学分析的基础[26-27]。但随着越来越多的脂蛋白被发现，目前“脂蛋白框”中的保守氨基酸仅包含半胱氨酸，它是半胱氨酸酰基化靶点，同时也是成熟脂蛋白N端起始氨基酸[29]。通过对FTN_0109蛋白进行生物信息学分析，FTN_0109蛋白N端包含信号肽，且在其氨基酸序列的第21位含有“脂蛋白框”保守的半胱氨酸残基，加之其主要定位于细菌内膜但无跨膜螺旋序列，因此FTN_0109是一种内膜脂蛋白。
在实验室培养环境下，土拉弗朗西斯菌生长培养基需要额外添加半胱氨酸、增菌培养液、葡萄糖、含铁血红素等多种营养成分，但其在环境分布广泛，空气、水源均可成为其传播媒介[4]。为适应环境中贫瘠的营养条件，土拉弗朗西斯菌进化出多种营养摄取途径，例如在丝氨酸受限环境中土拉弗朗西斯菌利用甘氨酸切割系统将甘氨酸作为丝氨酸合成的碳源[30]，钾离子受限环境中利用TrkH蛋白吸收低浓度钾离子[31]等，这些代谢途径的破坏均可引起细菌不同程度的生长缺陷。FTN_0109作为一种膜蛋白，它的缺失可能会引起细菌对盐离子、营养物质代谢障碍，但经试验发现FTN_0109缺失并不会引起土拉弗朗西斯菌对盐粒子敏感性变化(数据未列出)，但可引起细菌的生长适应期延长，我们推测这一生长缺陷可能与FTN_0109缺失引起的营养摄取障碍有关，在下一步的研究中笔者将对这一推断进行验证。
土拉弗朗西斯菌对靶细胞的感染包括入侵及细胞内增殖两个过程，任一过程的破坏均可导致细菌感染能力的下降。目前已知的多数毒力相关基因均可通过不同的途径影响土拉弗朗西斯菌的细胞内增殖。AcpA(酸性磷酸酶)缺失可降低土拉弗朗西斯菌的吞噬泡逃逸能力，进而影响其在宿主细胞内的繁殖[32]；PurMCD参与土拉弗朗西斯菌的嘌呤合成，它的缺失可引起土拉弗朗西斯菌丧失细胞内增殖、诱导细胞凋亡及细胞毒性的能力[33]。FTN_0109基因缺失后，土拉弗朗西斯菌在巨噬细胞中的增殖能力几乎完全丧失，在小鼠肝、脾中可被快速清除，这与我们早期在土拉弗朗西斯菌LVS中的发现一致[20]，表明FTN_0109蛋白对维持土拉弗朗西斯菌的致病力至关重要。
4 结论成功构建土拉弗朗西斯菌FTN_0109基因缺失菌株，通过一系列试验证实，FTN_0109蛋白主要位于土拉弗朗西斯菌内膜，该蛋白缺失可延长土拉弗朗西斯菌体外适应期和在巨噬细胞中的增殖能力，并减弱土拉弗朗西斯菌在小鼠体内的繁殖能力和致病力。本研究结论为进一步研究FTN_0109蛋白参与土拉弗朗西斯菌致病力的分子致病机制奠定了基础，并为土拉弗朗西斯菌预防和治疗提供一种新的药物或疫苗靶位。
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