牛传染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia, CBPP)又称牛肺疫，是由丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides SC，MmmSC)引起的一种急性、亚急性或慢性接触性传染病，严重危害动物健康，被世界动物卫生组织(OIE)列为需要上报的传染病^[1]。该病于1919年从澳大利亚引进奶牛时传入我国并流行，给养牛业带来巨大的经济损失。我国于1958年利用MmmSC国内分离株Ben-1在兔或绵羊体内连续传代研制成功“兔化绵羊化弱毒疫苗”，利用该疫苗成功控制了CBPP在我国的流行，于1989年扑杀最后一头患病牛后，中国再无发病牛和死亡牛的报道, 并于2011年5月被OIE宣布为无牛肺疫国家^[2]。为保持我国无疫状态，本实验室作为国家牛传染性胸膜肺炎参考实验室，每年都会按OIE要求在全国范围内开展CBPP血清学监测。我国当前无CBPP血清学检测的商品化试剂盒，目前采用OIE推荐的竞争ELISA方法(competition ELISA, cELISA)进行CBPP血清学监测，检测成本较高、供货期长，不能满足该病大规模监测及有效防控的要求。虽然我国目前未发现CBPP感染病例，但该病在我国周边国家仍存在流行，传入我国的风险很大。因此，本研究围绕CBPP的血清学诊断方法开展研究，以期为我国CBPP大规模监测提供经济有效的检测手段，也为CBPP传入我国的风险评估和应急防控提供有效技术储备。

由于支原体没有细胞壁，其锚定于质膜胞外的表面脂蛋白与宿主直接相互作用，刺激机体产生强烈的免疫反应^[3-5]。表面脂蛋白在支原体诊断和致病性方面都引起了极大的关注，已被报道具有诊断抗原的潜能^[6-8]。笔者对MmmSC国内分离株Ben-1株进行全基因组测序及注释，通过生物信息学分析，寻找位于支原体质膜表面的脂蛋白作为候选蛋白，初步筛选到12个脂蛋白进行后续研究。利用原核表达系统获得每个候选脂蛋白的重组蛋白，然后用纯化的重组蛋白对牛传染性胸膜肺炎、牛支原体、牛鼻支原体、无乳支原体的阳性抗体进行初步ELISA检测，筛选到能特异性区分上述呼吸道病原体的重组蛋白rP0308。随后以CBPP阳性血清和阴性血清分别作为一抗，应用Western blot进行鉴定，结果显示rP0308能与CBPP阳性血清发生特异性反应，不与阴性血清发生特异性反应。本研究建立了以rP0308作为包被抗原的间接ELISA方法，并对其性能进行分析。

1 材料与方法 1.1 菌株、血清和主要试剂耗材

MmmSC分离株Ben-1由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离鉴定并保存；质粒pET-28a载体、CBPP阴性血清、阳性血清由本实验室保存；牛支原体、牛鼻支原体和无乳支原体等的阳性血清、阴性血清由本实验室制备并保存；T4 DNA Ligase购于宝生物工程(大连)有限公司；感受态细胞DH5α及BL21(DE3)购于Vazyme公司；TMB、兔抗牛的IgG-HRP购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；特超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；CBPP抗体检测试剂盒购于北京爱德士(IDEXX)元亨生物科技有限公司；终止液H₂SO₄购自国药集团化学试剂有限公司；ELISA板购自JET BIOFIL公司。

1.2 目的基因的分析及引物设计

参考Ben-1株全基因组序列，获得P0308基因的完整基因序列及其编码的蛋白序列。利用在线分析预测网站对P0308编码蛋白的信号肽及跨膜结构进行预测。序列分析发现该蛋白序列中没有色氨酸密码子(TGA)不需要同义突变，去除信号肽序列，根据载体特征在引物上、下游分别加入EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点，目的基因长度573 bp，引物序列如下，F：5′-EcoRⅠ-atgggtcgcggatccgaattcAATAATGA-ACCTGAACAATTATCTAAACTAGA-3′，R：5′-SalⅠ-tgcggccgcaagcttgtcgacTTAATTAATTAAATCTTCTTTTT-GTTTATTTGA-3′。引物由北京华大基因科技有限公司合成。

1.3 目的基因扩增及原核表达载体的构建

将Ben-1株用支原体培养基复苏，按照DNA提取试剂盒的说明书提取Ben-1株基因组。并以其为模板进行PCR扩增。采用20 μL反应体系：2×预混buffer 10 μL，F、R引物(10 μmol·L^-1)各1 μL，ddH₂O补充至20 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min, 30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物预期为573 bp。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。胶回收PCR产物P0308。EcoRⅠ和SalⅠ双酶切P0308和pET-28a空载体后进行胶回收。用T4连接酶连接双酶切后回收的P0308与pET-28a，采用热激法将连接产物转化至DH5α宿主菌，用带有Amp抗性的LB固体培养基进行培养，37 ℃培养箱培养12 h。挑取单克隆在含Amp的LB液体培养基过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒后经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，正确者送北京华大基因科技有限公司进行测序。

1.4 重组蛋白rP0308的表达纯化及鉴定

将重组质粒pET-28a-P0308转化至BL21(DE3)感受态细胞中，在37 ℃振荡培养至对数生长期(OD_{600 nm}达到0.6时)，加入终浓度为0.5 mmol·L^-1 IPTG，30 ℃振荡培养12 h后，离心收集菌体，PBS洗涤3次，超声破碎，4 ℃ 12 000 r·min^-1离心10 min，分离上清和沉淀。按照His标签蛋白纯化试剂盒说明对获得的重组蛋白进行纯化，纯化的蛋白经超滤浓缩去除咪唑。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析纯化效果，用BCA蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行定量。将纯化的蛋白作Western blot鉴定，即SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，用5%的鱼明胶封闭，分别用CBPP的阳性血清和阴性血清1:100倍稀释后作为一抗，HRP标记的兔抗牛IgG(1:8 000)为二抗，加入特超敏ECL化学发光试剂盒A液与B液的等量混合物，避光反应2 min，用化学发光成像系统曝光并观察结果。

1.5 间接ELISA检测方法的建立 1.5.1 重组抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

将纯化重组蛋白rP0308用0.05 mol·L^-1碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)分别稀释至10、5、2.5、1.25、0.62、0.31 μg·mL^-1，100 μL·孔^-1，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min；然后加入封闭液(含5%鱼明胶的PBST)，200 μL·孔^-1，4 ℃封闭过夜，洗涤方法同上；CBPP阳性血清和阴性血清用PBS缓冲液分别作1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640的稀释，100 μL·孔^-1，每个稀释度作三个重复，进行ELISA方阵试验，兔抗牛的IgG-HRP按1:10 000倍稀释，100 μL·孔^-1，37 ℃孵育45 min，洗涤后加入TMB显色液，37 ℃避光显色10 min后每孔加入100 μL终止液(2 mol·L^-1 H₂SO₄)终止反应。于酶标仪上读取OD_{450 nm}值，并计算相应的P/N值，P/N值最大的孔所对应的条件为重组抗原最佳包被浓度和血清最适稀释度。

1.5.2 最佳封闭液和封闭条件的确定

按照上述优化好的条件，将5%鱼明胶、1%鱼明胶、1%马血清用PBS稀释作为封闭液，并设立空白对照，分别在37 ℃ 2 h和4 ℃过夜的条件下进行封闭，以最大P/N值所对应的条件为最佳封闭液和封闭时间。

1.5.3 待检血清工作时间的确定

按照上述优化好的条件，将血清按照确定的最佳稀释度加入到96孔酶标板，于37 ℃下作用30、60和90 min，比较各组OD_{450 nm}值，以最大P/N值所对应时间为血清最佳工作时间。

1.5.4 酶标二抗最佳稀释倍数和工作时间的确定

按照上述优化好的条件，将酶标二抗分别作1:5 000、1:10 000、1:20 000倍稀释，加入96孔酶标板，于37 ℃下作用30、45和60 min，比较各组OD_{450 nm}值，以最大P/N值所对应的条件为二抗最佳稀释倍数和最佳工作时间。

1.5.5 最佳显色时间的确定

按照上述优化好的条件，将底物的显色时间分别设为5、10和15 min，以最大P/N值所对应时间为最佳显色时间。

1.5.6 cut-off值的确定

由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存的牛血清样品，CBPP阳性血清110份和CBPP阴性血清100份。按上述建立的间接ELISA方法对以上确定的阳、阴性血清进行检测，记录样品的OD_{450 nm}，并将OD_{450 nm}值转化为S/P值，应用MedCalc v15.8对结果进行交互式点图分析和ROC分析，确定cut-off值。

$ {\rm{S/P = }}\left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{样品}}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{阴性对照}}}}} \right)/\left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{阳性对照}}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{阴性对照}}}}} \right)。$

1.6 间接ELISA方法的评估 1.6.1 敏感性试验

随机选取50份已知的CBPP阳性血清，用间接ELISA方法进行检测，计算其敏感性。

1.6.2 特异性试验

随机选取50份已知的CBPP阴性血清，用间接ELISA方法进行检测，计算其特异性。

1.6.3 灵敏性分析

用PBS将CBPP的阳性血清从1:20倍比稀释至1:2 560倍，使用间接ELISA方法对各个稀释度的血清进行检测，每个稀释度的血清做三个重复，同时设CBPP阳性、阴性对照，计算待检血清的S/P值。

1.6.4 交叉反应性分析

用间接ELISA方法对牛支原体、牛鼻支原体、无乳支原体、口蹄疫、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛结核分枝杆菌的阳性血清进行检测，每种血清做三个重复，同时设CBPP阳性、阴性对照，计算待检血清的S/P值。

1.6.5 重复性试验

批内重复性试验：用同一批次纯化的蛋白包被ELISA板，在同一块酶标板内检测3份阳性血清和3份阴性血清，按照建立的间接ELISA方法对每份血清进行6次重复性试验，统计检测结果并计算平均值、标准偏差和变异系数。

批间重复性试验：用不同批次制备的6批蛋白分别包被ELISA板，同样用3份CBPP的阳性血清和3份CBPP的阴性血清，按照建立的间接ELISA方法对每份血清进行6次重复性试验，统计检测结果并计算平均值、标准偏差和变异系数。

1.6.6 与商品化试剂盒的符合率

用以上建立的间接ELISA和商品化试剂盒分别检测1 648份临床血清，然后统计两者的符合率。

2 结果 2.1 目的基因的分析及原核表达载体构建

通过TMHMM Server v.2.0网站预测该蛋白不存在跨膜结构域。SignalP-5.0网站预测该蛋白存在28 aa的信号肽。因此，去除28 aa的信号肽序列，以Ben-1株基因组为模板，PCR扩增获得大小为573 bp的目的基因，其大小与预期相符(图 1)。该片段经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆于pET-28a载体中构建重组表达载体，重组载体经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切初步鉴定后，进行测序鉴定。测序结果通过比对显示，插入的P0308基因序列与Ben-1株P0308序列一致，表明重组质粒pET28a-P0308构建成功。

2.2 重组蛋白rP0308的表达、纯化及SDS-PAGE和Western blot鉴定

重组菌pET-28a-P0308-DE3在30 ℃用IPTG诱导12 h后，经SDS-PAGE分析显示，重组蛋白获得高效表达，在约28 ku处出现目的蛋白条带，与预期大小一致(如图 2)，应用His标签蛋白纯化试剂盒获得比较纯的目的蛋白。将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定，结果显示该蛋白可以与CBPP的阳性血清特异性结合，在预计相对分子质量大小位置出现特异性条带；而不与CBPP的阴性血清发生特异性反应(如图 2)。

2.3 间接ELISA检测方法的建立 2.3.1 间接ELISA检测方法最佳反应条件的优化

ELISA方阵试验结果显示，当包被抗原浓度稀释为2.5 μg·mL^-1，血清稀释倍数为1:80时，P/N值最大，因此确定最适抗原的包被浓度为2.5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1:80；按照上述条件继续进行后续条件的优化，根据P/N值大小可确定最佳封闭条件为1%鱼明胶，4 ℃过夜、血清最佳作用时间为37 ℃ 1 h、酶标二抗最佳稀释度为1:5 000，反应条件为37 ℃ 45 min、底物最佳显色条件为37 ℃避光10 min。

2.3.2 cut-off值的确定

用本研究建立的间接ELISA方法对110份CBPP阳性血清和100份阴性血清进行检测，然后将OD_{450 nm}值转化为S/P值，用MedCalc v15.8统计学软件对间接ELISA的数据进行ROC曲线分析(图 3)，结果表明，当敏感性为90.8%，特异性性为94.0%时，其最优的cut-off值为0.36，因此，当血清样品的S/P值大于0.36时，判定为阳性，当血清样品的S/P值小于0.36时，判定为阴性。

2.4 间接ELISA方法的评估 2.4.1 敏感性试验

用建立的间接ELISA方法对50份已知的CBPP阳性血清进行检测，将OD_{450 nm}转化为S/P值，结果显示检出阳性46份，故该方法的敏感性为92%。

2.4.2 特异性试验

用建立的间接ELISA方法对50份已知的CBPP阴性血清进行检测，将OD_{450 nm}转化为S/P值，结果显示检出阴性48份，故该方法的特异性为96%。

2.4.3 灵敏性分析

用建立的间接ELISA方法对各个稀释度的血清进行检测，将OD_{450 nm}转化为S/P值，其结果表明(表 1)，当血清稀释度到1 280时，其S/P值仍大于0.36，说明该方法的敏感性较高。

2.4.4 交叉反应性分析

用建立的间接ELISA方法所检测牛支原体、牛鼻支原体、无乳支原体、口蹄疫、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎和牛结核分枝杆菌的阳性血清的S/P值均小于0.36，为阴性，表明所建立的间接ELISA与其他常见牛呼吸道疾病的阳性血清均不发生交叉反应。

2.4.5 重复性试验

统计学分析结果显示：批内变异系数在2.41%~6.03%，批间变异系数在2.94%~6.59%，表明同一份血清在同一块或不同块酶标板上的变异程度很小，说明所建立的间接ELISA方法具有较好的重复性。

2.4.6 与商品化试剂盒的符合率

用已建立的间接ELISA方法和美国IDEXX公司商品的ELISA试剂盒分别检测1 648份临床样品，结果表明，间接ELISA和商品化试剂盒的阳性符合率为79.2%(57/72)，阴性符合率为89.1%(1 405/1 576)，故总的符合率为88.7%[(57+1 405)/1 648]，见表 2。

3 讨论

CBPP又称牛肺疫，可通过动物接触发生快速传播，暴发性流行时死亡率高，而慢性或隐性感染时，发病过程和病理变化很轻微或无临床症状，容易被人们所忽视^[9-11]。该病在20世纪50~70年代给我国养牛业造成重大经济损失，随后通过大面积免疫及采用检疫、隔离、扑杀等综合防治措施成功根除了CBPP^[2]。目前世界上只有7个国家被公认无CBPP，由于基础设施薄弱以及游牧业生产方式等原因，该病在非洲和我国毗邻的东南亚地区仍在扩散和流行^[12]。在国际活牛密集贸易的情况下，CBPP随隐性带菌动物重新引入的风险日益增加^[13]。在西欧，尽管根除该病付出了昂贵的代价，但该病在20世纪几乎每十年都会再次出现，表明CBPP具有持续的威胁^[14]。

CBPP诊断是以流行病学、病理解剖、病原学、血清学等多方面综合分析的结果作为依据。其中病原体分离培养耗时较长，且样品易被污染导致分离比较困难^[15]。我国是CBPP无疫国家，不存在自然感染病例，所以无法依靠流行病学、病理解剖、病原学方法进行检测，对CBPP的检测主要以畜群水平的血清学检测为主。曾报道的血清学诊断方法主要有补体结合试验(CFT)、cELISA和基于LppQ的ELISA方法。后两种ELISA方法联合CFT显示出64%~70%的诊断敏感性和98%的诊断特异性。而对于单个动物水平的疾病诊断，诊断的敏感性仍需改进，为了实现这个目标，仍需鉴定新的诊断抗原^[16]。OIE推荐CBPP诊断的血清学方法是CFT和cELISA，因单个动物存在假阳性或假阴性的结果，所以仅推荐用于群体水平的诊断^[17-19]。尽管这两种方法在敏感性上相互补充，但他们依然不能提供足够准确的诊断^[14]。

MmSC全基因组序列为基于亚细胞组分的诊断奠定了基础。支原体缺少细胞壁，其表面脂蛋白在支原体诊断和致病机制方面引起了较大的关注，迄今为止，仅一些表面脂蛋白被深入研究。其中研究较为深入的LppQ，是MmmSC特异性的高抗原性脂蛋白，基于该蛋白建立的ELISA方法，表明LppQ适合作为诊断标记^[19]，但未见其后期临床应用的报道。在预测的187个表面蛋白中，或许还有较多抗原比LppQ更能激发抗体介导的免疫反应，而更适合于诊断应用^[20]。

我国目前还未研发出有效的商品化检测试剂盒，为了提高我国CBPP的诊断和监测能力，本研究选取脂蛋白P0308的重组蛋白作为包被抗原，通过一系列条件优化建立了检测CBPP抗体的间接ELISA方法，试验结果表明建立的ELISA方法可以特异地检测CBPP抗体，与牛支原体、牛鼻支原体、无乳支原体、口蹄疫、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎和牛结核分枝杆菌等的阳性血清均不发生交叉反应，特异性良好。通常情况下，动物种属特异性使得感染动物的血清抗体效价差异很大，敏感性高的试剂易于检测到低抗体水平的慢性或隐性感染宿主。本研究建立的方法在CBPP阳性血清经1:1 280倍稀释后，检测仍为阳性，表明该方法的灵敏性较好，在检测抗体水平较低的感染宿主时具有一定优势。此外，建立的方法批内和批间试验的变异系数均小于10%，重复性较好。应用该ELISA方法对1 648份临床样品进行检测，并与OIE推荐的cELISA试剂盒进行比较，符合率达88.7%。由于两种方法不同，试剂盒是基于单抗的竞争ELISA抗体检测试剂盒，其敏感性和特异性优于本研究中基于诊断抗原的间接ELISA，后期我们将继续进行条件优化或联合多种高特异性抗原以提高该方法的检测效能。由于我国是CBPP无疫国家，缺少CBPP自然感染病例各个时期的血清样本，所以无法测定建立的方法在疾病不同时期的检测能力。我们将依据与非洲开展的合作项目收集非洲地区CBPP自然感染的血清样品，确定我们建立的ELISA方法对CBPP感染不同时期抗体产生的检测能力。

4 结论

选取CBPP分离株的脂蛋白P0308重组蛋白作为包被抗原建立CBPP抗体检测间接ELISA方法，该方法能特异性区分CBPP与其他牛呼吸道病原体阳性血清，敏感性、特异性、稳定性均良好，具有一定的应用价值，为进一步研发CBPP检测试剂盒奠定基础。