2. 江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室, 南京 210014
2. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)是感染牛的重要病原之一，能引起牛病毒性腹泻/黏膜病，给养牛业造成巨大的经济损失[1-2]。BVDV主要感染宿主的免疫细胞，引起宿主体内白细胞数量减少，产生免疫抑制，引起发热、腹泻、黏膜糜烂、繁殖障碍等症状[3-4]。除感染牛外，BVDV还能感染绵羊、山羊、猪、水牛及各种野生动物。Deregt等[5]已证实BVDV可在绵羊和牛之间跨种群传播，也有从麋鹿等野生反刍动物中分离到BVDV的报道[6]。
BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，是一种有囊膜的单股RNA病毒，基因组全长为12.3 kb左右，由5′非编码区(5′UTR)、3′非编码区(3′UTR)编码4种结构蛋白(C、E0、E1、E2)和7种非结构蛋白(Npro、P7、NS2/3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的开放阅读框构成[7-8]。BVDV自1946年由Olafson等首次报道以来，已在世界范围内广泛流行。我国于1980年在长春首次分离到BVDV-长春184V株[9]，随后该病在国内多地暴发。根据BVDV基因组5′UTR差异，可将其分为3种基因型(genotype)，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3(Hobi样瘟病毒)。目前，BVDV-1已鉴定出至少22个基因亚型(1a~1v)，BVDV-2则分为4个亚型(2a~2d)，其中BVDV-1感染极为常见[10]。BVDV-2是20世纪80年代末在北美暴发的急性牛病毒性腹泻病时首次分离鉴定[11]。此后，在巴西、法国、德国、日本、比利时等地也相继报道了BVDV-2型毒株[12-13]。虽然我国于2009年首次分离到BVDV-2型毒株SD-06，并将其归为2a亚型[14]。但总体而言，BVDV-2在国内的报道较少。除基因组差异外，BVDV-2的致病力明显强于BVDV-1，通常引起严重的急性感染和出血综合征[15]。BVDV-3是近年来发现的一种感染牛的新的瘟病毒，与BVDV-1和BVDV-2一样，能导致呼吸道疾病、生殖障碍及持续性感染等[16-18]。此外，根据BVDV能否引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)，可将其分为致细胞病变(CP)和非致细胞病变(NCP)两种生物型。由此可见，BVDV不仅宿主范围广泛，而且具有遗传多样性，这对该病毒的鉴定与控制提出了很大的挑战。
随着养殖业集约化水平的不断提高和BVDV宿主谱的不断扩大，BVDV感染也越发普遍。而且，BVDV易通过牛血清污染各种生物制品，更加剧了该病毒的传播。Laassri等[19]采用PCR对17份不同厂家的FBS、4份马血清和2份牛胰蛋白酶进行了BVDV检测，结果所有FBS和1份牛源胰蛋白酶均呈阳性，并且均为BVDV-1型。在阿根廷，研究人员用PCR进行BVDV检测，发现20批次商品血清中只有2批含有BVDV，但使用高浓度血清培养细胞至少2周后，间接免疫荧光法检测病毒抗原，BVDV检出率则高达80%，表明大多数商用FBS都含有BVDV[20]。国内已有因使用犊牛血清而导致疫苗污染BVDV的报道[21]。本实验室在用南美进口的胎牛血清培养MDBK细胞的过程中，发现未接种任何病原的细胞出现了明显的细胞病变，而用同一血清培养的人结肠癌(LoVo)细胞则未出现任何病变，怀疑可能是血清污染的BVDV所致。本研究经一系列试验，从该进口血清中鉴定出一株CP型BVDV-2a亚型(GS2018株)。基因组序列比对分析发现，GS2018株的NS2/3区与NCP型BVDV-2相似，均无外源序列插入，说明BVDV CP型与NCP型的转换并非简单的NS2/3区序列的插入，可能涉及复杂的分子机制，需要进一步深入研究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞、主要试剂MDBK细胞购自中国兽医药品监察所；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)来自进口产品；DMEM/High Glucose培养基及0.25%的胰蛋白酶(trypsin)购自Gibco公司；RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒、LA Tag酶均购自宝生物工程有限公司；鼠源BVDV-2单克隆抗体购自AHVLA公司；FITC标记的山羊抗鼠IgG购自美国Sigma公司。
1.1.2 主要仪器CO2恒温培养箱(Thermo)、PCR仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、电泳仪(Bio-Rad)、超速离心机(Beckman)、透射电镜(Hitachi)、倒置荧光显微镜(Leica)等。
1.2 方法 1.2.1 病毒分离培养取疑似BVDV污染的FBS和另一来源FBS分别用于MDBK细胞的培养，2~3 d后观察细胞是否出现CPE。将出现CPE的细胞培养物反复冻融3次，于4 ℃ 10 000×g离心30 min，取上清液，用0.22 μm的滤膜过滤，于-80 ℃保存备用。
1.2.2 病毒噬斑纯化将收集的病毒液10倍倍比稀释，接种12孔MDBK单层细胞，37 ℃吸附2 h后，弃病毒液，每孔加入1 mL 40~50 ℃的低熔点琼脂糖与培养液的混合物进行培养，待细胞出现明显的病变后，用10%甲醛固定1 h，加入结晶紫染色。挑取单个噬斑，置于无血清培养液中，反复冻融后接种细胞，至细胞病变完全时收集病毒液，测定病毒滴度。
1.2.3 病毒含量测定将纯化的病毒液10倍倍比稀释后，100 μL·孔-1接种于MDBK细胞单层的96孔培养板中，每个稀释度设8个复孔，同时设阴性对照组，37 ℃吸附2 h，弃病毒液，PBS洗涤后加入维持液。逐日观察，记录每个稀释度出现病变的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
1.2.4 病毒的形态观察收集的病毒液于4 ℃ 150 000 × g超速离心3 h，弃上清，用100 μL PBS悬浮沉淀，吸取10 μL悬液滴于电镜铜网上，室温吸附10 min。用3 μL 2%的磷钨酸钠溶液负染90 s，于透射电镜下观察。
1.2.5 间接免疫荧光试验将MDBK细胞接种于24孔培养板中，待细胞铺满70%~80%孔时，每孔接种上述制备的病毒液20 μL，培养48 h后，吸弃培养液，加PBS洗涤3次后，用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，1%的BSA室温封闭30 min，加入1:500倍稀释的鼠源BVDV单克隆抗体(抗NS2/3和E2)，4 ℃孵育过夜，用PBS洗涤后再加入1:500倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤后置荧光显微镜下观察。
1.2.6 病毒的分子鉴定分别提取试验组和对照组细胞培养物的总RNA，用瘟病毒5′UTR通用引物(324F: 5′-CATGCCCATAGTAGGAC-3′，326R: 5′-CCATGTGCCATGTACAG-3′)进行RT-PCR扩增[22]。反应体系: E-Mix 0.5 μL，2 × R-Mix buffer 10 μL，引物各0.5 μL，RNA 2 μL，DEPC H2O 6.5 μL。反应程序：45 ℃反转录30 min；95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物测序结果与GenBank下载的瘟病毒属3个种典型毒株的基因组5′UTR序列进行比对，并利用MEGA 7.0绘制系统进化树。
1.2.7 病毒基因组测序及分析参照GenBank中BVDV-2(KT832817/USA)序列，设计覆盖基因组全长的7对引物(见表 1)。
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表 1 BVDV-2基因组序列PCR扩增引物 Table 1 The primers for PCR amplification of BVDV-2 genome sequence |
以病毒基因组RNA为模板，用上述7对引物分别进行RT-PCR扩增。利用DNASTAR分析7个片段的测序结果，并进行拼接。分别与BVDV-2参考毒株的5′UTR、Npro及E2基因进行序列比对，并用MEGA 7.0软件构建系统进化树。同时，分析GS2018株与其他参考毒株的NS2/3编码区序列。
2 结果 2.1 BVDV分离与鉴定疑似BVDV污染的FBS接种MDBK细胞24 h后，部分细胞开始脱落、死亡，48 h后细胞大量脱落，呈明显拉网状。而对照组和用同一血清接种的LoVo细胞却未出现任何病变。因此，推测细胞病变可能是由FBS中污染的BVDV引起。病毒接种细胞3 d，结晶紫染色后肉眼可观察到透明、圆形、大小不一的噬斑。第4天病毒滴度达到峰值，其TCID50为1×106.2·0.1 mL-1。
电镜观察发现，病毒接种细胞的培养物中出现圆形、直径50~60 nm有囊膜的病毒粒子，与BVDV病毒粒子形态及大小基本一致(图 1 A)。荧光显微镜下观察病毒接种细胞出现明显的绿色荧光(图 1 B，因未彩印在图中不显示绿色)。RT-PCR扩增出288 bp的5′UTR片段(图 1 C)，经BLASTN比对发现，该序列与BVDV-2型的MS20、XJ-04、NewYork’93株的相似性为90.6%~98.2%，而与BVDV-1型(NADL和Osloss株)、CSFV (Brescia、C/HVRI、HCLV株)及BDV(X818和BD31株)的相似性均低于70%。系统进化树显示(图 1 D)，所测序列与BVDV-2参考毒株处于同一分支，证明分离的病毒为BVDV-2。
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A. BVDV电镜观察(标尺=200 nm)；B.间接免疫荧光鉴定(标尺=200 μm)；C. BVDV 5′UTR的RT-PCR扩增；D. GS2018 5′UTR序列遗传进化分析 A. Electron microscopic observation of BVDV (bar=200 nm); B. Indirect immunofluorescence detection (bar=200 μm); C. Identification of 5′UTR of BVDV by RT-PCR; D. Genetic evolution tree analysis of GS2018 5′UTR sequence 图 1 BVDV分离与鉴定 Fig. 1 Isolation and identification of BVDV |
7段PCR产物测序拼接后，获得全长为12 235 bp的病毒基因组序列(命名为GS2018株，GenBank登录号：MN527354)。基于GS2018株基因组的5′UTR、Npro及E2构建的系统进化树(图 2)均表明，GS2018株属于BVDV-2a亚型，且与美国USMARC-60764株(GenBank登录号：KT832817.1)的亲缘关系最近，二者5′UTR、Npro和E2序列的相似性均在98.0%以上。这一结果与该进口血清的产地相一致。
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图 2 5′UTR (A)、Npro (B)和E2 (C)基因序列系统进化分析 Fig. 2 Evolutionary tree analysis of 5′UTR (A), Npro (B) and E2 (C) |
与CP型和NCP型BVDV-2参考毒株NS2/3编码区氨基酸序列比对结果(图 3)表明，GS2018株的NS2/3区无外源片段插入，而大多数CP型毒株在NS2/3区均有104~131 aa不等的氨基酸序列插入，且插入序列中间部分相对保守。此外，属于CP型BVDV-2毒株的HB1511和XJ-04也没有外源序列插入。GS2018株与NCP型B9497株(USA)基因组序列相似性高达98.15%，在NS2/3区内仅有9个氨基酸差异，但二者却表现完全不同的致细胞病变。说明BVDV致细胞病变与其NS2/3编码区序列差异没有直接关系，可能涉及比较复杂的机制。
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方框内为CP型BVDV-2参考毒株NS2/3区域内插入的氨基酸序列，插入部分最多为53637株(131 aa)，最少为5912株(104 aa) The amino acid sequence inserted in the NS2/3 region of CP type BVDV-2 reference strain is shown in the box, the maximum of inserted part is 131 aa of 53637 strain and the minimum is 104 aa of 5912 strain 图 3 NS2/3区域氨基酸序列比对 Fig. 3 The amino acid sequence alignment in NS2/3 region |
BVD是威胁牛群健康的重要疫病之一，对牛群繁殖力、呼吸和消化系统、产奶量等产生影响，进而影响畜牧业的发展。除危害动物健康以外，BVDV也是导致血清和疫苗等生物制品污染的一个重要病原。由于胎牛或犊牛血清是细胞培养中不可或缺的原料，如果血清被病毒污染，那么利用其通过细胞培养生产的疫苗或生物制品就会受到污染。目前，很多学者已对胎牛血清及细胞中的BVDV污染进行了研究[15, 23-25]。Xia等[26]研究了商品化FBS不同批次可能的瘟病毒污染，用qRT-PCR从10个供应商的33批FBS中均检测出BVDV。王竞晗等[27]采用套式RT-PCR对购买的一批进口FBS进行BVDV检测，鉴定出一株CP型BVDV FBS2014株。一般而言，商品化血清在销售前都应进行严格的病原检测，但由于污染病毒的滴度较低或所用方法的敏感性低，可能出现假阴性的结果。这些血清经适宜的宿主细胞培养传代后病毒的滴度逐渐增加，从而达到可检测的水平或出现细胞病变。Kozasa等[28]对各种FBS样品进行了质量检测，结果在49份FBS中，有28份(57.1%)用PCR检出了瘟病毒属基因，只有2个样本含有BVDV，而用中和试验却检测出了48份BVDV阳性样品。该研究结果说明，FBS中BVDV中和抗体的检测比核酸检测更敏感。本研究从进口血清中分离出BVDV，结合上述相关的文献报道，推测BVDV在血清中的污染可能普遍存在，只是有时病毒的含量低，现有的检测方法难以检出。因此，应引起相关部门、疫苗生产企业及科研人员的高度重视。同时，也提醒检疫部门和血清生产企业提高检测技术的敏感性，严格把控进口生物制品的安全质量监测，以防止国外病原通过血清、疫苗等生物制品输入国内。
目前，我国BVDV-2型的报道很少。本研究从进口FBS中分离的BVDV-2a型毒株，不但能在MDBK细胞中稳定增殖传代，而且表现明显的致细胞病变。大量研究表明，病毒基因组NS2/3编码区发生碱基替换、突变、序列缺失和插入时，可导致BVDV由NCP型转变为CP型[29-31]。Darweesh等[32]从13例患黏膜病死亡的PI犊牛分离的BVDV均属于2a亚型，且所有CP型BVDV均在NS2/3编码区有序列插入。此外，已有多个实验室利用构建的BVDV全长感染性cDNA克隆，阐明了CP型基因组NS2/3编码区的核苷酸序列的插入与其致细胞病变相关，如将插入片段与NCP型BVDV序列中相应部分进行替换或删除NS2/3编码区的插入序列，可导致NCP型BVDV的产生[33-34]。因此，病毒基因组NS2/3编码区是否有插入序列一度作为区分CP型和NCP型BVDV的主要指标。但目前的研究表明，也存在一些毒株没有序列插入但同样可引起细胞病变。本研究将GS2018株的基因组序列与GenBank中其他BVDV-2型参考毒株的NS2/3编码区进行氨基酸序列比对，发现有7株CP型BVDV-2在NS2/3区有104~131 aa不等的氨基酸序列的插入，同时也发现HB1511(GenBank登录号：KX096718.1)株和XJ-04株(GenBank登录号：ACQ83621.1)与本研究分离的毒株具有类似特征，即NS2/3编码区没有序列插入，但仍属于CP型毒株[35]。这说明BVDV-2的致细胞病变机制并非简单的序列插入，可能还与其他因素有关。因此，GS2018株的分离为今后深入研究其致细胞病变的分子机制提供了重要材料。
4 结论从进口FBS中分离出CP型BVDV，推测血清中BVDV的污染可能比较普遍，只是多数情况下病毒拷贝数没有达到可检测水平。基因组序列分析表明，GS2018株属于国内报道较少，而广泛流行于南美洲的BVDV-2a亚型，且与美国USMARC-60764株亲缘关系最近，这与该血清来源相一致。与大多数CP型BVDV-2明显不同的是，GS2018株在NS2/3区域内没有序列插入，且与NCP型B9497株在NS2/3区仅有9个氨基酸的差异，提示BVDV致细胞病变分子机制的复杂性。
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