2. 广州安芮洁环保科技有限公司, 广州 510080
2. Guangzhou AnRuiJie Environmental Protection Technology Co., Ltd., Guangzhou 510080, China
我国蛋白质饲料资源缺口非常严重，据海关数据统计，作为生产蛋白质饲料重要原料的大豆，2017年进口量达9 553万吨，占国内供给总量的86%以上，进口量创历史新高[1]。因此，降低养殖业对传统蛋白质饲料原料—豆粕的过度依赖，开发适宜的蛋白质替代资源迫在眉睫。昆虫作为当前地球上最大的生物类群，被认为是当前最具开发潜力的动物蛋白质饲料资源之一。黑水虻幼虫(Hermetia illucens larvae)即为当前应用最广的一种。
黑水虻是一种腐生性水虻科昆虫，能以畜禽粪便、餐厨垃圾和腐烂果蔬等有机废弃物为食，生成具有生物价值的生物量[2]。黑水虻幼虫和预蛹含有较高的营养价值，其干物质基础中含有粗蛋白35%~44%，粗脂肪15%~49%，必需氨基酸组成与鱼粉接近，并优于豆粕，同时还富含对宿主具有益生作用的抗菌肽和几丁质等物质[3-4]，作为优质的饲料原料已应用于畜禽生产中。栖息在肠道中的微生物在机体的营养物质消化代谢和维系肠道健康方面发挥着重要的作用，日粮是影响其组成的主要因素[5]。目前，关于黑水虻幼虫粉对畜禽肠道微生物菌群和代谢影响方面的研究相对较少，且主要集中在家禽上。用黑水虻幼虫粉完全替代蛋鸡日粮中的豆粕，能显著增加盲肠食糜微生物的多样性和Oscillospira等有益菌的相对丰度[6]；同时改变微生物的代谢活性，增加乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的浓度[6]。本试验前期研究结果也表明，日粮中添加4%的黑水虻幼虫粉可提高育肥猪生长性能，即增加平均日增重并降低F/G[7]，且改变了其血液生化指标[8]以及结肠食糜微生物的组成和代谢[9]。上述结果表明，黑水虻幼虫粉的应用可改变动物肠道微生物的组成和代谢活性。然而，日粮添加不同比例的黑水虻幼虫粉对育肥猪微生物发酵主要部位—盲肠的微生物组成和代谢是否具有影响尚未见相关报道。
本试验旨在探讨日粮中添加不同比例的黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜主要微生物数量和代谢物浓度的影响，为进一步开发黑水虻幼虫粉作为优质蛋白质饲料原料应用于养猪生产提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所使用的黑水虻幼虫粉由广州安芮洁环保科技有限公司提供, 其加工工艺流程参见参考文献[7]。经本实验室分析测定，黑水虻幼虫粉的常规营养成分分别为：干物质(92.2%)、灰分(6.5%)、粗蛋白(35.0%)、粗脂肪(35.5%)、粗纤维(4.3%)、酸性洗涤纤维(6.7%)、中性洗涤纤维(8.7%)、总磷(0.8%)和钙(4.4%)，具体组成参见参考文献[7-9]。
1.2 试验设计与试验日粮本试验是探究黑水虻幼虫粉对育肥猪生长、肉品质、机体代谢以及肠道微生物组成影响中的一部分内容，其试验设计同参考文献[7-9]。即：采取单因素随机区组试验设计，选取72头130日龄、健康且初始体重相近((76.0 ± 0.56) kg)的杜×长×大三元杂交猪，按体重随机分为3组，每组8个重复，每个重复3头猪。试验为期46 d，其中预饲期为4 d，正式试验为42 d。根据NRC(2012)[10]推荐的育肥猪营养需要量配制试验日粮，其中对照组饲喂基础日粮，试验组分别饲喂含有4%和8%黑水虻幼虫粉的试验日粮。通过调整日粮配方，3组日粮的粗蛋白、代谢能以及4种主要必需氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸)的含量基本一致，具体的试验日粮组成及营养成分如表 1所示。
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表 1 日粮组成与营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (as-fed basis) |
所有试验猪均饲养在同一猪舍内，饲养管理条件一致。试验期间，所有猪均自由采食和饮水，每天观察猪的健康状况并清扫圈舍。饲养结束当天(正式试验第46天)所有猪禁食12 h后，从每栏内选取1头体重接近平均值的猪(每个处理组8头猪，共24头猪)，经电击后进行放血屠宰，迅速分离出盲肠，收集所有盲肠食糜混匀，取10 g左右样品保存于-80 ℃冰箱，用于后续微生物和细菌代谢产物分析。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 盲肠食糜细菌代谢产物分析 1.4.1.1 乳酸含量的测定盲肠食糜中乳酸含量按照说明书使用酶标仪进行测定，所使用的试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.4.1.2 短链脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)含量的测定参照Yu等[11]的方法，准确称取0.4 g盲肠食糜于2 mL离心管中，加入1.6 mL双蒸水，充分涡旋混匀后3 000 g离心10 min，吸取上清液1.0 mL于新的离心管中，再加入200 μL 25%偏磷酸巴豆酸，涡旋混匀后放入-20 ℃中静置过夜，然后12 000 g离心10 min，取上清经0.22 μm微孔滤膜过滤至新离心管，加入两倍体积的乙醚萃取，之后采用安捷伦7890B气相色谱配备毛细吸管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)进行测定，柱温150 ℃，气化温度220 ℃，检测温度180 ℃。短链脂肪酸的浓度利用外标法通过标准曲线计算得出。
1.4.1.3 氨态氮(NH3-N)含量的测定参照Chaney和Marbach的方法[12]，称取0.2 g盲肠食糜样品，以氯化铵作为标准品，采用比色法测定氨态氮的含量。
1.4.1.4 生物胺含量的测定生物胺的测定按照Yang等[13]的方法。在2 mL离心管中称取0.5 g盲肠食糜，加入1 mL 5%的三氯乙酸溶液，涡旋混匀10 min后3 000 g离心10 min，使蛋白质和肽沉淀下来。吸取上清液加入等量的正己烷，剧烈震荡后取下层溶液0.5 mL于新的10 mL离心管中，加入1.5 mL饱和碳酸氢钠溶液，1 mL丹磺酰氯衍生溶液(1 g·100 mL-1丙酮)和1 mL 2 mmol·L-1的氢氧化钠溶液。经涡旋充分混匀后，置于60 ℃水浴中反应45 min，期间轻轻震荡几次。水浴结束后，加入100 μL 2.8%的氨水溶液终止反应。之后，溶液在40 ℃水溶下持续通入氮气吹干丙酮。加入3 mL乙醚，充分涡旋混匀后，吸取上清有机相至新离心管，重复1次后合并上清，氮气吹干后加入乙腈重新溶解，用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液准备进样检测。使用Waters Alliance高效液相色谱系统(e2695)进行测定，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL·min-1。各生物胺的浓度采用外标法通过标准曲线计算得出。
1.4.1.5 酚和吲哚类物质含量的测定盲肠食糜酚和吲哚类物质含量的测定参照Yu等[9]的方法。称取0.1 g盲肠食糜样品，加入1.0 mL乙腈经涡旋混匀，-20 ℃静置20 min。然后在4 ℃ 3 000 g离心10 min。吸取上清有机相经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行上机检测。使用Waters Alliance高效液相色谱系统(e2695)配备Zorbax Extend-C18分离柱(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)进行测定，荧光激发波长为280 nm，发射波长为360 nm，柱温设置为30 ℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL·min-1，洗脱程序剂为超纯水(A)和乙腈(B)，洗脱程序为82% A 0 min，55% A 12 min，10% A 22 min，100% B 23 min。酚和吲哚类物质浓度利用外标法通过标准曲线计算得出。
1.4.2 盲肠食糜细菌DNA提取和荧光定量PCR检测采用MOBIO试剂盒提取盲肠食糜总DNA(Qiagen，德国)，具体操作步骤参照试剂盒说明书。提取的DNA采用核酸蛋白检测仪Nanodrop 1100(Thermo Fisher Scientific，Madison，Wisconsin，USA)检测其浓度和质量，检验样品合格的标准为：OD260nm/OD280nm为1.80~2.00，OD260nm/OD230nm在2.00左右。
采用Bio-Rad CFX Connect系统对盲肠食糜中主要的微生物，如总菌、Firmicutes、Bacteroidetes、Escherichia coli、Lactobacillus、Bifidobacterium、Clostridium cluster Ⅳ、Clostridium cluster XIV、Ruminococcus、Prevotella和Roseburia的16S rRNA基因拷贝数进行定量分析，所用引物见表 2。使用10倍梯度稀释的标准质粒作为模板建立标准曲线，每个样品3个重复。PCR采用20 μL的反应体系：10 μL的TB GreenTM Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大连)，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，灭菌的超纯水7.2 μL。PCR的扩增程序为：95 ℃预变性5 min；其后为40个循环：95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s。数据表示为每克盲肠食糜中16S rRNA基因的拷贝数。
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表 2 细菌PCR所用引物 Table 2 Primers for PCR used in this study |
试验数据先用Excel 2016进行初步整理后，采用SPSS 20.0软件包中的One-Way ANOVA模块进行单因素方差分析，差异显著者再用Tukey进行多重比较。所有数据均表示为“平均值±标准误”，P < 0.01表示差异极显著，P < 0.05表示差异显著。采用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software，USA)对盲肠有差异的微生物数量和代谢产物浓度进行Pearson相关性分析，当Pearson的绝对相关系数大于0.5，且P < 0.05时，认为二者存在相关性。偏最小二乘分类分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)是多元分类方法中使用较为广泛的一种分析方法，为了分别评估不同处理组间微生物组成以及代谢物的相似性，本试验分别将微生物数量和代谢物浓度(SCFA、乳酸、氨态氮、生物胺、酚和吲哚类物质)导入SIMCA-P 13.0 (Umetrics, Umeå, Sweden)中采用PLS-DA模型进行分析。
2 结果 2.1 日粮添加黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜主要微生物数量的影响由图 1可知，日粮不同处理对盲肠食糜中微生物总数以及两个主要细菌门(Firmicutes和Bacteroidetes)的数量无显著影响(P>0.05)。在属水平上，与对照组相比，日粮添加4%和8%的黑水虻幼虫粉显著增加了盲肠食糜中Prevotella和Bifidobacterium的数量(P < 0.05)，而4%和8%组间上述菌的数量差异不显著(P>0.05)。同时，4%黑水虻幼虫粉组Lactobacillus、Clostridium cluster Ⅳ和Roseburia的数量显著高于对照组(P < 0.05)，而8%黑水虻幼虫粉组上述细菌的数量与对照组和4%组相比差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，日粮添加4%的黑水虻幼虫粉显著降低了E. coli的数量(P < 0.05)，而8%黑水虻幼虫粉组的E. coli数量与对照组和4%黑水虻组差异不显著(P>0.05)。此外，Ruminococcus和Clostridium cluster XIV的数量在各处理组间差异不显著(P>0.05)。
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试验结果均表示为“平均值±标准误”，每组重复数为8。*.P < 0.05。下同 Values are expressed as "means ± SEM", n = 8. *. P < 0.05. The same as below 图 1 黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜主要微生物数量的影响 Fig. 1 Effects of the dietary with Hermetia illucens larvae meal on the number of major bacterial taxonomic groups in the cecal digesta of finishing pigs |
由图 2A可知，与对照组相比，日粮添加4%和8%的黑水虻幼虫粉显著增加了盲肠食糜中乳酸的浓度(P < 0.05)，而4%和8%组间的乳酸浓度差异不显著(P>0.05)。如图 2B所示，与对照组相比，日粮添加4%和8%的黑水虻幼虫粉显著增加了盲肠食糜中总短链脂肪酸和乙酸的浓度(P < 0.05)，而4%和8%组间的上述代谢物浓度差异不显著(P>0.05)。同时，与对照组相比，日粮中添加8%的黑水虻幼虫粉显著降低了戊酸的浓度(P < 0.05)，而添加4%黑水虻幼虫粉组的戊酸浓度与对照组和8%黑水虻幼虫粉组相比，差异不显著(P>0.05)。此外，不同日粮处理对盲肠食糜中丙酸、丁酸、支链脂肪酸、异丁酸和异戊酸的浓度无显著影响(P>0.05)。
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图 2 黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜乳酸(A)和短链脂肪酸(B)浓度的影响 Fig. 2 Effects of the dietary with Hermetia illucens larvae meal on the concentrations of lactate (A) and short-chain fatty acids (B) in the cecal digesta of finishing pigs |
日粮添加不同比例黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜主要微生物氮代谢产物浓度的影响如图 3所示。由图 3A可知，不同日粮处理对盲肠食糜中氨态氮的浓度无显著影响(P>0.05)。对于酚和吲哚类物质而言(图 3B)，与对照组相比，日粮添加4%的黑水虻幼虫粉显著降低了盲肠食糜中对甲酚的浓度(P < 0.05)，而8%黑水虻幼虫粉组的对甲酚浓度与对照组和4%组相比，差异不显著(P>0.05)。同时，与对照组相比，日粮添加4%和8%黑水虻幼虫粉显著降低了苯酚的浓度(P < 0.05)。此外，不同日粮处理对育肥猪盲肠食糜中吲哚和粪臭素的浓度无显著影响(P>0.05)。
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图 3 黑水虻幼虫粉对育肥猪盲肠食糜氮代谢产物浓度的影响 Fig. 3 Effects of the dietary with Hermetia illucens larvae meal on the concentrations of nitrogen metabolites in the cecal digesta of finishing pigs |
对于生物胺而言(图 3C)，不同日粮处理显著影响了盲肠食糜中总生物胺、尸胺、腐胺和精胺的浓度。与对照组相比，日粮添加4%的黑水虻幼虫粉显著降低了食糜中总生物胺、尸胺、腐胺和精胺的浓度(P < 0.05)，添加8%黑水虻幼虫粉显著降低了尸胺的浓度(P < 0.05)；而8%黑水虻幼虫粉组的总生物胺、腐胺和精胺的浓度与对照组和4%组相比，差异不显著(P>0.05)。此外，不同日粮处理对盲肠食糜中色胺、甲胺、酪胺和亚精胺的浓度无显著影响(P>0.05)。
2.4 盲肠食糜中微生物数量和代谢物浓度的PLS-DA和相关性分析为了直观显示盲肠食糜微生物菌群和代谢产物的组间差异，本试验采用SIMCA-P 13.0中的PLS-DA方法进行多元变量分析。如图 4所示，PLS-DA建立的多元分析模型能将各处理组间的微生物(图 4A)和代谢产物(图 4B)明显区分开，表明日粮添加黑水虻幼虫粉改变了盲肠微生物数量和代谢产物的组成。
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图 4 育肥猪盲肠食糜所有细菌(A)和代谢物(B)PLS-DA得分图 Fig. 4 PLS-DA score plots of bacteria(A) and metabolites(B) in cecal digesta of finishing pigs |
如表 3所示，Bifidobacterium的数量与总短链脂肪酸、乙酸和乳酸的含量显著正相关(P < 0.05)，与腐胺、尸胺、精胺、对甲酚和苯酚的含量显著负相关(P < 0.05)；Lactobacillus的数量与总短链脂肪酸和乳酸的含量显著正相关(P < 0.05)，与腐胺、精胺、对甲酚的含量显著负相关(P < 0.05)；Clostridium cluster Ⅳ的数量与总短链脂肪酸和乙酸的含量显著正相关(P < 0.05)，与尸胺和精胺的含量显著负相关(P < 0.05)；Prevotella的数量与乙酸的含量显著正相关(P < 0.05)，与尸胺、精胺和对甲酚的含量呈显著负相关(P < 0.05)；Roseburia的数量与腐胺、对甲酚和苯酚的含量显著负相关(P < 0.05)；E. coli的数量与腐胺、尸胺、对甲酚的含量显著正相关(P < 0.05)，与总短链脂肪酸、乙酸和乳酸含量显著负相关(P < 0.05)。
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表 3 盲肠食糜中主要微生物数量和代谢产物浓度的相关性 Table 3 Correlation between the number of main bacteria and metabolites concentrations in cecal digesta |
日粮结构是影响肠道微生物组成和功能的主要因素之一。通过q-PCR检测，本研究发现，日粮添加4%黑水虻幼虫粉显著改变了育肥猪盲肠食糜微生物的组成，表现为增加了对机体代谢和免疫稳定有益的肠道有益菌(Lactobacillus、Prevotella、Bifidobacterium、Clostridium cluster Ⅳ和Roseburia)的数量，而降低了条件性致病菌(E. coli)的数量，这与前期在育肥猪结肠中的研究结果一致[9]。此外，在肉鸡上的研究也发现，黑水虻幼虫粉可增加其盲肠食糜中Prevotella和Lactobacillus spp的数量[24]。Bifidobacterium和Lactobacillus是存在于宿主肠道内的有益微生物，能与病原菌竞争与肠上皮结合位点的结合以及生长所需的营养物质来防止病原体的感染和定植，并可产生一些抗菌因子，如细菌素和乳酸，从而促进肠道健康和维护其功能的完善[25]。Prevotella、Clostridium cluster Ⅳ和Roseburia是肠道中主要的短链脂肪酸产生菌，可通过促进肠道上皮细胞能量代谢和调节肠道黏膜免疫系统的发育来维持肠道内环境的稳态[26]。E. coli是公认的与结肠炎或者克罗恩病有关的条件性致病菌。有研究指出，克罗恩病人粪样中E. coli丰度显著增加[27]。因此，本试验中产乳酸菌和产短链脂肪酸菌数量的增加，以及潜在致病菌数量的降低，表明黑水虻幼虫粉的添加维系了肠道菌群的稳态并对肠道健康具有益生作用。
到目前为止，黑水虻幼虫粉调控肠道微生物区系的具体作用机制还不清楚。黑水虻幼虫粉中含有大量的几丁质(本试验中黑水虻幼虫粉所含的几丁质为4.65%，见参考文献[7-9])，其在前肠不易被宿主消化吸收，到达后肠可作为基底物质被微生物利用，进而调控肠道微生物的组成。前人研究表明，低浓度的几丁质可重塑人[28]和小鼠[29]肠道微生物的稳态。同时，黑水虻幼虫粉富含中链脂肪酸—月桂酸(C12:0，本试验中月桂酸的含量为总脂肪酸的28%[7])，是一种天然的抗菌剂，尤其是对革兰阳性菌[30]。此外，黑水虻幼虫粉还含有诸多功能性成分，如抗菌肽等，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有杀灭作用[31]。因此，本试验中黑水虻幼虫粉维持育肥猪盲肠微生物稳态可能是通过其所含有的几丁质、月桂酸和/或抗菌肽而起作用，但其具体作用机制还有待进一步研究。
3.2 添加黑水虻幼虫粉促进微生物对碳水化合物的代谢肠道微生物菌群结构或数量的改变常伴随着其代谢产物的改变。在胃和小肠未被消化的碳水化合物进入大肠后可被微生物发酵生成乳酸和短链脂肪酸。本研究结果发现，日粮添加4%和8%黑水虻幼虫粉显著增加了盲肠食糜中乳酸、总短链脂肪酸和乙酸的浓度，在蛋鸡上的研究也发现，黑水虻幼虫粉替代日粮中的部分豆粕增加了其盲肠食糜中乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的浓度[6]。这些研究结果表明，黑水虻幼虫粉的使用显著提高了微生物对碳水化合物的代谢。乳酸和短链脂肪酸浓度的变化与肠道中产乳酸和短链脂肪酸的细菌数量或丰度的变化息息相关[32]。如前所述，黑水虻幼虫粉使用后增加了盲肠食糜中主要产乳酸细菌—Bifidobacterium和Lactobacillus以及产短链脂肪酸菌—Prevotella、Clostridium cluster Ⅳ和Roseburia的数量，相关性分析结果也表明，乳酸和乙酸与这些细菌存在显著的正相关关系。因此，本试验中，肠道中产乳酸和短链脂肪酸这些细菌数量的增加可能是导致乳酸和短链脂肪酸浓度升高的原因之一。此外，黑水虻幼虫粉含有大量的几丁质物质，其在前肠不易被宿主和微生物所分泌的酶消化，进而到达后肠作为碳源被微生物发酵产生短链脂肪酸等物质[3]。因此，本试验中，乳酸和短链脂肪酸浓度增加的另一原因可能是由于黑水虻幼虫粉含有大量的几丁质物质。研究表明，乳酸和短链脂肪酸可降低肠道内的pH，减少对pH敏感的致病菌过度增殖，进而维持宿主肠道健康[33]。此外，乙酸不仅是外周组织能量利用的基底物质，同时具有抗炎的功能，在调节肠道免疫耐受方面发挥重要作用[34]。因此，日粮添加黑水虻幼虫粉增加乳酸和乙酸浓度可能有利于维持肠道健康和机体能量的利用。
3.3 日粮添加黑水虻幼虫粉降低了微生物对含氮化合物的代谢本研究还发现，日粮添加黑水虻幼虫粉(尤其是4%水平)显著降低了微生物对含氮化合物的分解代谢，如降低了盲肠食糜中总生物胺、腐胺、尸胺和精胺的浓度，表明黑水虻幼虫粉的添加降低了微生物对前体氨基酸—如鸟氨酸和赖氨酸等的脱羧反应。高浓度的尸胺和腐胺具有遗传毒性，能引起DNA损伤和氧化应激，从而增加肿瘤发生的风险[35]。此外，黑水虻幼虫粉还显著降低了盲肠食糜中苯酚和对甲酚浓度，表明微生物降低了对酪氨酸的分解代谢。高浓度的酚和吲哚类物质具有遗传毒性、诱变性和致癌性，不利于肠道健康[35-36]。因此，本试验中，对甲酚和苯酚等酚类物质浓度的降低进一步表明，黑水虻幼虫粉的添加有利于维系育肥猪的肠道健康。E. coli等肠道细菌具有代谢含氮化合物产生生物胺和酚类物质的能力[35]。本试验相关性分析结果也表明，盲肠食糜中生物胺和酚类等氮代谢产物的含量与E. coli的数量呈显著正相关。因此，本试验中，生物胺和酚类物质浓度的降低可能是由于黑水虻幼虫粉降低了食糜中蛋白降解菌—E. coli的数量，但具体的作用机制还有待进一步研究。
4 结论本研究表明，日粮添加4%黑水虻幼虫粉改变了育肥猪盲肠食糜中微生物的组成和代谢活性。增加了有益微生物(Bifidobacterium、Lactobacillus、Prevotella、Clostridium cluster Ⅳ和Roseburia)数量和有益代谢物(乙酸和乳酸)的浓度，降低了潜在致病菌E.coli的数量和含氮化合物(生物胺和酚类物质)的浓度。这些结果表明，在日粮中添加适宜的黑水虻幼虫粉替代部分豆粕是可行的，可作为优质蛋白质饲料原料应用于养猪生产。
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