2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用国家教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China
牦牛(Bos grunniens)是牛属动物中对低氧环境具有较强适应能力的动物之一，有“高原之舟”之称[1]。但牦牛性成熟晚，繁殖性能低下，已成为阻碍牦牛产业及高原人民经济发展的主要因素之一。因此，牦牛通过与其他牛杂交，获得具有显著杂种优势的犏牛，可显著提高其生产性能。但杂交改良产生的犏牛雄性不育成为杂种优势利用的阻碍。为此，针对牦牛和犏牛的繁殖性能进行相关研究可进一步丰富我国遗传资源多样性[2-3]。
精子发生与成熟是影响哺乳动物繁殖效率的因素之一。而精子发生是一个依赖于各种复杂因素而精细调控的细胞分化过程，在睾丸曲细精管中，雄性生殖细胞经历一系列分化步骤及形态变化形成成熟的雄性配子[4]。整个生精进程包括染色质重排、细胞质消除、顶体形成和鞭毛发育[5]。此过程受具有不同细胞和时间特异性相关基因协调表达的调控[6-7]，如果基因出现表达异常，则会发生生精障碍[8-9]。精子发生蛋白3(spermatogenesis associated 3，SPATA3)是一个新发现的睾丸组织特异性表达基因，最新研究发现，SPATA3是不育患者睾丸中最显著下调的基因[10]，临床诊断中可作为人类非梗阻性男性不育症的潜在分子标志[11]。SPATA3又称为小鼠睾丸与生精细胞凋亡相关基因1(mouse testis and spermatogenesis cell apoptosis related gene 1，Mtsarg1)。Yang等[12]克隆了大鼠新型Tsarg1基因，推测该基因与精子发生过程中生精细胞的凋亡密切相关。自发性或诱发性的凋亡现象广泛存在于精子发生的各个阶段，进而维持精子发生过程的动态平衡[13-14]。SPATA3是精子发生相关蛋白SPATA家族的成员之一。功能研究表明，该家族基因特异表达定位于睾丸组织中，在肿瘤发生[15]和雄性生殖发育过程[16]中均起着重要的作用。如SPATA3通过细胞凋亡[17-19]和细胞自噬[20]等机制参与调控相关蛋白的表达来介导精子发生。
目前，对SPATA3基因的研究主要集中在人和小鼠上，在牦牛与犏牛上的研究尚未见报道。为阐明SPATA3基因在牦牛及犏牛精子发生过程中的作用，本研究利用RT-PCR技术克隆获得牦牛SPATA3序列，同时，通过生物信息学分析SPATA3序列。应用RT-qPCR和免疫组化方法检测SPATA3在牦牛各组织和及在牦牛和犏牛睾丸发育过程中的表达规律，以期为进一步从分子水平解析SPATA3在牦牛生殖繁育及犏牛雄性不育中的调控作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器Trizol Reagent(Invitrogen，美国)；Premix TaqTM DNA聚合酶、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、pMDTM19-T载体、PrimeScriptTM RT Reagent Kit反转录试剂盒(TaKaRa，大连)；DNA marker、DEPC和感受态细胞DH5α(天根生化科技有限公司，北京)；DNA胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司，吴江)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)。
1.2 样本采集及处理样本均采自四川广汉市盛大食品加工厂，牦牛屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织；随后采集胎牛时期(5~6月)、成年期(4~5岁)的牦牛及犏牛睾丸组织。以上所需样本均采集3头，置于液氮罐中带回实验室，在－80 ℃条件下保存。部分成年期牦牛及犏牛睾丸组织剥离白膜后用4%多聚甲醛固定，运回实验室置于4 ℃备用，以便进行后续研究。
1.3 牦牛各组织总RNA的提取及检测Trizol法从牦牛各个组织样本提取RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，选择OD260 nm/OD280 nm值为1.8~2.0的RNA作为模板，根据PrimeScriptTM RT Reagent Kit反转录试剂盒使用说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。
1.4 目的基因的扩增与克隆根据NCBI中黄牛(Bos taurus)SPATA3基因序列(GenBank登录号：NM_001076480.2)，使用Primer5.0设计PCR扩增引物(表 1)。由金斯瑞生物科技公司合成。PCR反应体系为25 μL：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Premix TaqTM DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃ 5 min。使用浓度为1.5%琼脂糖凝胶进行PCR电泳检测，并将目的条带在紫外光照下小心切下，进行DNA胶回收。在16 ℃的金属浴中将胶回收产物与pMDTM19-T载体连接15 h，之后与感受态细胞混合，并在LB液体培养基中培养1 h后离心。将沉淀菌液均匀涂布到含有0.1%氨苄的LB固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，选取白色单菌落接种于液态LB培养基中，并放入摇床震荡培养8 h后，通过PCR筛选的阳性菌株交由Sangon Biotech公司测序。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
利用NCBI中BLAST在线对比工具检索SPATA3基因的核苷酸序列，通过ORF Finder(ORF)预测其氨基酸序列。通过ExPASy在线软件中的ProtParam、ProtScale、PredictProtein和SWISS_MODEL预测牦牛SPATA3蛋白的基本理化性质、亲疏水性和二级结构。通过Megalign软件进行同源性比对。
1.6 牦牛SPATA3基因组织表达谱分析根据已克隆出的牦牛SPATA3基因序列设计实时荧光定量PCR引物，内参基因扩增引物根据GenBank中黄牛GAPDH基因序列(登录号：AC_000162.1)设计(表 1)，并通过RT-PCR检测该基因在各组织中的表达量。反应体系为10 μL：cDNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Premix TaqTM DNA聚合酶5 μL，ddH2O 3 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃ 5 min。
1.7 RT-qPCR检测SPATA3基因在牦牛及犏牛睾丸发育过程中的表达以GAPDH为内参基因，利用RT-qPCR检测SPATA3在牦牛胎牛时期、成年期及犏牛胎牛时期、成年期睾丸中的表达水平，反应体系为15 μL：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。用2-△△Ct法对定量结果进行均一化处理。
1.8 免疫组化分析SPATA3在成年期牦牛及犏牛睾丸中的定位及表达利用免疫组化染色法检测SPATA3蛋白的定位及表达。将成年牦牛及犏牛睾丸组织从4%的多聚甲醛固定液中取出，制成石蜡切片。脱蜡复水后置0.88 mol·L-1 H2O2中封闭，0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)冲洗3次；5%胎牛血清封闭，滴加一抗(多克隆兔抗SPATA3，BSA 400倍稀释，Bioss公司产品)4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次后滴加二抗(多聚化山羊抗兔IgG，标记物为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)，康为世纪公司产品)37 ℃孵育2 h；PBS冲洗后加入DAB显色，苏木精复染后，脱水、透明、封片，镜下观察。图片利用Image-Pro Plus 6.0进行相对平均光密度分析。
1.9 数据分析每组试验至少重复3次，所有试验数据使用“平均值±标准误(Mean±SEM)”表示。采用SPSS软件进行显著性分析，P < 0.01表示差异极显著，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 牦牛SPATA3基因的克隆以牦牛睾丸组织cDNA为模板，扩增SPATA3基因的CDS区，经琼脂糖凝胶电泳检测，获得含有目的基因741 bp大小的条带(图略)，测序获得其核苷酸序列，通过NCBI在线分析，CDS区为693 bp，共编码230个氨基酸。
利用Megalign软件，将牦牛SPATA3基因与其他物种进行同源性比对，通过比较发现，牦牛SPATA3基因核苷酸序列与其他哺乳动物的相似性达到90%以上。其中与野牦牛、黄牛、水牛、绵羊、羚羊、鹿的相似性分别为96.6%、96.2%、92.6%、91.7%、91.1%、90.6%。同时构建了系统进化树，结果表明，SPATA3基因CDS区核苷酸具有很高的保守性，牦牛与野牦牛SPATA3基因的亲缘关系最近，其次是黄牛、水牛等(图 1)。由此可见，在物种进化过程中SPATA3基因表现相对保守，且其碱基突变也多为同义突变。
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图 1 SPATA3基因核苷酸序列进化树分析 Fig. 1 Nucleotide sequence phylogenetic tree analysis of SPATA3 gene |
通过ExPASy在线工具预测SPATA3蛋白的理化性质。得到该蛋白分子量为24 377.38，分子式为C1029H1666N344O321S12，等电点为11.46，半衰期为30 h，脂肪族系数为39.96，不稳定系数为106.71，推测该蛋白为碱性不稳定蛋白。该蛋白包含20种氨基酸，其中，出现频率较高的有Ser(20.4%)、Pro(16.5%)、Arg(10.4%)和Ala(7.0%)。带正电荷氨基酸(Arg+Lys)有33个，带负电荷氨基酸(Asp+Glu)有7个，由此表明，SPATA3蛋白整体上带正电。亲疏水性分析发现，牦牛SPATA3蛋白在10位点存在最小亲水指数-3.422，在151位点存在最大疏水指数1.489，平均亲水指数为－0.918，为亲水性。Signal P和TMHMM预测发现，SPATA3蛋白为无跨膜结构和信号肽的非分泌蛋白。SPATA3蛋白的二级结构预测结果显示，该蛋白的α-螺旋占5.22%，β-转角占3.04%，延伸链占6.96%，无规卷曲占84.78%。
2.3 牦牛SPATA3基因的组织表达谱利用RT-PCR方法，以内参基因GAPDH作为参照，检测SPATA3基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达(图 2)。结果显示，SPATA3基因仅在睾丸组织中出现特异性扩增条带，而在所测的其他组织均未见其表达，说明SPATA3具有明显的睾丸组织特异性表达特征。
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1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.肾；6.脑；7.小肠；8.卵巢；9.子宫；10.睾丸 1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Lung; 5. Kidney; 6. Brain; 7. Small intestine; 8. Ovary; 9. Uterus; 10. Testis 图 2 牦牛SPATA3基因的组织表达 Fig. 2 Tissue expression of SPATA3 gene in yak |
利用RT-qPCR，以内参基因GAPDH作为参照，检测SPATA3基因在牦牛及犏牛不同发育阶段睾丸中mRNA的表达情况(图 3)。结果显示，在牦牛睾丸发育过程中，该基因的表达水平随睾丸发育的进行呈明显上升趋势，即成年期牦牛睾丸的SPATA3表达水平极显著高于胎牛时期(P < 0.01)。而在犏牛睾丸发育过程中SPATA3基因mRNA表达水平持续低于牦牛睾丸，差异达极显著水平(P < 0.01)。
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**表示差异极显著(P < 0.01)，下同 ** show extremely significant difference (P < 0.01), the same as below 图 3 SPATA3基因在牦牛和犏牛不同发育时期睾丸中的表达 Fig. 3 The expression of SPATA3 in different developmental stages in yak and cattle-yak testis |
由于SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸中表达量有极显著差异，本试验采用免疫组化技术检测SPATA3在成年期牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达情况(图 4)。结果显示，在牦牛和犏牛睾丸中SPATA3均有表达，但该基因的表达水平存在差异。棕黄色或黄色着色判定为阳性细胞，在牦牛睾丸中主要见于长形精子(ES)胞浆、圆形精子(RS)、精母细胞(P)及支持细胞(S)，而精原细胞(SP)、间质细胞(IC)未见阳性信号；而犏牛睾丸曲细精管中精母细胞及支持细胞未见SPATA3阳性着色，在圆形精子和长形精子细胞胞浆中可见表达。以牦牛成年期睾丸为参照，其相对平均光密度约为犏牛的2倍(P < 0.01)。通过RT-qPCR和免疫组化技术分析发现，SPATA3在成年期犏牛睾丸中的表达水平显著低于牦牛。
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A.牦牛睾丸(200×)；B.牦牛睾丸(630×)；C.牦牛睾丸阴性对照(400×)；D.犏牛睾丸(200×)；E.犏牛睾丸(630×)；F.犏牛睾丸阴性对照(400×)；G.相对平均光密度。S.支持细胞；SP.精原细胞；P.初级精母细胞；RS.圆形精子细胞；IC.间质细胞；ES.长形精子细胞 A. Yak testis(200×); B. Yak testis(630×); C. Negative control of yak testis (400×); D. Cattle-yak testis(200×); E. Cattle-yak testis(630×); F. Negative control of cattle-yak testicle (400×); G. Relative average optical density. S. Sertoli cells; SP. Spermatogonium; P. Primary spermatocyte; RS. Round spermatid; IC. Leydig cells; ES. Elongating spermatid 图 4 成年期牦牛和犏牛睾丸中SPATA3的定位及表达 Fig. 4 The expression and localization of SPATA3 in testis of adulthood yak and cattle-yak |
哺乳动物的精子发生包括3个阶段：有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期。已有研究证实，生精细胞凋亡广泛发生在雄性个体精子发生的各个阶段[21-22]。生精细胞凋亡是一个受多种相关基因和蛋白协同调控的复杂过程。与此过程相关的主要有bcl-2家族、caspase-3基因、p53基因、HSP70家族、fas/apo-1基因、CREM基因等[23-27]。研究表明，这些相关基因通过转录激活或抑制，增加生精细胞凋亡和减少精子生成，最终导致雄性不育[28-29]。由此可知，生精细胞凋亡相关基因在精子发生进程中发挥着关键作用。其中，SPATA3作为睾丸组织生精细胞凋亡特异基因同样能调节细胞凋亡及精子成熟。因此，探索SPATA3在牦牛和犏牛睾丸发育过程中的表达规律将对解析其在精子发生过程中的作用及犏牛雄性不育的发病机制奠定基础。
本试验成功克隆了牦牛SPATA3基因cDNA，通过比对分析，得出该序列为牦牛SPATA3基因包含完整CDS区的核苷酸序列。编码区序列与氨基酸序列的比较分析结果显示，在哺乳动物中，SPATA3基因的同源性相对较高，同时发现，牦牛与黄牛、野牦牛的氨基酸序列高度吻合，由此说明，牦牛SPATA3基因在物种进化过程中及蛋白质结构水平上保守性较高。所以，在物种进化过程中，为协调生物体适应其生存环境，其氨基酸序列及其功能保持基本一致。
本试验检测了SPATA3基因在牦牛不同组织中的表达，结果表明，该基因mRNA在牦牛的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢及子宫中均未见表达，仅在睾丸中出现扩增条带。这与文献[30]的结果一致，进一步证实该基因仅在睾丸组织中高表达，具有明显的睾丸组织表达特异性，有研究发现，SPATA3基因在小鼠抗细胞凋亡过程或精母细胞发育中起作用[12]，提示SPATA3可能参与生精细胞的发育过程，但其功能尚不清楚，有待进一步的研究。
本试验采用RT-qPCR的方法检测了SPATA3基因在牦牛和犏牛不同发育阶段睾丸中的表达水平。结果表明，SPATA3 mRNA在牦牛睾丸发育过程中的表达水平随睾丸发育的进行呈明显上升趋势，即其在精子发育后期处于高水平表达。而在犏牛睾丸发育过程中SPATA3基因mRNA表达水平明显持续低于牦牛睾丸。从细胞水平上证实，SPATA3通过参与精子发生后期形态变化从而导致犏牛雄性不育。Malcher等[10]利用cDNA芯片技术证实，无精子症或严重的少精子症患者的精子中SPATA3基因和蛋白表达水平较精子发生正常组显著降低约5.58倍，认为SPATA3基因的低表达与某些雄性不育的发病机制有关。SPATA3也被用作确定男性特发性非梗阻性无精子症生精障碍程度的分子诊断工具[10]。因此，可以推测，在牛精子发生过程中SPATA3基因发挥至关重要的作用，且SPATA3基因在牦牛与犏牛睾丸组织之间mRNA的差异表达可能与犏牛雄性不育有一定关系。
为进一步从蛋白质水平探讨SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中发挥的作用，本研究利用免疫组化检测该基因的定位和表达情况。SPATA3蛋白主要定位在圆形精子、精母细胞和处于变形期间的长形精子细胞内，此结果进一步确定了该基因的特异性表达特征，暗示SPATA3主要与精子细胞发育后期的分化有关。在精子发生过程中最特异的一个细胞分化过程就是精子形成期，在这一时期圆形精子细胞发生一系列的形态学变化，出现细胞核浓缩，顶体及精尾形成等现象。已有研究证实，在精子形成期的胞质中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ广泛表达，且有大量自噬泡形成[31]。此外，自噬相关基因敲除会促使顶体形成发生异常，从而导致精子发生障碍[32-33]。同时，王玉晶等[20]发现，SPATA3可进一步调节bcl-2、bax等靶基因的表达，从而促进细胞自噬。因此，该基因在精子形成期高表达，说明SPATA3可能与此时期精子细胞的凋亡及细胞自噬有关，提示SPATA3可能在精子变形过程中通过调节细胞凋亡和自噬降解和清除精子细胞成形阶段中产生的大量细胞器及蛋白质等成分，以确保精子细胞的正常分化及发育[34-35]。且本研究的免疫组化结果与实时荧光定量结果吻合，即成年期犏牛睾丸中SPATA3的表达水平显著低于牦牛睾丸。由此推测，SPATA3低表达促使精子细胞凋亡及自噬发生异常，从而导致精子形成障碍，可见犏牛SPATA3的下调可能是犏牛雄性不育的原因之一。综上所述，可以推测SPATA3是牦牛和犏牛精子发生过程中起重要作用的功能基因，可作为研究犏牛雄性不育的潜在候选基因，其具体的作用机制还待从基因功能和蛋白水平方面进行研究。
4 结论本研究克隆获得了牦牛SPATA3基因序列，分析表明其生物进化和组织表达均高度保守，参与了牦牛睾丸发育与精子发生过程，且与其在犏牛睾丸组织中表达水平存在显著差异，推测SPATA3参与了精子成熟进程，提示其低表达可能引起精子形成障碍，从而参与精子成熟进程，且与犏牛雄性不育有关，具体的机制还待进一步研究。
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