兔属(Lepus)动物种类繁多，适应力强，分布广泛，在所处生态系统扮演着重要角色，是我国草原、林地和农田等生境的重要构成单元，既是具有开发价值的经济物种[1]，又是珍稀的保护物种[2-3]。但近年来，由于利益的驱使，催生了野生珍稀物种及其制品贸易犯罪链条，其中非法来源的野兔被查获时往往被剥皮和肢解，难以鉴定，不利于这一类违法案件的侦破[4]。
同时，我国兔属动物的分类和系统关系的研究目前还存在着一些争议，新疆野兔亦是如此。1988年出版的《中国野兔》[5]指出，新疆野兔分为3种：雪兔(Lepus timidus)、塔里木兔(Lepus yarkandensis)和草兔(Lepus capensis)，其中草兔分为3个亚种。而在2013年出版的《Mammals of China》[6]中认为，将草兔划分为藏兔(Lepus tibetanus)和托氏兔(Lepus tolai)，并且摒弃原来草兔之称。但在近两年发表的文献却认为藏兔和托氏兔还存在一定物种划分及地理分布的争议[7-8]。因此，对我国新疆兔属动物的分类和分布进行研究十分必要。
2003年Hebert等[9]首次提出了DNA条形码这一概念，即一种利用DNA序列标记技术在系统发育和分类研究基础上的物种鉴定方法。近些年的大量文献也表明，该技术可以系统、准确、快速的鉴定物种[4, 10]，且在动物分类研究领域有着广泛应用[11-12]。但该方法在新疆野兔分类鉴定方面还处于空缺，所以寻找一个可靠的遗传标记作为物种快速鉴定的DNA条形码十分必要。现阶段，国内外关于动物DNA条形码的研究大多以CO1基因为主[13-15]，也有少数使用线粒体其它基因[16-17]，而ITS2等核基因大多在动物药材鉴定中作为辅助序列[18-19]。
本研究选用物种鉴定中4种常用基因作为候选基因序列[20-21]，即CO1、ND4、16S rRNA和ITS2，对比分析各自作为DNA条形码的可靠性，旨在找出最适DNA条形码，为将来扩充样本后研究新疆兔属动物的分类和分布奠定基础，也为今后野生保护动物的鉴定提供一种可靠的技术支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验采集了来自新疆9个不同地区的40例野兔样本，经形态学鉴定[5, 7]，划分为4种：雪兔、托氏兔、藏兔及塔里木兔。由于新疆的雪兔主要分布在寒冷多雪的新疆北部山区且数量稀少，采集十分困难，所以本试验中仅有1例雪兔样本。具体采集地、数量信息及主要形态特征见表 1。
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表 1 试验材料及采集地 Table 1 Experimental material and sampling locations |
Premix TaqTM溶液、1 000 bp DNA Marker由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供；蛋白酶K、EDTA由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；其余试剂由新疆宝信源柏生物技术有限公司提供。PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
Biometra SL96 PCR扩增仪购自德国耶拿公司；SIGMA1-15K高速冷冻离心机购自德国SIGMA公司；DYY-1A电泳仪购自北京六一生物科技公司；Bio-Rad凝胶成像系统购自美国伯乐公司。
1.3 基因组DNA提取取用保存状态较好的野兔腿部肌肉组织，采用苯酚-氯仿法[22]提取总DNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的提取质量。对质量较好的DNA提取产物进行候选DNA片段的PCR扩增。
1.4 PCR扩增及测序采用动物条形码研究中常用的3个线粒体基因CO1、ND4、16S rRNA和1个核基因ITS2作为兔属动物分类的条形码备选基因。参照GenBank上已登录的雪兔(NC_024040)、草兔(NC_015841)、托氏兔(NC_025748)、藏兔(LC_073697)、塔里木兔(MG_279351)线粒体基因组序列，通过软件Oligo v1.756分别设计3对扩增线粒体候选片段的引物序列。核基因ITS2选用《中药DNA条形码分子鉴定》[23]推荐的1对引物ITS3/ ITS4。4对引物(表 2)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 2 备选基因扩增引物序列及反应条件 Table 2 Primer sequences and reaction conditions for amplifying alternative genes |
4个候选片段选用了一致的25 μL扩增体系：Premix Taq(1.25 U·25 μL-1)13 μL，DNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，无菌去离子水9 μL。扩增条件：95 ℃变性3~5 min；25~35次循环：94 ℃变性30 s，退火温度退火30 s，72 ℃延伸60 s；72 ℃延伸10 min。具体引物序列及退火温度等信息见表 2。PCR扩增后，将扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收扩增产物，送至上海生工进行测序。
1.5 数据整理和分析将所测定的候选DNA条形码序列利用MEGA 7.0软件的Clustal功能进行比对与剪切校正，随后计算序列片段长度、GC含量、变异位点数等数据，并利用Kimura-2-parameter遗传距离模型对这4个候选基因片段进行种内、种间遗传距离分析，同时计算种间变异、种间平均θ值、种间最小变异、种内变异、平均θ值和种内最大变异这6个参数，评价种间和种内变异程度[24]。然后计算两两个体间遗传距离，利用个体种间和种内遗传距离分布数据来绘制种间变异和种内变异频率分布图，比较种间变异和种内变异分布之间是否存在空缺。利用软件SPSS 19.0中的威尔克森(Wilcoxon)秩和检验检测每个候选片段的种内和种间变异[25]，评价其在新疆兔属动物中的变异性。最后在MEGA 7.0软件中采用邻接法(Neighbor-Joining method，NJ)以家兔(Oryctolagus cuniculus)(AJ_001588)的对应序列为外群，使用bootstrap检验可信度并且选择1 000次重复构建系统发育树。
2 结果 2.1 新疆野兔候选DNA条形码PCR扩增结果新疆兔属4种候选DNA条形码的PCR扩增部分结果见图 1，ITS2基因序列在多次调整PCR体系和多次重复试验后仍未扩增出条带，其余3种候选基因均扩增得到与预期大小一致的片段。
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M.DNA相对分子质量标准；1~5、6~10、11~15和16~20.分别为候选基因CO1、ND4、16S rRNA和ITS2的扩增产物 M. DL 1000 marker; 1-5. PCR results of CO1; 6-10. PCR results of ND4; 11-15. PCR results of 16S rRNA; 16-20. PCR results of ITS2 图 1 4种候选DNA条形码PCR扩增部分结果电泳图 Fig. 1 The partial electrophoresis results of PCR amplification for 4 candidate DNA barcodes |
扩增及测序成功的3条候选基因经比对和人工剪切校正后，所得到的序列特征信息见表 3。GC含量比例最大的是线粒体CO1基因序列，16S rRNA基因序列次之，ND4基因序列中GC含量比例最小。从变异位点信息来看，CO1和ND4变异位点数较多，16S rRNA的较少。变异率大小依次为：ND4>CO1>16S rRNA。
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表 3 候选DNA条形码序列特征 Table 3 Sequence characteristics of candidate DNA barcodes |
使用Kimura-2-parameter模型，采用以下6个参数来比较不同序列间的种间种内遗传距离(表 4)。综合所有参数分析，表明所有序列均表现出较大的种间变异水平和较小的种内变异水平。从种间变异的前3个参数来看，ND4>CO1>16S rRNA；从种内变异的后3个参数上来看，CO1>ND4>16S rRNA。理论上，理想的DNA条形码种间最小变异要大于种内最大变异。本试验的数据结果表明，CO1和ND4序列的种间最小变异明显大于种内最大变异，而16S rRNA的种间最小变异小于种内最大变异。
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表 4 候选DNA条形码种内、种间变异特征 Table 4 Characteristics of intraspecific and interspecific variation of candidate DNA barcodes |
种间和种内两两序列遗传距离经正态性检验后，P值均小于0.05，不符合正态分布，所以选择非参数检验中的威尔克森秩和检验，检验结果见表 5、表 6。候选基因的种内秩和检验显示，两两差异均达到了显著水平，序列变异水平CO1>ND4>16S rRNA；种间秩和检验同样显示，两两差异达到了显著水平，变异水平ND4>CO1>16S rRNA。
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表 5 候选DNA条形码序列的种内Wilcoxon秩和检验 Table 5 Wilcoxon signed rank test for intraspecific divergence among candidate DNA barcode sequences |
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表 6 候选DNA条形码序列的种间Wilcoxon秩和检验 Table 6 Wilcoxon signed rank test for interspecific divergence among candidate DNA barcode sequences |
gap比较理想状态下，DNA条形码种间变异会明显大于种内变异且两者之间存在一个间隙，即DNA barcoding gap[26]。从3个候选DNA条形码种间和种内的遗传距离频率分布图(图 2~图 4)中可以看出，CO1和ND4序列有明显的gap，而16S rRNA序列存在重叠区。就CO1序列而言，种内遗传距离全部集中在0~0.02，而种间主要在0.05~0.07，gap在0.02~0.05。对于ND4序列，种内遗传距离同样均集中在0~0.02，种间遗传距离主要集中分布在0.08~0.10，gap在0.02~0.08。而16S rRNA序列片段中，种内遗传距离全部分布在0~0.01，种间遗传距离主要集中在0.02~0.04，但在0~0.01存在大于10%的重叠。
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图 2 CO1种间变异和种内变异分布 Fig. 2 Distribution of interspecific and intraspecific variation of CO1 |
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图 3 ND4种间变异和种内变异分布 Fig. 3 Distribution of interspecific and intraspecific variation of ND4 |
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图 4 16S rRNA种间变异和种内变异分布 Fig. 4 Distribution of interspecific and intraspecific variation of 16S rRNA |
候选DNA条形码鉴定成功率也是评价DNA条形码优劣的指标之一，所以本试验利用构建系统聚类树的方法来衡量鉴定成功率。如图 5所示，CO1和ND4系统聚类树显示来自达坂城(DBC)和托克逊(TKX)的藏兔样本聚为一枝，阿勒泰(ALT)的托氏兔聚为一枝，一例雪兔(XT)样本单独处于一枝，来自塔里木盆地周边县市库尔勒(KRL)、阿克苏(AKS)、阿拉尔(ALR)、乌恰(WQ)、阿克陶(AKT)和塔县(TX)的塔里木兔样本聚集为一枝。即，4种野兔各自聚为一枝，呈现单系性，该结果与形态鉴定结果一致，CO1和ND4候选基因均达到了100%成功鉴定的水平。但基于16S rRNA的系统树显示，藏兔和托氏兔的样本聚集为一枝，无法对二者进行准确鉴定。
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图 5 基于CO1、ND4和16S rRNA序列构建的兔属动物NJ树 Fig. 5 NJ tree of hares based on CO1, ND4 and 16S rRNA sequences |
本研究参照以下标准筛选符合要求的遗传标记作为兔属动物最适DNA条形码[25, 27-28]：1)保守的引物设计区；2)相关物种具有广谱性；3)具有良好的扩增效果和测序质量；4)合适的序列长度，一般在300~800 bp；5)同一个体内为纯合序列；6)鉴定准确率高。
本研究结果表明，所选的4个候选遗传标记使用了保守区的通用引物，均达到了合适的序列长度，并且无一例外的存在于所有野兔线粒体基因组和核基因组中。但只有来自线粒体的3个遗传标记PCR扩增结果达到了序列测序的预期要求，ITS2候选序列可能由于核基因本身的特性，导致了PCR的扩增失败，在其他相关哺乳动物研究中也出现了同样的结果[29]。
从序列的基本特征上来看，3条候选序列中CO1和ND4较高的GC含量体现了较好稳定性[30-31]，且明显高于16S rRNA的变异率，在解释物种分类上更具有说服力[32]。序列变异特征的结果和秩和检验的结果进一步证明了二者强于16S rRNA的变异能力，同时它们的种间最小变异参数均明显大于种内最大变异参数。遗传距离频率分布图同样也体现出了CO1和ND4的种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离，有一个明显的空缺区段，即gap，这与理想DNA条形码应该具有“DNA barcoding gap”的要求一致。
最后，将系统发育树的鉴定结果与根据野兔形态特征分类的实际结果进行比较，CO1和ND4的物种鉴定准确率达到了100%，说明二者具有较强的对新疆野兔的鉴定能力。
单独比较CO1与ND4，虽然有着一致的PCR扩增成功率和鉴定准确率，但后者有着更大的种间变异和更小的种内变异参数，在秩和检验中表现出强于CO1的种间变异水平，且遗传距离频率分布图也显示出更宽的gap区段，体现出了ND4略强于CO1的物种种间鉴定能力。
4 结论本试验通过比较PCR扩增及测序结果、序列基本特征数据、变异特征参数、秩和检验结果、遗传频率分布图以及系统发育树的鉴定结果，筛选出了可以作为理想DNA条形码用于新疆兔属动物鉴定的ND4和CO1序列，其中ND4为最优DNA条形码，CO1为候补DNA条形码。本研究将会为新疆野兔的保护乃至生物资源的商业开发带来便利，也可为新疆兔属动物的分类研究提供技术支持。
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