2. 四川农业大学"畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室", 成都 611130;
3. 四川省畜牧总站, 成都 610041;
4. 通江县畜牧站, 通江 636700
2. Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
3. Sichuan Animal Husbandry Station, Chengdu 610041, China;
4. Tongjiang County Animal Husbandry Station, Tongjiang 636700, China
中国是世界上猪品种资源最丰富的国家之一,但近30年来,我国从国外大量引入外种猪,虽然对提高生猪养殖效率、解决猪肉供应紧张起到了积极作用,但也加剧了地方猪品种的减少[1-2]。第二次全国畜禽遗传资源调查显示,中国特有的88个地方猪种里面,有85%左右的地方品种存栏数量急剧下降,其中31个品种处于濒危状态和濒临灭绝[3-4]。近年来,我国越来越重视对地方猪品种的保护和利用。青峪猪属于湖川山地猪中盆周山地猪的一个类群,分布在四川北部山区[5],具有耐粗饲、肥瘦比例适中、肉质鲜嫩多汁、富含雪花肉等特点[6],是一个特色鲜明的山地型地方猪品种。研究青峪猪保种群体的遗传多样性及其群体遗传结构变化情况,对于正确评价和保护这个优秀的遗传资源有着非常重要的意义。
传统的以系谱记录为基础的群体遗传结构分析往往会受到错误记录的影响,难以得出准确的结论。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)作为第三代分子标记,具有数量多、分布广、覆盖密度大和遗传稳定性好等优势[7-8]。目前,已经运用于人、家畜、作物和蔬菜等领域进行群体遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因组学的研究[9-11]。SNP芯片的研发为群体遗传结构分析提供了便利,极大地促进了基于SNP芯片的遗传多样性研究[11-12]。本研究利用50K SNP芯片对纯种青峪猪保种群进行各世代间的群体遗传结构和遗传多样性等分析,为畜禽品种资源的保护和利用提供分子水平上的科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料青峪猪共141个样本,来自巴中市通江县巴山牧业有限公司青峪猪保种场,包括26头公猪,115头母猪。采集的样品均为耳组织,置于装有95%酒精的2 mL离心管中,低温保存。
1.2 试验方法 1.2.1 DNA提取与分型采用氯仿抽提方法来提取DNA,经紫外分光光度仪(NanoDrop 2000)和凝胶电泳对DNA质量进行检测,检测合格后的DNA样本使用“中芯一号”芯片(北京康普森农业科技有限公司,北京)进行SNP基因分型,然后利用Plink(V1.90)软件[13]对基因型数据进行质控,只使用常染色体上的位点,再剔除最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)小于0.05、SNP检出率小于90%的SNP位点。
1.2.2 数据处理与统计分析通过查询系谱档案,在初始群体(F1)的基础上,将现有的141头青峪猪划分为3个世代,分别为F1、F2、F3世代,其中F1世代为67头母猪,F2世代为38头母猪和26头公猪,F3世代为10头母猪。
按照质控标准进行质控,利用Plink(V1.90)软件计算多态性标记比例(PN,MAF>0.05)、SNP位点期望杂合度(He)和观察杂合度(Ho),计算个体间的遗传距离,构建状态同源矩阵(idengtical by state, IBS),以及进行基因组上长纯合片段(runs of hemozygosity, ROH)分析。具体参数:根据连锁不平衡分析去除冗余位点,以50个SNPs为一个窗口,每次步移5个SNPs位点,R2的阈值为0.6。采用Gmatix(V2)软件构建群体G矩阵。利用SNeP(V1.1)软件计算有效群体含量(Ne)。MEGA7.0软件[14]构建邻接法进化发育树(neighbour-joining tree,NJ tree)。最终利用R语言绘图,进行遗传距离和亲缘关系结果的可视化展示。
2 结果 2.1 青峪猪不同世代遗传多样性分析对青峪猪保种群体以及各个世代的遗传多样性的分析结果见表 1。整个保种群体的有效群体含量为12头,随着繁殖世代的增加,有效群体含量呈减少趋势,到F3世代时有效群体含量仅为3头。同时,多态性标记比例也随着繁殖世代的增加不断下降,到F3世代时下降到0.536 7。另外,青峪猪在各个世代以及整个群体的观察杂合度都稍高于期望杂合度,说明青峪猪群体纯度需要提高。
基于IBS的遗传距离分析和基于G矩阵的基因组亲缘关系分析能在不清楚群体系谱或祖代样本的情况下对群体进行分析。结果显示(表 2),青峪猪保种群体的IBS距离值为0.110 5~0.327 8之间,平均遗传距离为(0.260 4±0.025 2),表明青峪猪个体之间的平均遗传距离较远,且差异较大。26头种公猪之间的遗传距离在0.148 1~0.311 1之间,平均遗传距离为(0.263 3±0.023 7),表明种公猪之间的遗传距离均较远。对不同世代群体的遗传距离进行分析表明,F1世代个体间的平均遗传距离最低为(0.256 6±0.026 6),F3世代的遗传距离最远为(0.269 0±0.036 6)。整个群体的IBS距离矩阵和G矩阵亲缘关系的可视化结果如图 1和图 2所示。大部分个体间的亲缘关系呈中等程度,而部分种猪之间的亲缘关系较近,说明该保种群存在较大的潜在近交风险,必须强化选配措施。
由于公猪在保种群体中的重要性,本研究结合G矩阵和IBS距离矩阵对所有26头公猪使用邻接法进行了聚类分析。结果如图 3所示,现有的公猪样本可以分为6个家系。进化树图中用同一种颜色标注的样本被评估为同一个家系,它们在进化树分析中也被分在了第二层或更内层聚类单元中的同一枝上。其中,还存在部分交叉个体。例如,样本73既和家系A中的一些个体亲缘关系较近,又与家系B中的一些个体亲缘关系较近,所以同时被归并到这两个家系中。类似地,样本17010263与家系B和家系C中的一些个体亲缘关系都较近(亲缘关系系数大于等于0.1),所以也同时被划分到了这两个家系中。
根据NJ树和亲缘关系矩阵的结果,结合母猪与不同家系公猪的亲缘关系远近程度,最终将整个保种群内的所有个体分为6个含有公猪的家系(图 4)。在这6个家系以外,还发现有5头母猪和所检测的公猪亲缘关系都比较远(亲缘关系系数小于0.1),故将其另列为另外一个不含公猪的家系。
在141头青峪猪中共检测到1 481个ROH片段,个体ROH的总长度为2.96~606.85 Mb,平均ROH长度为(131.39±121.33) Mb,ROH长度在200 Mb内的个体数量最多,占78.01%(图 5)。青峪猪个体含有的ROH数量为0~33个,平均为(10.50±7.59)个,其中含有0~5个ROH的个体数最多(图 6)。总体来讲,ROH数量与染色体长度呈正相关。通过对群体中各个体的ROH统计,得到每个个体基于ROH的近交系数值。如表 3所示,当前整个保种群体的平均近交系数值为0.055。但是,世代分析结果显示,随着繁殖世代的增加,青峪猪闭锁群体的近交系数也在增加,到F3世代时达到0.075。
有效群体含量(Ne)指的是与实际群体具有相同的基因频率方差或相同近交系数增量(杂合度衰减率)的理想群体含量[15],他是基于群体的连锁不平衡水平估算出来的[16-17]。若一个自然群体的有效群体含量过小,说明这个群体在进化过程中可能很少受到迁移、杂交等,进而使得群体的遗传变异较小[18]。本研究表明,青峪猪从组建基础群(F1世代)开始,已经闭锁繁殖到第3代(F3世代)。目前,整个保种群体的有效群体含量保持在12头的水平,和目前报道的其他中国地方猪种有效群体大小基本一致,明显低于商品猪有效群体大小[19]。随着繁殖世代的增加,群体的有效群体含量呈下降趋势。多态性标记比例是指在目标群体中表现出多态的位点占总位点数的比例。本研究中,青峪猪的单核苷酸多态性低于一些其他地方猪品种如巴马香、金华猪和可乐猪等[11]。受大巴山区经济条件落后等客观因素的影响,青峪猪一度濒临灭绝的边缘。2011年,实施抢救性保护组建了保种群,但存在基础群独立血缘数量偏低的问题,经过3个世代的闭锁繁殖后,青峪猪保种群的总体有效含量和遗传多态性都偏低。这种状况也是当前我国绝大多数畜禽保种场所面临的一大主要难题[20]。为此,需要积极引入新的血缘,特别是公猪血缘。并且,要注意继代繁殖过程中选配方案的科学制定,尤其要防止独立血缘的丢失。
期望杂合度(He)指的是群体中任一个体的任一位点杂合的概率;观察杂合度(Ho)指的是群体中某一位点是杂合子的个体数占总个体数的比例[21]。本研究中,青峪猪保种群的观察杂合度高于期望杂合度,说明群体中可能混杂了其他品种的血缘,需要继续加以纯化。
为了保持种群不受外来品种的影响,我国的畜禽保种群体大多数采用闭锁繁殖的方式。因此,研究保种群体,尤其是多世代混杂群体的遗传距离、亲缘关系和群体遗传结构等对于群体的可持续发展有着重要意义[22]。在育种过程中,通过选择、人工诱变和杂交等手段可以破坏遗传平衡,从而使群体的基因和基因型频率发生改变,群体内的遗传特性也会随之改变[23]。本试验基于SNP芯片数据,对保种群内个体间的遗传距离、亲缘系数等重要遗传信息进行了研究。IBS遗传距离分析显示,整个群体的遗传距离在0.110 5~0.323 7之间,所有公猪的遗传距离在0.148 1~0.311 1之间,而随着世代的增加,遗传距离逐渐增大(3个世代分别为0.256 6、0.263 4、0.269 0)。这一结果与王晨等[24]研究的蓝塘小耳猪群体以及牛荣等[25]研究的版纳小耳猪群体遗传距离的研究结果存在一定的相似性。表明青峪猪保种群在闭锁的继代繁殖过程中承受了一定程度的选择压力,这在一定程度上改变了封闭保种群体的遗传结构。进化树家系构建结果显示,根据公猪聚类分析结果,以及母猪与不同家系公猪亲缘关系的远近程度划分,整个青峪猪保种群由6个不同种公猪家系构成,此外,还有一个不含公共公猪的其它类家系。对目前群体的家系结构分析结果显示,不同家系的公母猪数量和近交程度均不平衡,最小的家系仅含有2头公猪。所以在后续的保种工作中,需要关注各家系种猪的数量,尽量维持一个平衡的家系结构。鉴于公猪对于保种群的重要性,通过SNP芯片鉴定出种公猪的有效血缘后,可用于指导后续世代繁殖过程中的选配计划,并选择性构建不同种公猪家系的冷冻精液库,从而降低遗传资源的保种费用,提高保种效率。
ROH是个体内纯合基因型的连续片段,它是由亲代将同源单倍型完整地传递给子代所产生的。长的ROH可指示发生在较近时期的亲缘关系,这样的片段越多,家系内存在近交的可能性越高。短的ROH则指示发生在较远时期的亲缘关系[26]。Bosse等[27]发现,利用60K SNP芯片可以检测到大于5 Mb的ROH,并且认为分析5 Mb以上的ROH时,其结果与全基因组测序结果一样准确。本试验中,青峪猪最短的ROH长度为5.01 Mb,表明本结果得到的ROH具有较高的准确性。由于我国地方猪种群体规模的限制和相对封闭的运行模式,随着保种时间的延长和世代重叠的加剧,群体内近交系数的上升是必然趋势,使得保种群体内的遗传结构发生巨大的变化[28]。本研究结果也印证了封闭的青峪猪保种群体内近交系数的上升趋势。经过3个世代的闭锁繁育,群体的全群平均近交系数达到了5.5%,各世代群体近交系数则由F1世代的0.039上升到F3世代的0.075。这比吴林慧等[29]报道的恩施黑猪群体的近交系数(0.069±0.06)稍低,但比孙华等[30]研究的湖北白猪群体的近交系数要高约3个百分点,比于国升[31]研究的深县猪的群体平均近交系数(0.93%)也高约4.5个百分点。因此,在今后对于青峪猪的保种过程中,要特别注意控制近交系数的过快增长,实施科学的选配制度,维持青峪猪稳定的遗传结构。
4 结论综上所述,通过对青峪猪分子水平上群体遗传结构的研究,表明青峪猪保种群体在闭锁的继代繁育过程中出现了一定的群体遗传多样性损失,各世代之间的遗传结构也发生了一定程度的改变,需要加强选配或者导入新的血缘等方式来确保青峪猪遗传资源的长期保存以及更好的开发和利用。
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