鸡是长期以来人类广泛食用的肉类动物，由于其自身的代谢特征，可被用作研究人类营养和肥胖的模型[1-2]。而近年来，肉鸡腹部脂肪沉积严重影响其生产性能，降低经济效益[3]。目前，通过胚胎调节来研究脂肪发育和促进胎儿肥胖的机制已成为有效方法[4-6]。禽类脂代谢特征之一是大量甘油三酯输送到肝组织导致肝细胞中大量脂滴沉积[7-9]。研究表明，肉鸡胚胎在发育后期主要利用卵黄中的脂类物质，而肝则具有合成脂肪的功能。但目前关于肉鸡胚胎发育期机体脂肪代谢变化特点的信息尚不完整。
蛋白质组学(proteomics)主要是在特定条件下分析细胞或组织内蛋白质的整体变化水平，从而了解细胞或机体活动规律。因其高通量、准确度和可信度高等优势，已被广泛应用[10-14]。因此，本试验利用基于相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术的蛋白质组学方法探讨胚胎发育中后期肝脏蛋白质变化，从而了解其机体整体动态代谢变化特点，研究结果对于调控脂代谢、降低腹部脂肪沉积具有理论指导意义。
1 材料与方法 1.1 主要仪器设备和试剂主要仪器设备：孵化箱(德州科裕孵化设备有限公司)，组织破碎仪(上海净信实业发展有限公司)，探头超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，C18 trap柱和C18分析柱(美国Waters)，LC-20AB液相色谱系统和纳升液相色谱仪(日本Shimadzu)，质谱仪和离子源(美国AB SCIEX)，喷针(美国New Objectives)，MIKRO 22R型高速冷冻离心机(美国Beckman)，Milli-Q Integral纯水/超纯水一体化系统(美国Millipore Corporation)，超声波探头(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
主要试剂：iTRAQ试剂盒(美国AB SCIEX)，苯基甲基磺酰氟(美国Bio Basic)，乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇(美国Amersco)，碘乙酰胺(美国Sigma-Aldrich)，丙酮(西陇化工股份有限公司)，胰蛋白酶(美国Promega)，乙腈(美国，美国Thermo Fisher Scientific)，氨(生工生物工程(上海)股份有限公司)，富马酸(美国Dikma)。
1.2 试验动物120枚重量为(65±0.2) g的罗氏308肉鸡种蛋购自江苏无锡祖代鸡场有限公司，孵化前种蛋称重，编号，并随机分为两组，即孵化的第14天(E14)和出壳1日龄(H1)两个发育阶段，每组3个重复，每个重复20枚种蛋。将种蛋放置于孵化箱中，孵化条件：温度(37±0.5)℃，相对湿度65%，孵化期间每30 min自动翻蛋1次，翻转角度为90°，孵化至19胚龄时停止翻蛋。在E14胚龄和H1日龄时，分别采集40个肝脏组织样本，－80 ℃保存备用。
1.3 样品处理 1.3.1 E14胚龄和H1日龄鸡胚肝脏组织蛋白质提取称取150 mg肝脏组织样品，加入终浓度为1 mmol·L-1的苯基甲基磺酰氟(PMSF)和2 mmol·L-1的乙二胺四乙酸(EDTA)，5 min后，加入终浓度为10 mmol·L-1的二硫苏糖醇(DTT)，混匀；组织破碎仪进行破碎(240 s，50 HZ·s-1)后，25 000×g 4 ℃离心20 min，将上清转移至新的EP管中；加入5倍体积的预冷丙酮，－20 ℃沉淀2 h后，16 000×g 4 ℃离心20 min，弃上清，向沉淀中加入适量蛋白裂解液。用终浓度为55 mmol·L-1的碘乙酰胺(IAM)，在暗室中烷基化封闭半胱氨酸；随后加入适量预冷丙酮，-20 ℃静置2 h，25 000×g 4 ℃离心20 min，弃上清；超声溶解15 min后，25 000×g 4 ℃离心20 min，取上清用于定量[6]。
1.3.2 鸡胚肝脏组织蛋白质酶解和肽段iTRAQ标记每个样品取出100 μg蛋白，按蛋白:酶=20:1的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h；用真空离心泵抽干肽段；再次溶解肽段，按照试剂盒说明书对肽段进行iTRAQ标记；每组肽段用不同的iTRAQ标签标记，室温放置2 h；将标记后的各组肽段混合，进行反向色谱分离。
1.4 鸡胚肝脏组织蛋白质LC-ESI-MS/MS分析将“1.3”所得组分分别用buffer A溶解至0.5 μg·μL-1的浓度，20 000×g离心10 min，除去不溶物质后，采用岛津LC-20AD纳升液相色谱仪进行分离(包括Trap柱和分析柱)，分离程序：首先在4 min内以8 μL·min-1的流速将样品加载到Trap柱上，再以300 nL·min-1的总流速将样品带至分析柱，分离并进入质谱系统。洗脱程序：首先在5% buffer B中洗脱5 min；再以直线梯度的形式洗脱35 min，使buffer B由5%上升至35%；继续洗脱5 min，并在5 min内使buffer B升高至60%；然后再洗脱2 min，并使buffer B升高至80%后继续保持2 min；最后洗脱1 min，在1 min内使buffer B恢复至5%后，平衡10 min。
LC-ESI-MS/MS分析基于质谱仪Triple TOF 5600，离子源为Nanospray Ⅲ source，放射器为喷针，由石英材料制成。采集数据时，一级质谱只扫描电荷数是2+ ~ 5+的离子，一个循环为3.3 s；母离子动态排除在出峰的一半时间，即约为15 s，同一母离子碎裂次数不超过两次。
1.5 鸡胚肝脏组织蛋白质鉴定及定量使用Proteome Wizard将从Orbitrap获取的原始数据文件转换为MAS-COT通用格式(*.MGF)文件。用Mascot软件对Swiss-Prot数据库进行蛋白质鉴定，每个蛋白鉴定时至少含有一个特异性肽段，差异蛋白筛选条件为：P < 0.05，FC≥1.2或≤0.85。
1.6 蛋白质生物信息学分析利用DAVID软件对鉴定出的蛋白质以及差异蛋白质进行基因本体(GO)分析，包括生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。利用京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库对差异蛋白质进行鉴定及代谢通路富集分析。使用检索相互作用基因/蛋白质(STRING)软件分析差异蛋白相互间的作用以筛选出核心差异因子。
2 结果 2.1 鸡胚肝脏组织蛋白质鉴定结果本试验通过对iTRAQ蛋白质组学技术所获得的信息以及数据库结果进行比对，共鉴定出3 607个蛋白。肽段长度分布主要在7~18个氨基酸之间，肽段长度合理，表明本试验数据质量较高。肽段数量多于11个的蛋白有299个，其余蛋白肽段数量均在1~10之间。对所有鉴定出的蛋白质相对分子质量进行统计表明，有16%蛋白质相对分子量大于100 ku，其余蛋白质相对分子量分布在0~100 ku之间。序列覆盖率为0~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%和40%~100%的蛋白质分别占57.23%、17.95%、9.42%、5.81%和9.59%。
2.2 鸡胚肝脏组织不同发育阶段差异表达蛋白筛选如图 1所示，图中每个圆圈代表一个蛋白，蓝色线以上的代表差异蛋白，红色圆圈代表显著上调的蛋白，绿色圆圈代表显著下调的蛋白，灰色代表无显著变化的蛋白。在H1和E14两个发育阶段之间共筛选出251个差异蛋白，其中90个下调，161个上调。
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图 1 鸡胚肝脏组织不同发育阶段差异蛋白火山图 Fig. 1 Volcano plot of differentially abundant proteins in chicken embryonic liver in different stages |
利用DAVID软件对差异表达蛋白进行GO富集分析，结果显示，在E14胚龄和H1日龄之间的251个差异蛋白中，192个蛋白被成功注释到49个GO功能条目中(图 2)。其中，BP占18个功能条目，最显著的是代谢过程和转运过程，代谢过程包括小分子代谢过程、胆固醇代谢、脂肪酸代谢、胞内代谢以及核酸过程等；CC占9个功能条目，表明差异蛋白主要分布在细胞质、细胞膜以及细胞内；MF占22个功能条目，表明差异蛋白主要具有结合活性、裂解活性和转运活性，结合活性主要包括小分子结合、离子结合和核苷酸结合等。
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图 2 鸡E14胚龄和H1日龄肝脏组织差异蛋白GO分类注释 Fig. 2 GO annotation of differential proteins in H1 compared with E14 in chicken embryonic liver |
利用KEGG数据库对H1日龄和E14胚龄之间的差异蛋白进行注释，结果如图 3所示，富集最显著的为PPAR信号通路，接下来分别为类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、组氨酸代谢、糖酵解/糖异生、初级胆汁酸生物合成、过氧化物酶体、脂肪酸降解、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、脂肪酸生物合成、蛋白质消化吸收、丙酮酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、β-丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、氧化磷酸化、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢和脂肪酸代谢。
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图 3 鸡E14胚龄和H1日龄肝脏组织差异蛋白通路富集分析 Fig. 3 Pathway enrichment of differential proteins in H1 compared with E14 in chicken embryonic liver |
利用STRING软件对H1日龄和E14胚龄之间的差异蛋白进行网络互作功能分析，结果如图 4所示，差异蛋白紧密相连富集最为显著的功能模块主要为PPAR信号通路、脂肪酸降解和糖酵解/糖异生通路，且这3条通路与KEGG注释结果重叠，表明其在E14胚龄到H1日龄的发育阶段发挥至关重要的作用。
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图 4 鸡E14胚龄和H1日龄肝脏组织差异蛋白网络互作分析 Fig. 4 Interaction network of differential proteins in H1 compared with E14 in chicken embryonic liver |
每个功能模块由多个功能节点组成，在网络互作图中，每个功能节点均为差异蛋白，而映射到重要功能模块上的功能节点即为核心差异蛋白。其中，涉及PPAR信号通路的功能节点主要有过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)、长链脂肪酸辅酶A连接酶1(ACSL1)、长链脂肪酸辅酶A连接酶5(ACSL5)、肉碱O-棕榈酰转移酶1(CPT1A)、烯酰-CoA δ异构酶2(ECI2)；涉及脂肪酸降解途径的功能节点主要有FASN和涉及PPAR信号通路的蛋白；涉及糖酵解/糖异生的功能节点主要有脂肪醛脱氢酶(ALDH3A2)、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶(ALDH9A1)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、L-乳酸脱氢酶B链(LDHB)、葡萄糖磷酸酶-1(PGM1)、葡萄糖磷酸酶-2(PGM2)。核心差异蛋白质详细信息见表 1。
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表 1 鸡E14胚龄和H1日龄肝脏组织核心差异蛋白 Table 1 The core differential proteins in H1 compared with E14 in chicken embryonic liver |
鸡肉因蛋白质含量丰富，是目前消费市场仅次于猪肉的第二大消费肉类。同时，肉鸡也被用来研究人类肥胖模型，但蛋白质含量的动态变化主要集中于成年鸡，很少有关于鸡胚发育过程中蛋白质动态变化的研究。本试验基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法，结合KEGG注释和蛋白网络互作分析发现，H1日龄和E14胚龄的差异蛋白主要富集于PPAR信号通路、脂肪酸降解和糖酵解/糖异生通路。在禽类和哺乳动物中，脂肪酸代谢过程错综复杂，一些关键蛋白发挥至关重要作用[15-16]。在鸡胚胎发育过程中，主要营养来源是卵黄中的脂类[13]。本试验结果表明，在胚胎发育后期差异蛋白显著富集于PPAR信号通路，且同时显著富集于脂肪降解途径。ACSL1和ACSL5属于酰基辅酶A合成酶长链家族(ACSLs)成员，参与催化长链脂肪酸(C12-C22)β-氧化过程中第一个活化步骤，在体内缺乏ACSL1，可导致脂肪酸氧化过程受阻[17-21]。CPT1A表达水平不足导致脂肪酸氧化减少，最终造成脂肪沉积[22]。ECI2主要参与脂肪酸β-氧化途径[23-24]。此外，本试验发现另外一个核心差异蛋白ACOX1，与E14相比，其在H1日龄时显著升高。研究发现，ACOX1与脂肪沉积变性有关[25-27]。脂肪沉积是肥胖和代谢综合征的重要风险因素之一，ACSL1、ACSL5、CPT1A、ECI2和ACOX1作为脂肪降解的核心功能节点，其表达水平显著升高，表明脂肪酸被分解提供营养和能量以满足胚胎发育生长需要。
第二个显著富集的功能模块为糖酵解/糖异生代谢，包含6个核心差异蛋白，即ALDH3A2、ALDH9A1、GPI、LDHB、PGM1和PGM2。醛脱氢酶(ALDHs)是一类可以使碳水化合物、脂质和氨基酸在代谢过程中形成醛的酶。ALDH9A1在多种组织中高表达，在葡萄糖不足条件下，为柠檬酸循环提供碳源[28]。与E14胚龄相比，ALDH9A1在H1日龄表达水平显著下降，表明葡萄糖在E14胚龄至H1日龄期间比较充足。ALDH3A2主要降低葡萄糖，促进糖异生。研究表明，GPI在肝脏中可促进糖异生[29-30]，且糖酵解途径中LDHB表达水平显著下降，表明糖酵解速率降低或被抑制。PGM缺失可导致糖酵解作用加强，乳酸产量增加。而本试验发现，与E14胚龄比，PGM异构体PGM1和PGM2的表达水平在H1日龄显著升高，表明糖酵解被抑制或减少，且在这段期间鸡胚具有呼吸功能，氧消耗增加，且种蛋中营养物质会影响机体代谢，因此，ALDH9A1和LDHB表达水平下降，ALDH3A2、GPI、PGM1和PGM2表达水平显著升高，表明从E14胚龄到H1日龄期间，糖异生被促进，以储存能量。试验将进一步深入探讨胚胎发育后期各日龄的蛋白变化及作用机制。
4 结论在肉鸡胚胎发育后期，糖酵解不是主要的供能方式，肝脏蛋白变化主要涉及脂肪酸降解，通过上调ACSL1、ACSL5、CPT1A、ECI2和ACOX1表达水平产生能量以满足鸡胚发育后期能量需要。同时，通过上调ALDH3A2、GPI、PGM1和PGM2表达水平促进糖异生，主要是储存糖原应对出壳以及营养环境变化。
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