畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (12): 3193-3198. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.12.029    PDF    
引用本文
张耀东, 朱红, AFAYIBO Dossêh Jean Apôtre, 王瑶, 易正飞, 信素华, 陶程琳, 李涛, 祁晶晶, 田明星, 丁铲, 于圣青, 王少辉. 常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(12): 3193-3198.  
ZHANG Yaodong, ZHU Hong, AFAYIBO Dossêh Jean Apôtre, WANG Yao, YI Zhengfei, XIN Suhua, TAO Chenglin, LI Tao, QI Jingjing, TIAN Mingxing, DING Chan, YU Shengqing, WANG Shaohui. Development and Application of Multiplex PCR Method for the Drug Resistance Genes Detection in Avian Pathogenic Escherichia coli[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(12): 3193-3198.  
常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测
张耀东, 朱红, AFAYIBO Dossêh Jean Apôtre, 王瑶, 易正飞, 信素华, 陶程琳, 李涛, 祁晶晶, 田明星, 丁铲, 于圣青, 王少辉     
中国农业科学院上海兽医研究所, 上海 200241
收稿日期：2020-05-06
基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0500800；2018YFE0102200）；上海浦江人才计划（2019PJD057）；兵团财政科技计划项目（2020AB025）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2020JB03）
作者简介：张耀东(1994-), 男, 河南新密人, 硕士生, 主要从事畜禽细菌性传染病研究, E-mail:837549574@qq.com.
通信作者：于圣青, 主要从事畜禽细菌性传染病研究, Tel:021-34293461, E-mail:yus@shvri.ac.cn; 王少辉, 主要从事畜禽细菌性传染病研究, Tel:021-34293412, E-mail:shwang0827@126.com.
摘要：本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法，用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列，设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序，建立4组耐药基因（cat+floR+tetB+tetC；dfrA12+sul2+sul1+blaCTX-M+balTEM-1；aac3+aph3+aadA1+strB；tetA+cmlA+strA+sul3）的多重PCR反应体系。然后，检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因，同时，检测其耐药性，比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示，建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段，测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明，4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为103、104、104和105CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致，其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因，可用于耐药基因的传播、流行调查。
关键词：耐药基因    多重PCR    检测    
Development and Application of Multiplex PCR Method for the Drug Resistance Genes Detection in Avian Pathogenic Escherichia coli
ZHANG Yaodong, ZHU Hong, AFAYIBO Dossêh Jean Apôtre, WANG Yao, YI Zhengfei, XIN Suhua, TAO Chenglin, LI Tao, QI Jingjing, TIAN Mingxing, DING Chan, YU Shengqing, WANG Shaohui     
Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China
Corresponding author: YU Shengqing, E-mail: yus@shvri.ac.cn; WANG Shaohui, E-mail: shwang0827@126.com.
Abstract: To detect the drug resistance genes, the multiplex PCR method for drug resistance genes of β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, amphenicols, and sulfonamides were developed. Based on the sequences of drug resistance genes from GenBank, 17 pairs of specific primers were designed. Then, 4 multiple PCR assays were established through the optimization of PCR reaction conditions and primers concentrations (cat+floR+tetB+tetC; dfrA12+sul2+sul1+blaCTX-M+balTEM-1; aac3+aph3+aadA1+strB; tetA+cmlA+strA+sul3). The sensitivity and specificity of these assays were determined. The multiplex PCR assays were used to detect the drug resistance genes of 42 avian pathogenic Escherichia coli (APEC). The drug sensitivity of these APEC strains were also determined, which were compared to the distributions of drug resistance genes in these strains. The results showed that the 17 drug resistance genes were effectively and specifically amplified in these 4 optimized multiplex PCR assays. The detection limits of the 4 multiplex PCR were 103, 104, 104 and 105CFU of bacteria, respectively. The established multiplex PCR assays are specific and rapid for the detection of drug resistance genes in APEC strains, which showed 92.86% coincident with the drug resistance for these strains. The developed 4 multiplex PCR are simple and rapid assays for drug resistance genes detection, which can be used for the epidemiologic study for drug resistance genes.
Key words: drug resistance gene    multiplex PCR    detection    

随着养殖过程中抗菌药物的不合理使用，细菌多重耐药现象日趋严重[1-2]，其中，对β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类耐药情况较为严重[1, 3-4]。细菌通过耐药基因产生耐药性，这些耐药基因在环境中分散富集[5]，后又被其他细菌获取利用，并作为遗传物质进行复制[6]。另外，耐药基因也可以通过质粒、转座子等可移动遗传元件[7]在致病菌间、致病菌和非致病菌间、甚至在不同菌属间进行水平转移。单基因PCR检测费时费力，因此本研究建立17种常见耐药基因的多重PCR检测方法，为细菌耐药性及耐药基因流行病学快速调查奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)临床分离株由本实验室从江苏、山东、河南等地区的养殖场病禽中分离、鉴定并保存。经PCR检测及测序，分离株SDCE393和SDCE607携带本研究检测的耐药基因，作为多重PCR方法的阳性菌株。

1.2 主要试剂和仪器

2×PCR Premix、DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；胶回收试剂盒GeneJet Gel Extraction Kit购自Thermo Scientific公司；药敏片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。PCR仪购自美国ABI公司；电泳仪及凝胶成像处理系统购自上海天能科技有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中17个β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物的耐药基因序列设计特异性引物(表 1)，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表 1 耐药基因多重PCR引物 Table 1 Primers used for the multiplex PCR of drug resistance genes
1.4 多重PCR反应体系的建立

分别以SDCE393和SDCE607为模板建立并优化单个耐药基因的PCR反应体系。然后，将17个耐药基因分为4个多重PCR体系(表 1)，分别以SDCE607、SDCE393为模板，分别调整引物浓度和PCR反应退火温度等参数，建立多重PCR方法。

1.5 PCR特异性鉴定

将PCR产物上样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察，记录试验结果。然后，回收目的片段，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，比对分析。

1.6 多重PCR的敏感性测定

分别以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102 CFU的阳性菌株作为模板进行多重PCR，检测最低检测限。

1.7 多重PCR在APEC分离株耐药基因检测中的应用

根据优化的条件，应用建立的耐药基因多重PCR方法检测42株APEC分离株的耐药基因。

1.8 药物敏感性试验

采用药敏纸片法(K-B法)测定APEC分离株对常见β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物的敏感性，按照药敏片说明书判定结果。

2 结果 2.1 多重PCR方法的建立

在单基因PCR的基础上，优化条件建立多重PCR检测体系。结果显示，经过引物浓度优化(表 1)，在反应程序为“95 ℃预变性5 min；95 ℃ 50 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 80 s，30个循环；72 ℃延伸10 min”条件下，可有效特异性扩增出所有目的条带(图 1)。

图 1 耐药基因多重PCR方法的建立 Fig. 1 Development of multiplex PCR for drug resistance genes detection
2.2 特异性检测

回收单基因PCR及多重PCR目的条带，经测序比对，相似性为99%~100%，表明在上述条件下耐药基因均得到特异性扩增。

2.3 敏感性检测

敏感性检测结果显示，多重PCR反应体系1、2、3、4的敏感性依次为103、104、104、105 CFU。

2.4 耐药基因检测

PCR检测发现APEC分离株中不同耐药基因分布率差别较大，耐药基因的分布率在16.7%~83.3%(图 2A)。另外，APEC分离株同时携带多个耐药基因，其中，2株分别携带13、14个耐药基因。

图 2 APEC分离株的耐药基因(A)及耐药性(B)检测 Fig. 2 Drug resistance genes distribution (A) and drug resistance (B) of APEC isolates
2.5 药敏试验

药敏试验结果显示，APEC分离株对抗菌药物的耐药率为16.67%~100.00%(图 2B)。对药敏试验结果和多重PCR检测结果逐一对比分析，耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。

3 讨论

随着抗菌药物的不合理使用，细菌产生广泛耐药性，给人类健康及公共卫生带来严重危害[8-9]。本研究选取常见的17种耐药基因[4, 10]，建立了4组快速、特异的多重PCR检测方法。本研究建立的多重PCR方法与杨鑫等[11]建立的耐药基因多重PCR敏感性结果相似，具有良好的检测敏感性。

为验证建立的多重PCR方法的实用性，利用本方法对42株APEC分离株进行耐药基因检测，与国内外研究结果类似[12-14]，表明耐药基因广泛存在于大肠杆菌。然而，由于大肠杆菌分离株来源及抗生素使用不同，部分耐药基因(strA、strB、aadA、blaCTX-M)分布率存在差异[15-16]。耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%，与其他研究多重PCR方法的符合率一致[4, 11]，表明本研究建立的多重PCR方法可准确筛选细菌的药物敏感性。另外，本研究选取的耐药基因也广泛存在于沙门菌、肺炎克雷伯菌等菌种，因此, 本方法也可用于上述菌株的耐药基因检测[17-18]。

4 结论

本研究建立4组特异性强、灵敏度高的耐药基因多重PCR方法，可快速有效地检测常见的耐药基因，为大肠杆菌等细菌的耐药基因检测及耐药性的快速初筛提供操作方法。

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