2. 北京市兽药监察所, 北京 102629
, WANG Yingchao1, WU Di1, LI Yue2, SONG Yanjun1, WEI Haitao1, WANG Lin1, GAO Xiaolong1
, FENG Xiaoyu1
2. Beijing Veterinary Drug Control Institution, Beijing 102629, China
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)感染引起的一种急性、热性和高度接触性的传染病[1]，发病率和死亡率可达到100%。NDV可自然感染人、猪和犬等哺乳动物，对养鸡业的危害更是巨大[2]。该病是世界动物卫生组织(OIE)必须报告的疫病[3]，我国将其列为一类动物疫病并作为强制免疫疫病。
目前，针对NDV的检测方法很多，其中，鸡胚病毒分离与鉴定是确诊该病的“金标准”[4]，但病毒分离培养操作繁琐，所需要的时间较长，影响其有效分离到病毒的因素较多；荧光定量PCR方法虽然已广泛应用于ND等动物疫病的检测，但其灵敏度仍有待提高，特别是在病毒含量极低时常会出现假阴性或可疑结果的情况，所以有必要建立一种灵敏度更高、更准确的方法，从而有效提高新城疫病毒的检测精确度。
微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术属于第3代PCR技术，近年来，逐渐被应用于病原微生物检测、肿瘤相关基因检测等多个领域[5]。该技术不仅可以对病原体定性，还能对病原体DNA或RNA序列进行绝对定量，可以说敏感性和准确性均比传统荧光定量PCR方法高[6]。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，定量估算起始模板浓度[7]，并对基因表达进行绝对定量。
本研究建立并优化了NDV ddPCR检测方法，为NDV的早期诊断、准确检测和科学研究提供了一种新的技术手段。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 样品 新城疫病毒LaSota株购自中国兽医药品监察所。H9N2亚型禽流感病毒(AIV H9 N2)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(AILTV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)6种病毒及86份临床样品由本实验室保存。
1.1.2 主要仪器设备 NP968-C天隆全自动核酸提取仪，微滴式数字PCR检测系统(QX100Droplet Generator、QX100Droplet Reader、QX100微滴式数字PCR仪)，伯乐CFX96 Touch荧光定量PCR仪。
1.1.3 主要试剂及材料 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司，One-Step RT-ddPCR Kit for Probes、Droplet generation oil for probe购自伯乐公司，新城疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒购自世纪元亨公司，引物和探针由英潍捷基公司合成。
1.2 方法1.2.1 引物探针设计 在NDV F基因保守序列段中，分别在首部、中部和尾部设计了3套引物和探针(表 1)，探针5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团。从中选出通用性好、试验效果最佳、拷贝数最高的引物探针。
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表 1 NDV引物和探针序列 Table 1 Primer and probe sequences for NDV |
1.2.2 病毒核酸提取 根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取病毒核酸，置于-80 ℃备用。
1.2.3 微滴式数字PCR方法建立 微滴式数字PCR的试验过程主要包括微滴生成、PCR扩增和微滴读取3个主要步骤。
生成微滴：微滴式数字PCR反应体系为One-step ddPCR supermix 5 μL，反转录酶2 μL，300 mmol·L-1 DTT 1 μL，10 μmol·L-1引物1.8 μL，10 μmol·L-1探针0.5 μL，水7.7 μL，模板2 μL。转移至微滴生成卡的sample孔中，在微滴生成卡的oil孔中加入70 μL微滴生成油，将生成卡放入微滴生成仪，生成微滴。
PCR扩增：将生成的微滴转移至96孔板内，盖膜后放入热封仪进行封膜。将封好膜的96孔板放入PCR仪进行扩增。PCR的扩增程序为扩增条件为50 ℃ 20 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55~62 ℃ 1 min，40个循环；4 ℃ 60 min结束反应。
读取微滴：扩增完毕后将96板转移至QX100 Droplet Reader微滴读取仪上进行微滴读取。
1.2.4 微滴式数字PCR反应条件的优化 优化ddPCR反应，包括3个步骤：PCR反应条件的优化(引物、探针浓度、退火温度)，方法的线性及最低检测限的测定。引物浓度设置为600、900、1 200 nmol·L-1，探针浓度设置为150、250、350 nmol·L-1，退火温度设置为55、57、60、62 ℃。反应体系和反应程序如“1.2.3”所示。通过比较RT-ddPCR的微滴生成数，微滴分布状态、微滴荧光信号的强度等来确定优化的结果。
1.2.5 灵敏性试验 为评估NDV ddPCR检测方法的线性关系、扩增效率、灵敏性，将新城疫病毒(LaSota株)标准毒株提取核酸后10倍倍比稀释(100~104)，进行ddPCR检测，每个浓度重复检测3次，以评价方法的灵敏性。
1.2.6 特异性试验 提取AIV(H9N2)、IBV、AILTV、EDSV、FAdV-4、IBDV、NDV 7种病毒的核酸，使用已经优化的新城疫病毒ddPCR方法分别对其检测，验证该方法的特异性。
1.2.7 重复性试验 使用已经优化的新城疫病毒ddPCR对同一份样品进行检测，共重复测定10次，计算其标准偏差和变异系数，评价该方法的重复性。
1.2.8 临床样品检测 应用NDV RT-qPCR方法(新城疫检疫技术规范，SN/T 0764—2011)和本研究建立的NDV ddPCR方法对本实验室保存的86份临床样品(鸡法氏囊样品44份、肛拭子样品42份)进行检测，评价其检测效果及两种方法的符合率。
2 结果 2.1 引物探针的选择设计了3组引物和探针进行ddPCR试验，结果显示，3组结果扩增效果接近，第3组的拷贝数略优于第1和第2组，所以最后选择第3组引物探针。
2.2 ddPCR方法的建立及反应条件的优化按照微滴生成、PCR扩增和微滴读取3个步骤建立了NDV ddPCR方法，对引物、探针浓度和退火温度进行了优化。
2.2.1 引物和探针浓度优化 设置3组引物和探针的浓度进行筛选和优化，分别为第1组(引物浓度600 nmol·L-1 +探针浓度150 nmol·L-1)、第2组(引物浓度900 nmol·L-1 +探针浓度250 nmol·L-1)、第3组(引物浓度1 200 nmol·L-1+探针浓度350 nmol·L-1)，每组浓度检测4次。结果如图 1所示，第1、2和3组检测病毒拷贝数的平均值分别为2 804、3 200、2 973 copies·μL-1，第2组引物和探针浓度组合检测的病毒拷贝数最多，所以确定最佳的引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L-1。
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横坐标样本格式“NDV+引物浓度+探针浓度” The format of the abscissa sample is "NDV+primer concentration+probe concentration" 图 1 不同引物和探针浓度检测的拷贝数 Fig. 1 Copies amplitude of different concentrations of primers and probes |
2.2.2 退火温度优化 设置4个退火温度55、57、60、62 ℃，结果显示，退火温度在55 ℃时，信号强度最强，退火温度越高，信号强度逐渐下降，因此，将退火温度定为55 ℃。
2.3 ddPCR灵敏性试验对新城疫病毒(NDV LaSota株)标准毒株的核酸10倍倍比稀释(100~104)后进行ddPCR检测，每个浓度重复检测3次，获得梯度稀释扩增图(图 2)和标准曲线(图 3)。NDV ddPCR标准曲线为y= 1.116 7x+3.545 1、R2=0.998 4，线性关系良好。
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A04、A06、A07为原浓度核酸；B05、B06、B07为10倍稀释核酸；C04、C05、C06为100倍稀释核酸；D04、D06、D05为1 000倍稀释核酸；E04、E05、E06为10 000倍稀释核酸 A04, A06, A07 nucleic acid of original concentration; B05, B06, B07 nucleic acid of 10 multiple dilution; C04, C05, C06 nucleic acid of 100 multiple dilution; D04, D06, D05 nucleic acid of 1 000 multiple dilution; E04, E05, E06 10 000 multiple dilution 图 2 梯度稀释扩增图 Fig. 2 Amplification plot of serial dilutions |
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图 3 ddPCR标准曲线 Fig. 3 Standard curve of ddPCR |
NDV标准毒株的核酸梯度稀释后其拷贝数检测结果如表 2，当检测值低于10拷贝时该方法也能稳定检出，且CV值为4.97%，故取其平均值1.8 copies·μL-1确定为该方法的最低检测下限。
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表 2 倍比稀释检测结果 Table 2 Test results of multiple dilution |
用建立的新城疫病毒数字PCR方法分别检测AIV(H9N2)、IBV、AILTV、EDSV、FAdV-4、IBDV、NDV 7种病毒，仅有NDV LaSota株试验孔出现阳性微滴，其余各孔均为阴性微滴，说明本方法的特异性较好。
2.5 ddPCR重复性试验同一份样品使用微滴式数字PCR重复测定10次，试验结果显示，变异系数为2.4%，说明本研究建立的数字PCR方法重复性好，检测结果稳定、可靠。
2.6 临床样品检测应用NDV RT-qPCR方法(新城疫检疫技术规范，SN/T 0764-2011)和本研究建立的NDV ddPCR方法分别对86份临床样品(鸡法氏囊样品44份、肛拭子样品42份)进行检测。试验结果显示，采用NDV RT-qPCR方法检测出阳性样品9份，阴性样品77份，采用NDV ddPCR方法同样检测出阳性样品9份，阴性样品77份，两种方法的符合率为100%。使用NDV ddPCR方法测得这9份阳性样品的拷贝数分别为1 706、121、373、1 878、178、2 085、206、2 067、187 copies·μL-1，说明本方法实现了对样品中病毒含量的绝对定量检测。
3 讨论随着分子生物学技术的不断发展，核酸定量技术更新换代，从传统的定量PCR逐渐发展到数字PCR[5]。与传统的PCR方法相比，数字PCR方法更加灵敏，可以在样品浓度较低时，发现目的片段，不需要依赖Ct值和标准曲线而实现绝对核酸定量[8]。近几年，数字化PCR方法在动物疫病研究中也被广泛应用，陈亚娜等[9]利用伪狂犬病病毒gB基因为靶基因，建立了可对其准确定量的微滴数字PCR方法，可用于伪狂犬病病毒的定量检测；谭建锡等[10]建立了一种快速、准确检测H1亚型猪流感病毒的微滴数字RT-PCR定量方法，最低可检测4.7拷贝·μL-1。但随着数字PCR技术的不断发展，其不足之处也逐渐表现出来，比如ddPCR需要精密仪器，对人员操作要求较高，检测时间较qPCR更长，并且由于现有技术缺陷，目前，ddPCR还不能实现高通量检测，但随着技术的不断成熟和改进，ddPCR技术的检测效率会不断提高，该技术的应用前景也将更加广泛。
NDV F蛋白是NDV感染细胞所必需的一种囊膜糖蛋白[11]，该蛋白裂解位点处的氨基酸序列对病毒毒力有非常重要的影响，被看作判定NDV毒力的重要标准[12-15]，所以本研究选取了F基因作为靶基因，建立了新城疫病毒微滴式数字PCR检测方法，该方法灵敏度、特异性高，重复性好，实现了绝对定量，特别适用于病毒含量极低样品的检测，避免了荧光定量PCR报告可疑结果时需重复检测的缺陷，为新城疫的诊断和防控提供了技术保障。
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