2. 上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240;
3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China;
3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是严重危害全球养猪业的病毒性传染病之一,给养猪业造成巨大经济损失[1-2]。2006年,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)在我国首次出现,并引起大规模的疫情暴发[3],此后,HP-PRRSV-like毒株成为在我国猪群中广泛流行的优势毒株。近几年,在我国又出现了发生重组变异的PRRSV分离株[4-5],其致病性虽然比HP-PRRSV毒株低,但其在猪群中造成的持续性感染对猪的生长性能影响严重。PRRSV的变异和重组对现有疫苗的防控提出了新的挑战,有必要及时监测PRRSV遗传进化和流行情况。本研究从上海某发病猪场的PRRSV阳性样品中分离获得了1株基因组发生高度变异和重组的PRRSV,分析证实该毒株是由HP-PRRSV-like毒株和NADC30-like毒株经重组而来的新的变异毒株,研究结果可为指导临床有效预防PRRS流行提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、病毒及抗体Marc-145细胞、高致病性PRRSV HuN4株和疫苗毒HuN4-F112株均由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室保存[3, 6];9份临床样品采自上海某猪场中发病的保育猪群,该猪场此前一直采用经典弱毒疫苗进行免疫预防;抗PRRSV N和Nsp2蛋白单抗由本研究室制备并保存[7-8];FITC标记的羊抗鼠IgG荧光二抗均购自Thermo Scientific公司。
1.2 样品检测及病毒生物学特性分析利用PCR方法(Nsp2检测引物见表 1)检测样品,将PRRSV阳性样品接种于Marc-145细胞进行病毒分离和传代,对第5代培养物进行毒株的鉴定,通过噬斑形态观察和增殖曲线绘制分析其生物学特性。
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表 1 PRRSV检测以及全基因组扩增引物 Table 1 Primers for PRRSV detection and full genome sequencing |
提取第5代病毒基因组RNA,设计扩增PRRSV全基因组的引物(表 1),将全基因分为8个片段(A、B、C、D、E、F、G和H)分别进行RT-PCR扩增和克隆测序,并利用DNAstar软件的Seqman对各基因片段进行全长基因拼接。同时,利用MEGA7.0软件分析分离毒株的遗传进化关系,利用RDP4软件和Simplot软件对分离毒株进行基因重组分析。
2 结果 2.1 SHpd1/2018分离株生物学特性分析对采集的9份临床样品进行PCR检测,结果显示,有7份样品仅呈PRRSV阳性。分离毒株在Marc-145细胞上引起的CPE形态与HuN4株相似,将其命名为SHpd1/2018株。利用抗PRRSV N和Nsp2蛋白特异抗体对其进行IFA检测,结果显示,SHpd1/2018分离株可被针对PRRSV N蛋白的特异性单抗所识别,但是却不被针对Nsp2蛋白的单抗所识别(图 1A),其在Marc-145细胞形成的CPE、噬斑形态和增殖特点与HP-PRRSV HuN4株相似(图 1B、C)。推测SHpd1/2018分离株Nsp2基因与HP-PRRSV-like毒株和CH-1a-like毒株不同,可能存在变异。
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A. SHpd1/2018分离株的IFA鉴定;B. SHpd1/2018分离株在Marc-145细胞中的多步生长曲线;C. SHpd1/2018分离株的噬斑形态分析 A. IFA identification of SHpd1/2018; B. Multi-step growth curve of SHpd1/2018 in Marc-145 cells; C. Plaque morphology of SHpd1/2018 strain 图 1 SHpd1/2018分离株的IFA鉴定及生物学特性分析 Fig. 1 IFA identification of SHpd1/2018 and its biological characteristics |
扩增SHpd1/2018分离株全基因组并拼接,显示其全长基因为15 018 bp(不含polyA)。序列分析结果显示,SHpd1/2018株与经典毒株VR2332、CH-1R以及HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4的核苷酸相似性分别为86.5%、90.9%和94.3%,与HP-PPRSV弱毒疫苗株JXA1-P80和HuN4-F112的相似性为93.8%,与NADC30株的相似性为86.7%,表明SHpd1/2018株与HP-PRRSV强毒株的亲缘关系较近。其Nsp2基因与NADC30毒株有相同的氨基酸缺失模式“111+1+19”(图 2A);进化树分析结果显示,SHpd1/2018与HP-PRRSV like株的全长基因和ORF5基因同属于谱系8(图 2B、C),而Nsp2基因则与NADC30 like毒株同属于谱系1(图 2D),结果表明,SHpd1/2018分离株可能存在基因重组现象。
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A. SHpd1/2018分离株Nsp2氨基酸缺失区域比对分析; B. SHpd1/2018分离株全基因进化树分析;C. SHpd1/2018分离株ORF5进化树分析;D. SHpd1/2018分离株Nsp2进化树分析 A. Comparison analysis of amino acid deletion regions in Nsp2 of SHpd1/2018; B. Phylogenetic analysis of SHpd1/2018 complete sequence; C. Phylogenetic analysis of SHpd1/2018 ORF5 gene; D. Phylogenetic analysis of SHpd1/2018 Nsp2 gene 图 2 SHpd1/2018分离株的基因序列分析 Fig. 2 Genome sequence analysis of SHpd1/2018 |
通过RDP4软件进行重组分析,结果显示,经过RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq 7种方法分析,证实SHpd1/2018毒株是以谱系8的HP-PRRSV like强毒株为主要亲本毒,以NADC30-like毒株为次要亲本毒重组而来,其重组断点为nt 2002和nt 3205(P < 0.001)(图 3A)。利用Simplot软件对分析结果进行可视化,结果显示,两个重组断点将其分隔为3个基因区域,A(nt 1~nt 2001)、B(nt 2002~nt 3205)和C(nt 3206~nt 15018),对不同基因区域进行进化树分析,结果显示,A和C基因区域位于HP-PRRSV类毒株分支,而B区域则位于NADC30类毒株的分支(图 3B),由此证实SHpd1/2018株是由HP-PRRSV-like强毒株和NADC30-like毒株重组而来的变异病毒。
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A. SHpd1/2018分离株全长基因重组分析; B. SHpd1/2018分离株不同基因区域进化树分析 A. Recombination analysis of SHpd1/2018 full-length genome; B. Phylogenetic analysis of SHpd1/2018 in different regions 图 3 PRRSV SHpd1/2018分离株的重组分析 Fig. 3 Whole genome recombination analysis of PRRSV SHpd1/2018 strain |
PRRSV是一种极易发生突变的RNA病毒,由于它的RNA依赖的RNA聚合酶缺乏校对能力,导致PRRSV在复制过程容易出现突变和错配而产生大量变异毒株,PRRSV的持续变异不仅增加了其遗传多样性,而且其致病性也发生了不同的改变[9-10]。近年来, 随着临床针对PRRSV预防策略的无序变化,一些发生新变异和重组的PRRSV不断被发现,这些变异毒株的出现可能成为该病广泛流行的潜在威胁,因此,针对新变异的PRRSV监测不容忽视。在本研究中获得的SHpd1/2018分离株,基于全长基因组和ORF5基因的进化树分析表明其属于谱系8,而基于Nsp2基因分析表明, 其属于谱系1。经过基因重组分析证实,SHpd1/2018分离株主要是以HP-PRRSV-like强毒株为主要亲本毒,作为病毒骨架,以NDAC30-like毒株为次要亲本毒发生重组而来的变异毒株。其基因骨架序列与HP-PRRSV强毒株的亲缘关系最高,其次是HP-PRRSV弱毒疫苗毒株。除此而外,该毒株还存在大量新的氨基酸突变,其中,Nsp2编码区中发生的突变最多,与HP-PRRSV类毒株和经典毒株相比,Nsp2核苷酸/氨基酸相似性均低于80%,与NADC30毒株的核苷酸/氨基酸相似性也低于90%,推测这些新发生突变的氨基酸可能是PRRSV为了调节其对宿主适应性的一种自我保护的进化策略。结合该毒株在临床上显示出对保育猪具有较强的致病性,提示有必要持续监测临床上PRRSV流行毒株的遗传演化趋势,并有针对性地制定科学的PRRSV防控策略。
4 结论获得1株PRRSV毒株——SHpd1/2018株,系以HP-PRRSV-like为主要亲本毒株,NADC30-like为次要亲本毒株的重组病毒。
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