目前，细菌耐药性问题日益严重，而新型抗生素开发不足，这些现状给畜牧业的发展和公共卫生安全带来了严峻挑战，因此，开发新型的治疗性药物具有重要意义[1]。防御素是一种普遍存在于动植物体内的小分子阳离子抗菌肽，具有广谱的抗菌和抗病毒活性[2]。猪β防御素-2(PBD-2)是猪的12种防御素之一[3]。本实验室前期制备了PBD-2过表达转基因猪和转基因小鼠，证明了这些转基因动物对细菌性和病毒性病原的抵抗力都显著提高，说明PBD-2在动物抗病育种领域具有潜在的应用价值[4-5]。同时，Veldhuizen等[6]通过体外抑菌试验证明PBD-2对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌等常见革兰阴性菌和阳性菌的生长均有显著的抑制作用。重组猪β防御素-2(rPBD-2)作为饲料添加剂，具有促生长和降低仔猪腹泻的效果[7]。Peng等[8]通过测定经酵母表达的rPBD-2对金黄色葡萄球菌、猪链球菌和猪霍乱沙门菌等9种微生物的最小抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)，发现rPBD-2具有广谱的抗菌活性。口服PBD-2可以改善猪的生长性能，减少炎症细胞因子的表达并影响肠道形态[9]。但PBD-2在动物体内对细菌感染的治疗效果未知，其是否具有开发为治疗性药物或抗生素替代品的潜力有待验证。
猪链球菌(Streptococcus suis)是猪的主要细菌性病原之一，并且严重威胁人类健康[10]。猪感染猪链球菌后表现为发热、败血症、脑膜炎、关节炎以及淋巴结肿大等症状，急性感染时死亡率高。人感染猪链球菌后可出现中毒性休克综合征、脑膜炎、败血症、心内膜炎、脊椎炎、眼内炎等。近十年来，猪链球菌病在世界范围内的危害日益严重，我国已成为受到猪链球菌危害最大的国家之一。2005年，我国最大的人猪链球菌病疫情暴发于四川，共造成204人感染和38人死亡[11]。近年来，猪链球菌在我国猪场中的分离率逐渐上升且多产生了广谱耐药性，为猪链球菌病的防控带来了挑战[12]。本研究以猪链球菌为对象，在体外和小鼠体内对PBD-2治疗猪链球菌感染的效果进行了检验，为评估PBD-2成为治疗性药物的潜在价值提供了依据，也为猪的细菌病的防控提供了新思路。
1 材料与方法 1.1 菌株和防御素本研究所用菌株猪链球菌SC-19系于2005年四川暴发的人猪链球菌病疫情中的病猪体内分离，由本实验室鉴定保存。4~6周龄，体重为18~22 g C57雌鼠购自华中农业大学实验动物中心。PBD-2短肽由上海强耀生物有限公司采用固相合成，电喷射质谱鉴定，高效液相色谱法纯化，纯度97.61%，其氨基酸序列为DHYICAKKGGTCNFSPCPLFNRIEGTCYSGKAKCCIR[13]。PBD-2干粉按每管1 mg分装，储存于-80 ℃超低温冰箱，使用前通过PBS溶解，储存液质量浓度为1 mg·mL-1。
1.2 试剂新生牛血清购自杭州四季青材料有限公司；TSA、TSB和LB培养基购自美国BD公司；1640培养基和DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清、青链霉素、丙酮酸和非必需氨基酸购自上海江林生物科技有限公司；CCK-8溶液购自上海东仁化学公司；小鼠IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。
1.3 仪器Centrifuge 5415 R台式高速离心机购自德国Eppentdorf公司；GR60DA GR型立式压力蒸汽灭菌锅购自美国ZEALWAY公司；XM-GTL64型组织研磨仪购自上海净信实业发展有限公司；WD-9405B型水平摇床购自北京市六一仪器厂；HPS-250型生化培养箱、DL-CJ-1 N型超净工作台均购自北京东联哈尔仪器制造有限公司。
1.4 PBD-2体外抑菌活性检测猪链球菌SC-19在含有5%(体积比)牛血清的TSA平板上培养12 h，挑取单菌落，接种于5 mL TSB液体培养基中，置于37 ℃摇床中，180 r·min-1过夜培养。次日按照1%(体积比)比例转接于新的TSB液体培养基中，取对数生长中期的菌液稀释至5×105 CFU·mL-1。然后取10 μL菌液与90 μL不同浓度的PBD-2溶液(25~200 μg·mL-1)灭菌的EP管中混合，37 ℃孵育1 h涂板计数，每种浓度设3个重复。
1.5 PBD-2在体外对猪链球菌的MIC50检测将不同质量浓度的PBD-2溶液(1~512 μg·mL-1)分别加到灭菌的聚苯乙烯96孔板中，不加PBD-2作为生长对照，再加入90 μL猪链球菌SC-19悬液(浓度相当于0.5麦氏比浊标准的猪链球菌SC-19悬液，经LB肉汤1:1 000稀释而成)，密封后置37 ℃摇床孵育16~20 h，用酶标仪测定OD600 nm，根据结果绘制拟合曲线，得出PBD-2对猪链球菌SC-19的MIC50。
1.6 PBD-2的细胞毒性检测将鼠源小鼠巨噬细胞连续传至3代后，通过细胞计数板法对细胞进行计数后，以每孔8 000个细胞(体积100 μL)加入96孔板，放入培养箱中预培养8 h(37 ℃, 5%CO2)后，加入10 μL不同浓度的PBD-2溶液，每种浓度8个重复。同时设置对照组：8 000个细胞(体积100 μL)中加入10 μL细胞培养基(PBD-2浓度为0)，以及空白组：110 μL细胞培养基，对照组和空白组均设8个重复孔。将96孔板继续孵育16 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育3 h后，酶标仪测定OD450 nm。
1.7 小鼠存活率检测为了比较PBD-2不同方式处理对小鼠感染猪链球菌后存活率的影响，将4~6周龄C57小鼠随机分为PBD-2处理组和PBS对照组，每组6只，每只小鼠腹腔注射8×108CFU猪链球菌SC-19进行感染。PBS对照组在感染后1 h注射0.2 mL PBS。PBD-2处理组则又分为预防组、治疗组、两次治疗组、3次治疗组、腹腔治疗组、肌内治疗组和口服治疗组，在注射前后采用0.5 mg·kg-1 PBD-2按下述方式进行处理：PBD-2预防组分别在感染前2 h腹腔注射PBD-2；PBD-2治疗组在感染后1 h腹腔注射PBD-2；PBD-2两次治疗组分别在感染前2 h和感染后1 h腹腔注射PBD-2；PBD-2 3次治疗组分别在感染前2 h、感染后1 h和感染后4 h腹腔注射PBD-2；PBD-2腹腔治疗组、肌内治疗组和口服治疗组分别在感染后1 h通过腹腔注射、肌内注射和口服PBD-2，其中，口服体积为0.1 mL，其余腹腔注射和口服均为0.2 mL。之后连续观察小鼠60 h，统计存活率。试验设计见表 1。
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表 1 小鼠感染猪链球菌SC-19后经PBD-2处理后存活率检测 Table 1 Detection of survival rate of SC-19 infected mice after PBD-2 treatment |
将32只4~6周龄C57小鼠随机分为PBD-2治疗组和PBS对照组，每组16只。所有小鼠腹腔注射2×108 CFU猪链球菌SC-19进行感染，注射量为0.2 mL。PBD-2治疗组分别在感染后1 h注射0.5 mg·kg-1 PBD-2，注射量为0.2 mL，PBS对照组在感染后1 h用0.2 mL PBS处理。在感染后8和21 h每组取8只小鼠眼球抗凝采血，同时，剖杀小鼠取脑、脾、肺组织于研磨仪内研磨成浆液。最后分别取100 μL血液和组织匀浆液，进行梯度稀释和活菌计数，每个稀释度3个重复。对长出的菌落进行PCR鉴定，目标基因为gdh，检测引物，F：5′- GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3′，R：5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′。
1.9 小鼠血清中炎性细胞因子的测定将32只4~6周龄C57小鼠随机分为0.5 mg·kg-1 PBD-2治疗组和PBS对照组，每组16只。所有小鼠腹腔注射2×108 CFU猪链球菌SC-19，注射量为0.2 mL。PBD-2治疗组在感染后1 h注射0.5 mg·kg-1 PBD-2，注射量为0.2 mL，PBS对照组在感染后1 h用0.2 mL PBS处理。在感染后8和21 h每组取8只小鼠眼球非抗凝采血，制备血清，用小鼠ELISA试剂盒检测血清中的IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α含量。
1.10 小鼠组织切片的制作及病理打分将18只4~6周龄C57小鼠随机分为治疗组、PBS对照组和空白组，每组6只。先进行猪链球菌感染，治疗组和PBS对照组小鼠腹腔注射2×108 CFU猪链球菌SC-19，空白组腹腔注射PBS，注射量为0.2 mL；之后采用PBD-2处理，治疗组在感染后1 h注射0.5 mg·kg-1 PBD-2，PBS对照组和空白组在感染后1 h注射PBS，注射量均为0.2 mL。在感染后8和21 h每组剖杀3只小鼠，取脑、脾和肺组织放入组织固定液中固定24 h，制作石蜡切片，进行HE染色，然后根据出现的病理变化进行打分。脑组织损伤打分内容包括海马区神经元固缩深染、皮层神经元肿胀、纤维缠节。肺组织损伤打分内容包括肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、肺泡腔内充满红细胞。脾组织损伤打分内容包括脾小结淋巴细胞坏死、红髓内中性粒细胞增多、红白髓界限不清。每种病变根据严重程度计为0~3分。
1.11 数据的统计分析对于细菌存活率、组织载菌量、炎性细胞因子含量、病理打分等所有定量分析，均使用GraphPad Prism 8软件中未配对的双尾T检验进行统计分析，所有数据均以“x±s”显示。P < 0.05表示具有显著差异(*.P < 0.05；**.P < 0.01；***.P < 0.001)。
1.12 伦理申明所有动物试验均经华中农业大学实验动物监测委员会认可，严格按照“湖北省实验动物护理与使用指南”的建议进行。
2 结果 2.1 PBD-2在体外对猪链球菌的抑菌活性对细菌计数(图 1A)和存活率结果(图 1B)进行统计分析，表明PBD-2质量浓度为25 μg·mL-1时，对猪链球菌SC-19具有显著的抑菌活性(P < 0.05)，并且随着PBD-2浓度升高，对SC-19的抑菌活性增强。因此，PBD-2对猪链球菌在体外有直接抑制作用，该作用与PBD-2浓度正相关。同时，通过微量肉汤稀释法检测了PBD-2对猪链球菌SC-19的MIC，其MIC50值为256 μg·mL-1。
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A. PBD-2对SC-19活菌含量的影响；B. PBD-2对SC-19存活率的影响。*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 A. The effect of PBD-2 on the live bacterial number of SC-19; B. The effect of PBD-2 on the survival rate of SC-19.*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 1 PBD-2在体外对猪链球菌的抑菌活性 Fig. 1 Bactericidal activity of PBD-2 against S. suis in vitro |
用不同质量浓度的PBD-2处理小鼠巨噬细胞后，与对照组相比，细胞的存活率均无显著变化(图 2)，表明PBD-2对RAW细胞无显著的毒性作用。
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图 2 PBD-2对RAW264.7无显著细胞毒性 Fig. 2 PBD-2 showed no cytotoxicity to RAW264.7 cells |
在猪链球菌感染剂量为8×108 CFU时，对照组和PBD-2处理组的小鼠主要在感染后6 h开始出现死亡，集中出现在6~24 h，在感染48 h后小鼠不再死亡。此时统计存活率情况表明，与PBS对照组相比，治疗组显著降低了小鼠感染猪链球菌后的死亡率(图 3A)。进一步研究了PBD-2在不同时间处理对小鼠存活率的影响，结果表明，PBS对照组小鼠存活率为16.7%，预防组小鼠存活率为50%，治疗组小鼠存活率为66.7%。因此，在猪链球菌感染后采用PBD-2处理优于在感染前处理(图 3B)。
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A. PBD-2剂量对小鼠存活率的影响；B. PBD-2预防和治疗对小鼠存活率的影响；C. PBD-2治疗次数对小鼠存活率的影响；D.不同的PBD-2处理途径对小鼠感染SC-19存活率的影响。n=6 A. The does of PBD-2 on survival rate of mice; B. Effects of prevention and treatment with PBD-2 on survival rate of mice; C. Effect of PBD-2 treatment times on survival rate of mice; D. Effects of different PBD-2 treatment pathways on survival rate of mice.n=6 图 3 PBD-2处理对小鼠感染猪链球菌后存活率的影响 Fig. 3 Effect of PBD-2 treatment on survival rate of mice after S. suis infection |
另外，进一步研究了PBD-2治疗次数对小鼠感染猪链球菌后的存活率的影响，统计存活率情况：PBS对照组小鼠存活率为0%，3次治疗组小鼠存活率为50%，2次治疗组和1次治疗组小鼠存活率为33.3%，说明增加PBD-2的治疗次数能够显著降低小鼠死亡率(图 3C)。观察了不同的PBD-2处理途径对小鼠存活率的影响，统计存活率情况：PBS对照组小鼠存活率为16.7%，腹腔注射治疗组小鼠的存活率为50%，口服治疗组小鼠的存活率为33%，肌内注射治疗组小鼠存活率为16.7%，说明腹腔注射治疗组效果最优，其次为口服治疗组，而肌内注射治疗组与对照组相比无显著变化(图 3D)。
2.4 PBD-2对小鼠感染猪链球菌后组织和血液中载菌量的影响猪链球菌以2×108 CFU剂量感染小鼠，分别在感染后8和21 h剖杀小鼠，取小鼠的血液以及完整的脑、脾、肺，组织称重后匀浆，将血液以及组织匀浆稀释后涂平板计数，对计数结果进行统计学分析，如图 4所示。与对照组相比，治疗组小鼠在感染8、21 h后血液和脑、脾、肺组织中的载菌量显著降低(P < 0.05，P < 0.01或P < 0.001)。对血液和组织中分离的疑似SC-19单菌落随机选取部分用PCR鉴定，证明均为SC-19。这些结果说明，PBD-2治疗显著降低了小鼠感染猪链球菌后的血液和组织中的细菌载量。
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A.脑组织细菌载量；B.脾组织细菌载量；C.肺组织细菌载量；D.血细菌载量。n=8;*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 A. Bacterial load in brain tissue; B. Bacterial load in spleen tissue; C. Bacterial load in lung tissue; D. Bacterial load in blood.n=8;*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 4 PBD-2对感染猪链球菌的小鼠组织和血液中载菌量的影响 Fig. 4 Effects of PBD-2 on bacterial load in tissues and blood of mice infected with S. suis |
猪链球菌感染剂量为2×108 CFU时，分别在感染后8和21 h剖杀小鼠，检测血清中的IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α含量。对ELISA结果进行统计学分析，结果见图 5。与对照组相比，治疗组小鼠在感染8 h后血清中IL-6、IL-12和TNF-α水平含量显著降低(P < 0.01)，在感染后21 h血清中IL-6和IL-12水平含量显著降低(P < 0.05)，TNF-α降到检测限以下。IL-1β结果均在检测限以下。这些结果表明PBD-2治疗显著降低了小鼠感染猪链球菌后的炎性细胞因子水平。
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A. IL-6水平；B. IL-12水平；C. TNF-α水平。n=8;*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 A. IL-6 level; B. IL-12 level; C. TNF-α level. n=8;*.P < 0.05;**.P < 0.01;***.P < 0.001 图 5 PBD-2对小鼠感染猪链球菌后的炎性细胞因子水平的影响 Fig. 5 Effect of PBD-2 on inflammatory cytokine levels in mice infected with S. suis |
猪链球菌感染剂量为2×108CFU时，分别在感染后8和21 h剖杀小鼠，取脑、脾和肺组织制作病理切片，根据“材料与方法”中的打分标准进行打分，结果见图 6~8。小鼠感染猪链球菌后肺泡壁增厚、炎性细胞浸润和肺泡腔内充满红细胞(图 6D~F)，脾小结内淋巴细胞坏死、红髓内中性粒细胞增多和红白髓界限不清的现象(图 7D~F)，每只小鼠的组织随机取10个视野，根据病变程度对其打分。结果表明，与对照组相比，PBD-2治疗明显(P < 0.05)降低了小鼠感染猪链球菌21 h后的肺组织(图 8A)和脾组织病变程度(图 8B)。
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A~C.空白组小鼠肺组织切片：未见明显异常；D~F.对照组小鼠肺组织切片：严重的肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、肺泡腔内充满红细胞；G~I.治疗组小鼠肺组织切片：轻微的肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、肺泡腔内含有红细胞 A-C. Blank group lung tissue, no obvious abnormalities; D-F. Control group mouse lung tissue:Severe alveolar wall thickening, inflammatory cell infiltration and alveolar cavity filled with red blood cells; G-I. Treatment group mouse lung tissue:Mild alveolar wall thickening, inflammatory cell infiltration and red blood cells in the alveolar cavity 图 6 PBD-2对小鼠感染猪链球菌21 h后的肺组织病理变化的影响(200×) Fig. 6 Effect of PBD-2 on pathological changes in lung tissue of mice infected with S.suis 21 h post infection(200×) |
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A~C.空白组小鼠脾组织切片：未见明显异常；D~F.对照组小鼠脾组织切片：严重的脾小结淋巴细胞坏死，红髓内中性粒细胞增多，红白髓界限不清；G~I.治疗组小鼠脾组织切片：轻微的脾小结淋巴细胞坏死 A-C. Blank group lung tissue, no abnormalities; D-F. Control group mouse spleen tissues:Severe splenic nodular lymphocyte necrosis, increased neutrophils in the red pulp, unclear red and white pulp boundaries; G-I. Treatment group mouse spleen tissues:Mild splenic nodular lymphocyte necrosis 图 7 PBD-2对小鼠感染猪链球菌21 h后的脾组织病理变化的影响(100×) Fig. 7 Effect of PBD-2 on pathological changes in spleen tissue of mice infected with S.suis 21 h post infection(100×) |
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A.肺组织损伤打分；B.脾组织损伤打分 A. Lung tissue leision score; B. Spleen tissue lesion score 图 8 PBD-2对小鼠感染猪链球菌21 h后的肺和脾组织损伤打分(n=3) Fig. 8 Effect of PBD-2 on injury score in lung and spleen tissue of mice infected with S.suis 21 h post infection(n=3) |
随着养殖业的发展，细菌病治疗过程中的抗生素耐药性问题日益严重，我国从2020年开始在饲料中全面禁止添加抗生素[14]。全世界范围内的禁抗、限抗给畜牧养殖中疾病的防控和动物生产性能的提高带来了挑战，因此，开发替代传统抗生素的安全、高效的新型抗菌剂已是全球共识性优先课题[15]。抗微生物肽(antimicrobial peptides, AMPs)在新型抗生素替代品研究中已展现出显著优势，其在抗细菌病相关应用的效果已被证实[16]。例如，天然防御肽IDR-1002和IDR-HH2可以有效抑制结核分枝杆菌的生长和减轻小鼠肺部病理变化[17]，抗菌肽NZ2114治疗能够有效提高小鼠感染猪链球菌后的存活率[18]。目前，猪中只发现了β-防御素，这些防御素富含阳离子和半胱氨酸，在抗微生物感染和先天免疫中起到了重要作用，其中，PEP-2C、PBD-1、PBD-2和PBD-3已被证明具有抗菌活性[19]。PBD-2是猪表达的β防御素之一，最早报道于2008年，在体外对肠道菌有广谱杀菌活性，对猪的红细胞溶血活性低，耐盐性强[6]。此后，有研究表明口服PBD-2可以改善猪的生长性能，减少炎症细胞因子的表达并影响肠道形态指标[9]。本实验室前期研究表明，PBD-2过表达转基因猪对胸膜肺炎放线杆菌的抵抗力显著提高[4]。此外，PBD-2在体外和转基因小鼠中均可抑制伪狂犬病病毒的增殖[20]。这些结果证明了PBD-2在动物抗感染过程中发挥了积极作用，但PBD-2是否在治疗性药物和抗生素替代品开发领域具有应用价值尚未证实。猪链球菌病是由致病性链球菌引起的一类人畜共患的急性热性传染病，给我国畜牧养殖业和公共卫生安全都造成了严重危害[21]。本研究以猪链球菌为对象，评价了PBD-2对猪链球菌体外的抑菌效果和感染小鼠后的治疗效果。
在体外试验中，本研究的结果证明了PBD-2对猪链球菌具有显著的杀菌作用，表现出剂量依赖性。此前，Peng等[8]报道了经酵母表达的rPBD-2对金黄色葡萄球菌、猪链球菌和猪霍乱沙门菌等9种微生物菌株都有抑制作用。本实验室也曾检测了PBD-2对保存的20种从猪场分离鉴定的病原菌的杀菌活性，表明PBD-2具有广谱的抗菌活性(数据未发表)。目前，人们普遍认为防御素是通过细胞膜损伤和细胞内作用两种方式起到抗菌作用。经典的理论证实，防御素的正电荷可与细菌细胞膜上带负电荷的磷脂分子形成静电吸附，进而在细胞膜上成孔导致膜的结构损坏，从而导致细菌死亡[22]。同时，越来越多的研究发现，部分防御素也可靶向细菌胞内蛋白，抑制细菌的DNA、RNA和蛋白质的合成，进而破坏病原菌正常的生命活动[23]。PBD-2已被证明不仅能破坏细菌细胞膜[6]，也能影响细菌大量基因的表达[24]，可能存在更加丰富的抗菌机制。
在PBD-2的治疗效果体内评价中，本研究用小鼠感染模型，从致死率、小鼠组织和血液中的载菌量、炎性细胞因子变化和组织病理变化程度几个方面，证明了PBD-2对猪链球菌感染具有治疗作用。试验过程中发现PBD-2的治疗效果受治疗剂量的影响。在探索PBD-2有效治疗剂量的预试验中，当以8×108CFU的SC-19感染小鼠时，0.5 mg·kg-1 PBD-2治疗组显著降低了感染猪链球菌小鼠的死亡率，而2 mg·kg-1 PBD-2治疗组仅在感染后6~24 h减缓了小鼠的死亡速度，最终小鼠的存活率没有明显变化(试验结果未展示)。同时，较高剂量的PBD-2对猪链球菌感染的治疗作用也不明显，这表明抗菌肽的治疗效果可能与剂量有关。类似的现象在已有研究中也有报道。例如，高剂量的人嗜中性粒细胞肽HNP-1对硫酸葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的小鼠结肠炎具有双剂量依赖性作用：高剂量HNP-1(100 μg·d-1)于腹膜内给药会加重小鼠的结肠炎，而低浓度HNP-1(5 μg·d-1)处理小鼠后促炎细胞因子的表达水平显著降低，表现出结肠炎的减轻[25]。从萝卜中提取的防御素RsAFP2能够抑制白色念珠菌生物膜的形成，并且和抗真菌药物联用能够起到抗生物膜特异性协同效应，但这种效果只有在低剂量RsAFP2(2.5~10.0 μg·mL-1)时才有效[26]。因此，在PBD-2进一步作为治疗性药物的研究过程中，需注意掌握有效剂量。
本研究中PBD-2治疗显著降低了小鼠感染猪链球菌后的脑、肺、脾组织和血液中的细菌载量，这可能是PBD-2的直接杀菌作用导致细菌减少。其他研究也有类似发现，例如乙型肝炎病毒核心蛋白D-HBcARD治疗可以显著降低小鼠感染金黄色葡萄球菌后的血液、肝和脾中的细菌含量[27]。本研究还证明PBD-2治疗显著降低了小鼠感染猪链球菌后的炎性细胞因子水平。小鼠在感染猪链球菌后，巨噬细胞及树突状细胞均可产生炎性因子，还可刺激内皮细胞，形成更多的趋化因子和炎性因子，进而引起机体急性炎症反应，造成小鼠死亡。“炎症因子风暴”也是猪链球菌造成人中毒性休克综合征并致死的主要机制[28]。从已有的报道和本实验室研究结果来看，PBD-2除了具有直接杀菌作用导致细菌减少外，还可能通过抑制炎症来保护动物免受炎症反应损伤。Han等[29]通过直肠注射的方法将PBD-2注入到化学试剂葡聚糖硫酸钠(DSS)造成的溃疡性结肠炎的小鼠中，发现PBD-2可以通过抑制NF-κB信号通路的激活而对结肠炎发挥其抗炎作用。本实验室研究发现与野生型小鼠相比，PBD-2转基因小鼠体内由鼠伤寒沙门菌和LPS诱导的炎症反应显著减轻，并且在PBD-2稳定表达的细胞上证明了PBD-2是通过与TLR4相互作用干扰NF-κB信号通路，从而下调LPS导致的炎症反应[13]。因此，PBD-2对细菌病的治疗作用可能是通过直接的杀菌作用和抑制机体过度的炎性反应两个方面来保护受到细菌感染的动物。
在最近的十几年中，包括AMPs在内的小肽类药物的研发已取得较多的研究进展，AMPs在预防和控制动物疾病中发挥了重要作用[30-31]。在畜牧养殖中，菌丝霉素源抗菌肽对奶牛乳腺炎有较好的治疗效果，该抗菌肽在体外能显著抑制奶牛中金黄色葡萄球菌的生长，在体内能显著降低促炎因子IL-6和TNF-α的水平[32]。在母猪饲料中添加猪防御素和果蝇抗菌肽组成的复合AMPs可以有效降低母猪产死胎率，并且可以通过母乳将免疫活性因子传递给仔猪，提高仔猪免疫力[33]。本研究表明, PBD-2在体外对猪链球菌具有抑制作用，并且无显著的细胞毒性作用。在体内，PBD-2对感染猪链球菌的小鼠具有保护作用。PBD-2作为仅存在于猪中的天然防御素，理论上不会有产生耐药性的担忧。因此，PBD-2作为一种天然广谱抗菌肽在预防和治疗动物传染病中有良好的应用前景，通过进一步改造，具有部分替代抗生素的可能性。关于PBD-2的进一步应用还存在着一些制约因素[7]，例如体外高效表达和稳定性问题尚需解决，抗菌活性也可通过氨基酸改造进一步提高。此外，其作用机制研究刚刚起步，除对细胞膜的破坏从而杀死细菌之外，它还能作用于真核细胞内受体，并对细菌中不同的基因表达产生影响[24]，其在治疗过程中与动物机体的相互作用机制和安全性等方面也需要进一步的研究。
4 结论PBD-2在体外对小鼠巨噬细胞无毒性作用，对猪链球菌具有抑菌活性，并且抑菌效果随PBD-2的浓度升高而增强。PBD-2治疗显著降低了小鼠感染猪链球菌后的死亡率、组织和血液载菌量、炎性细胞因子水平和组织病变程度。PBD-2具有进一步开发为治疗性药物的价值。
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