恒定链(invariant chain, Ii)又名CD74，属于Ⅱ型跨膜蛋白。Ii在内质网合成后转运至内吞体，最后转运到细胞膜表面。其在不同的位置具有不同的生物学功能[1-2]：在内质网中参与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ类分子的装配、成熟和转运，在内吞体协助MHCⅡ类分子进行抗原肽加工和提呈，而在细胞膜表面作为细胞因子或者病毒的受体[3-6]。研究发现，Ii参与了B细胞介导的外源性抗原递呈，在特异性抗感染免疫中起重要作用[7]。此外，Ii的N端结构域还影响B细胞受体信号的转导[8]。B细胞表面Ii/MHCⅡ复合物能靶向结合抗原簇B细胞受体(antigen-clustered B-cell-receptors, BCR)，促进其信号在细胞内的转运[9]。笔者课题组之前发现Ii的活性片段可携带抗原肽在细胞内吞体中与MHCⅠ类和Ⅱ类分子分别共定位和互相结合，参与抗原递呈[10]。这个特性使以Ii活性片段为载体的疫苗可以直接进入内吞体途径，易化了抗原在细胞内的转运[11]。为此，以Ii活性片段为载体的疫苗被广泛研究和应用[12-13]。
Rab是介导蛋白分子在细胞内转运的分子家族，自1983年以来已报道了60余个Rab蛋白，它们分布于真核细胞所有与浆膜相关的细胞器(如细胞核、高尔基体和内吞体等)，在细胞器间转运活性蛋白过程中起重要作用[14]。前期研究发现，Rab5a具有结合Ii并在早期内吞体中共定位的特性[15]。Rab7b是一种溶酶体定位的单核细胞特异性小GTPase[16]，在哺乳动物中主要定位于晚期内吞体、溶酶体和高尔基体。其不仅参与胞内活性蛋白从早期内吞体到晚期内吞体/溶酶体的转运，而且还是内吞体到高尔基体或/和跨高尔基体系统(trans-Golgi network, TGN)的重要调节蛋白[17-20]。
迄今为止，尽管已明确Ii在不同细胞器表现出不同功能，但是除了知道其C端位点在迁移中起作用[21]，但协助Ii迁移的活性分子却不清楚。为此，本研究探索了cRab7b与Ii在晚期内吞体中共定位和互相结合的特性，以及影响这种定位于结合的关键性氨基酸。这将为进一步丰富Ii在胞内的转运机制，以及为以Ii及其活性片段为载体疫苗的研究提供新的途径。
1 材料与方法 1.1 主要试验材料PCR plus mix、DNA Marker DL2000、限制性内切酶和蛋白Marker购自东盛生物公司(广州)；T4连接酶购自东洋纺公司(日本)；转染试剂lip8000购自碧云天公司(上海)；DH5ɑ感受态细胞购自天根生物公司(北京)；广谱彩虹预染蛋白Marker购自康为世纪公司(北京)；质粒提取和胶回收试剂盒购自捷倍斯公司(广州)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)和DMEM培养基购自Hyclone公司(美国)；镍柱、Gluttathione Sepharose 4B柱和电化学发光(electrogenerated chemiluminescence, ECL)试剂盒购自GE公司(瑞士)；细胞核染色4′, 6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride，DAPI)购自Promega公司(北京)；抗体LAMP1(小鼠，ab208943)和FITC荧光标记的IgG(H+L)(兔，4412S)二抗购自CST公司(美国)；其他小鼠抗GFP、RFP和His的一抗和相应山羊抗鼠的二抗购自中杉金桥公司(北京)；重组质粒pmCherry-C1、pEGFP-C1、pEGFP-C1-cIi、PGEX-4T-1、PET32a-cIi、鼠巨噬细胞系Raw264.7、人胚胎肾细胞系293 T细胞和大肠杆菌(E. coli)Rostta(DE3)菌株由本实验室保存。
1.2 引物的设计与合成参照GenBank登录的鸡Rab7b(cRab7b)(ID：XM_001235015)和鼠Rab7b(mRab7b)基因(ID：XM_006529430)序列，设计4对扩增和1对突变引物用于扩增目的基因片段(表 1)。
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表 1 试验用引物序列和重组质粒 Table 1 The sequences of primers used in this study |
以自行设计的引物(表 1)和实验室保存的鸡和鼠的cDNA为模板，用PCR分别扩增并构建鸡和小鼠的Rab7b的真核和原核重组表达质粒。PCR反应体系：Plus Mixs(10 μL)、上、下游引物(20 μmol·mL-1)各0.2 μL、模板(200 μg·mL-1)0.1 μL，加ddH2O至终体积20.0 μL。PCR反应程序：热变性94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、30个循环，最后72 ℃延伸8 min。扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，并用凝胶DNA回收试剂盒回收备用。经凝胶回收的鸡Rab7b(cRab7b)和鼠Rab7b(mRab7b)片段分别与空质粒经以下酶切体系(质粒≤1 500 ng、限制性内切酶各1.5 μL、缓冲液3.0 μL，加ddH2O至终体积30.0 μL，37 ℃ 1 h反应)进行双酶切，酶切后(基因片段与质粒)产物再经T4DNA连接酶连接构建成重组质粒(见表 1)。最后，所有重组质粒先经PCR初步鉴定，再送徐州通用生物公司测序。
以构建的重组质粒pmCherry-C1-cRab7b为模板，应用重叠延伸法构建突变体cRab7b的突变体cRab7bQ67L。即以cRab7b的F和R1(表 1)为上下游扩增第一段，F1和cRab7b的R为上下游扩增第二段。以回收到的两段DNA为模板，用cRab7b的F和R引物扩增突变体cRab7bQ67L。PCR、酶切、重组质粒的构建和鉴定方法同上。
1.4 鸡和小鼠Rab7b的同源性比对和分析应用分子生物学软件DNAStar 4.0、Clustal X 4.0和GeneDoc 3.2对蛋白分子的同源性进行比对和分析。
1.5 真核转染、免疫荧光和激光共聚焦观察在24孔细胞培养板中，用含10%FBS的完全培养基DMEM稀释细胞，按1×105个·孔-1的密度将Raw264.7细胞置孔底盖玻片上，37 ℃，5 % CO2培养18~24 h，然后将重组质粒pmCherry-C1-cRab7b、pmCherry-C1-mRab7b和pmCherry-C1-cIi分别转染细胞。继续培养24 h后用PBS清洗。4%多聚甲醛固定10 min后，PBS洗3次。用含5 %山羊血清和0.3%的Triton-100混合液在室温进行封闭1 h。PBS洗3次，按照1:100浓度加入鼠抗LAMP1抗体孵育过夜，PBS洗3次，按照1:100浓度加入FIT C标记的抗鼠IgG抗体，孵育2 h后弃上清，用PBS清洗3次。加入DAPI作用10 min，PBS清洗4次后封片，在激光共聚焦显微镜下观察。转染和观察方法同陈芳芳等[10]的操作。
1.6 关联重组质粒共转染和共定位观察按上述“1.5”中的条件(细胞密度、培养基和培养条件)培养293T细胞，重组质粒pmCherry-C1-cRab7b和pmCherry-C1-mRab7b分别与pEGFP-C1-cIi混合后共转染细胞。24 h后在激光共聚焦显微镜下观察Rab7b与Ii在细胞内的共定位。转染方法参照陈芳芳等[10]操作。
1.7 原核重组菌的蛋白表达与鉴定经鉴定正确的原核重组质粒pGEX-4T-1-cRab7b、pGEX-4T-1-cRab7bQ67L、pET-32a-cIi和其对照的空载体pGEX-4T-1和pET-32a分别转染感受态细菌Rosetta(DE3)，构建5个重组菌Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7b、Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7bQ67L、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi、Rosetta(DE3)pGEX-4T-1、Rosetta(DE3)pET-32a。鉴定后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG)0.5 mmol·L-1，16 ℃诱导表达24 h。离心收集菌体用180 W，5 s，间隔10 s超声波破碎菌体，12 000 g离心15 min，上清中的蛋白用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行电泳和染色观察。
1.8 原核蛋白的纯化与拉下法(Pull-down)检测蛋白结合由Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7b、Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7bQ67L和Rosetta(DE3)pGEX-4T-1表达的GST/cRab7b、GST/cRab7bQ67L和GST蛋白用GST亲和层析柱(glutathione sepharose 4B)进行纯化。由Rosetta(DE3)pET-32a-cIi和Rosetta(DE3)pET-32a表达的His/cIi和His蛋白用结合His标签的镍柱进行纯化。纯化方法参照谭红黎等[15]。纯化的蛋白GST/cRab7b、GST/cRab7bQ67L或GST加入镍柱，作为锚定蛋白锚定在柱上，然后分别加入纯化的His/cIi或His，孵育1 h，用不同浓度梯度的咪唑洗脱。洗脱后的蛋白用SDS-PAGE和Western blot方法进行检测。
1.9 免疫印迹将上述洗脱液收集后，经过SDS-PAGE凝胶电泳，使复合物解离，再用半干法转印到尼龙膜上，小牛血清封闭1 h，加入按照1:5 000稀释的小鼠抗His抗体孵育过夜，次日用山羊抗鼠IgG抗体孵育1 h后用电化学发光(electrogenerated chemiluminescence, ECL)显色方法检测。
2 结果 2.1 目的基因的克隆与鉴定首先，用自行设计的引物(表 1)分别克隆cRab7和mRab7b基因片段，并构建了突变体cRab7bQ67L。在琼脂糖凝胶电泳中(图 1)，3个基因片段的大小分别为624、624和600 bp(图 1，泳道2、3和4)，与预期大小一致。将它们分别插入到真核表达载体中，构建3个真核(pmCherry-C1-mRab7b、pmCherry-C1-cRab7b和pmCherry-C1-cRab7bQ67L)和2个原核(pGEX-4T-1-cRab7b和pGEX-4T-1-cRab7bQ67L)重组表达质粒载体。经测序表明这些重组质粒均含相应DNA序列。
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M. DNA相对分子质量标准; 1. cRab7b; 2. cRab7bQ67L; 3. mRab7b M. DNA marker; 1. cRab7b; 2. cRab7bQ67L; 3. mRab7b 图 1 PCR扩增Rab7b及其突变体cRab7bQ67L Fig. 1 Amplification of Rab7b and its mutant cRab7bQ67L genes by PCR |
应用基因软件DNAstar、Clustal X 4.0和GeneDoc 3.2分析所克隆的cRab7b基因结构，发现其开放阅读框为624 bp，编码208个氨基酸；由于Rab7b分子的C端均含有-Cys-Cys-基序，而Rab7无该结构(图 2)，所以克隆所获得的基因序列是cRab7b。
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黑色背景标记为相同氨基酸，灰色背景标记为部分相同氨基酸。黑三角标记为GTP结合位点，黑五星标记为GTP酶活性位点，黑圆点标记为-C-C-区域，菱形标记为本研究所突变的第67位氨基酸 The same amino acids are in the black background, part of the same amino acid are in the gray background. The black triangles are the GTP binding site, the black five star is the GTP enzyme active site, the black dot is the-c-c-region, and the diamond-shaped mark is the 67th amino acid mutated in this study 图 2 Rab7b及其同源序列比对分析 Fig. 2 Rab7b and its homologous sequence analysis in chicken |
进一步对鸡、小鼠(XP_006529493)、人(AAH17092)Rab7b和鸡Rab7(XP_025010392)分子的氨基酸序列做了同源性分析。结果表明其相似性分别为55%、74%和72 %。此外，在氨基酸序列比对中发现，四种分子结构的大部分氨基酸是相同的(图 2，黑色背景)或部分相同(图 2，灰色背景)，它们的相似性达到了79%，其中，关键位点的氨基酸是相同的，如GTP结合和GTP酶活性位点(图 2，▼、★标记处)。
2.3 鸡Rab7b和Ii在真核细胞中的定位晚期内吞体是Ii胞内转运途径中的重要细胞器，为探明cRab7b在晚期内吞体的定位，本研究在真核转染后用免疫荧光和细胞核染色进行了观察。如图 3所示，红色荧光蛋白(RFP)和RFP/cRab7bQ67L相同，蛋白定位于整个细胞中(图 3e、b，因未彩印，图中未能显示正常颜色，可扫OSID码查看，下图同)，RFP/cRab7b、RFP/mRab7b和RFP/cIi定位于细胞核以外的细胞质内(图 3a、c、d)。这些细胞经免疫荧光染色后，LAMP1被染成绿色，可以清晰观察到细胞内的晚期内吞体(呈绿色荧光)。细胞经DAPI染色后核呈蓝光，经激光共聚焦显微镜进行共定位后可以观察到RFP/cRab7b、RFP/mRab7b和RFP/cIi与LAMP1共定位于晚期内吞体(红色与绿色荧光叠加后呈黄色，见箭头处)(图 3a、c和d)，而RFP和RFP/cRab7bQ67L则不共定位(图 3e、b)。由此表明，cRab7b、mRab7b和cIi可定位于晚期内吞体，cRab7b分子结构中第67位氨基酸在定位中具有关键作用。
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箭头所指为关联分子的共定位。标尺=50 μm The arrows show the co-localization of associated molecules. Bar=50 μm 图 3 鸡RFP/cIi和RFP/Rab7b与LAMP1在真核细胞的共定位(400×) Fig. 3 Colocalization of RFP/cIi and RFP/Rab7b with LAMP1 in eukaryotic cells(400×) |
在确定鸡Rab7b和Ii均定位于晚期内吞体后，为探明Rab7b和Ii在细胞内的共定位特性，将连接红色荧光蛋白基因的重组质粒pmCherry-C1-cRab7b与pEGFP-C1-cIi共转染293T细胞。如图 4的激光共聚焦结果所示，RFP/cRab7b与GFP/cIi定位于细胞内同一部位而在叠加图中呈现黄色(图 4a)，突变体RFP/cRab7bQ67(图 4b)则不能与GFP/cIi共定位；作为对照，RFP/cRab7b与空载体表达的GFP(图 4c)由于分布于细胞的不同部位而不表现共定位(叠加中无黄色)，RFP/cRab7bQ67与GFP对照(图 4c)定位相同。以上结果提示，Rab7b可以在晚期内吞体中与Ii共定位，而突变第67位氨基酸的突变体则丧失在晚期定位的功能。
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箭头所指为关联分子的共定位。标尺=50 μm The arrows show the co-localization of associated molecules. Bar=50 μm 图 4 RFP/Ii和RFP/cRab7b及其突变体RFP/cRab7bQ67L在真核细胞的共定位(400×) Fig. 4 Co-localization of RFP/Ii and RFP/Rab7b and cRab7b Q67L with LAMP1 in eukaryotic cells(400×) |
在明确鸡cRab7b和cIi定位于晚期内吞体后，为探明两者是否结合，将它们的原核表达的蛋白质经亲和层析纯化，然后用拉下法和免疫印迹检测它们的结合关系。重组菌Rosetta(DE3) pGEX-4T-1-cRab7b、Rosetta(DE3) pGEX-4T-1-cRab7bQ67L和Rosetta(DE3) pET-32a-cIi表达产物分别为GST/cRab7b、GST/cRab7bQ67L和His/cIi。然后将其中含GST标签的GST/cRab7b、GST/cRab7bQ67L融合分子作为锚定蛋白(GST吸附于镍柱)，再将His/cIi加入柱中孵育、洗脱和解离。结果发现，在SDS-PAGE(图 5A)中的泳道2、3，解离液中有两条带，它们分别是GST/cRab7b与His/cIi和GST/cRab7bQ67L与His/cIi，其相对分子质量大小分别如下：48.9 [GST(26 ku)/cRab7b(22.9 ku)]和46.8 ku(His/cIi)(泳道2)；48.9 [GST/cRab7bQ67L(22.9 ku)]和46.8 ku (His/cIi)(泳道3)；与相应的His/cIi蛋白质大小一致(泳道1)。由于所有含GST的蛋白均可被吸附镍柱，所以不仅含GST的融合分子(泳道2~5)，而且单一GST(26 ku)(泳道6)均呈现相应条带；同时在有cRab7b或cRab7bQ67L的2和3泳道中，还出现His/cIi条带，但是在对照组单一GST的His/cIi第6泳道中，却因不能结合而没有His/cIi条带。这些表明是cRab7b或cRab7bQ67L而不是GST与His/cIi结合。
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A. SDS-PAGE鉴定经拉下法处理的复合物His/cIi-GST/cRab7b和His/cIi-GST/cRab7bQ67L；B.免疫印迹鉴定经拉下法中处理的His/cIi-GST/cRab7b和His/cIi-GST/cRab7bQ67L复合物，M.蛋白质相对分子质量标准; 1. His/cIi; 2.GST/cRab7b与His/cIi; 3. GST/cRab7bQ67L与His/cIi; 4.GST/cRab7b; 5.GST/cRab7bQ67L; 6. GST与His/cIi A. SDS-PAGE-identification of the complexes of His/cIi-GST/cRab7b and His/cIi-GST/cRab7bQ67L after pull-down; B. Western blot-identification of the complexes of His/cIi-GST/cRab7b and His/cIi-GST/cRab7bQ67Lafter pull-down, M. Protein marker; 2. His/cIi; 3.GST/cRab7b and His/cIi; 4. GST/cRab7bQ67L and His/cIi; 5.GST/cRab7b; 6.GST/cRab7bQ67L; 7. GST and His/cIi 图 5 鉴定GST/cRab7b和GST/cRab7bQ67L与His/cIi的结合 Fig. 5 Identification of binding of GST/cRab7b and GST/cRab7bQ67L with His/cIi |
进一步用免疫印迹法对His/cIi进行了验证。结果表明，凡含有His标签的分子均能被特异性抗His抗体识别(图 5B，泳道1~3)。这进一步明确了图 5B泳道2、3中的分子是被cRab7b或cRab7bQ67L结合的cIi。
3 讨论Rab7b分子结构中与Ii结合和共定位的区域不同。首先，在不同物种间Rab7b蛋白质结构较为保守，与小鼠和人相应序列的相似性分别为74%和72%，有些关键结合位点是相同的，如GTP结合和GTP酶活性位点[17](图 2)。在Rab7b结构中存在不同活性位点，如胞内细胞器定位和与Ii结合。在将小鼠Rab7b的第67位谷氨酰胺(相当于鸡的第74位)突变后，鼠Rab7b的定位将由溶酶体转变为高尔基体[18]。在本研究中，突变体Rab7bQ67L(相当于小鼠的第60位)丧失了在晚期内吞体的定位特性(图 3)，表明该谷氨酰胺是决定Rab7b在细胞内定位的关键氨基酸。但是，这并不影响其与Ii的结合(图 5)，这又提示Rab7b参与了Ii的胞内转运。Ii在免疫细胞的内质网、内吞体和胞膜分别参与MHCⅡ类分子装配和抗原递呈和免疫调节[1, 2, 4]。Ii是典型的多功能免疫分子，而其功能转换却依赖于在胞内的迁移。但是还不清楚其迁移机理。Rab家族分子通过胞吐、胞吞(囊泡转运)方式在不同细胞器间转运蛋白分子。近年来还发现，Rab家族参与了免疫应答的调控作用，因为在活化的免疫细胞中Rab蛋白呈现高水平表达[14]，Rab分子还影响免疫细胞的活性，如Rab11的过表达可改变NK细胞的功能[22]。Rab的转运功能依赖于与靶分子的相互作用，已经发现有的靶分子不仅能够结合单个Rab分子，而且能够同时结合多个不同Rab分子[23]。但是，除了发现Rab分子与Ii共定位[24]外，还不清楚两者之间的关系。在前期的工作中，作者发现Rab5a能够与Ii结合并共定位早期内吞体[15]，而本研究结果进一步表明，Rab7b也能与Ii共定位于晚期内吞体(图 3、4)并结合(图 5)。尽管，尚不清楚这两种Rab分子分别在早期内吞体和晚期内吞体与Ii共定位并结合如何作用于Ii胞内迁移过程，但是为今后进一步探明它们参与Ii转运的机制提供了基础。
4 结论本研究所克隆的鸡Rab7b与小鼠Rab7b的编码氨基酸序列相似性达74%。鸡Rab7b和Ii均定位于真核细胞的晚期内吞体，并且能互相结合。鸡Rab7b的第67位氨基酸被突变后会导致定位改变，但是还能够结合Ii分子。上述结果提示Rab7b参与Ii在细胞内的转运，为探明其在Ii在细胞内转运机制提供了进一步研究的基础。
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