畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (12): 3122-3132. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.12.021    PDF    
引用本文
薛菲, 杨梓纯, 许炎辉, 王娅玲, 喻婷, 樊毛迪, 刘娟华, 高崧, 刘秀梵. 禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(12): 3122-3132.  
XUE Fei, YANG Zichun, XU Yanhui, WANG Yaling, YU Ting, FAN Maodi, LIU Juanhua, GAO Song, LIU Xiufan. Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(12): 3122-3132.  
禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定
薛菲, 杨梓纯, 许炎辉, 王娅玲, 喻婷, 樊毛迪, 刘娟华, 高崧, 刘秀梵     
扬州大学兽医学院, 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 农业部禽用生物制剂创制重点实验室, 扬州 225009
收稿日期：2020-05-18
基金项目：国家自然科学基金(31972711；31672553；31602059)；国家重点研发计划(2017YFD0500705；2017YFD0500203)；扬州大学大学生创新创业训练计划项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)
作者简介：薛菲(1995-), 女, 江苏扬州人, 硕士生, 主要从事APEC外膜蛋白的单克隆抗体研究, E-mail:1162362614@qq.com.
通信作者：高崧, 主要从事动物重要疫病流行病学、致病与免疫机理及防控对策研究, E-mail:gsong@yzu.edu.cn.
摘要：旨在制备禽致病性大肠杆菌(APEC)染色体编码外膜蛋白(cOmpT)的特异性单克隆抗体，本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT，经IPTG诱导表达后，获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT，利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT，并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法，最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL-1，最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合，采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体，分别命名为1G8、2C3和2G3，均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示，3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应，而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达，对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定，结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是83DQDWMDS89、90SNPGTW95和197TFKYSGW203。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。
关键词：禽致病性大肠杆菌    cOmpT    单克隆抗体    抗原表位    
Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies
XUE Fei, YANG Zichun, XU Yanhui, WANG Yaling, YU Ting, FAN Maodi, LIU Juanhua, GAO Song, LIU Xiufan     
Key Laboratory of Avian Bioproducts Development of Ministry of Agriculture, Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Corresponding author: GAO Song, E-mail:gsong@yzu.edu.cn.
Abstract: To development monoclonal antibodies against cOmpT of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), the recombinant cOmpT of APEC origin expression plasmid pET-28a-compT was employed, and cOmpT protein with a molecular weight about 36 kD in the form of inclusion bodies was obtained after induction with IPTG, and then renatured by urea gradient dialysis. BALB/c mice were immunized with the purified cOmpT. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) was developed, the optimal coating concentration of the antigen was 0.625 μg·mL-1 and the optimal serum dilution was 1:6 400. After the fourth immunization, the spleen of immunized mice was collected for cell fusion, three monoclonal hybridomas that can secrete antibody specific to cOmpT were obtained after multiple screenings, named 1G8, 2C3 and 2G3 respectively. And all of their immunoglobulin subclasses were IgG2b. The titers of monoclonal antibodies in the cell culture supernatant were 1:200, 1:3 200 and 1:3 200 determined by iELISA, respectively. All three monoclonal antibodies were confirmed to react with cOmpT in Western blot, without cross reaction with other tested bacteria. The antigenic epitopes recognized by the three monoclonal antibodies were identified by using a series of E. coli strains harboring expression plasmids recombined with truncated fragments from compT gene. The results revealed that the antigenic epitope required for reactivity with the 1G8 was 83DQDWMDS89, and 90SNPGTW95, 197TFKYSGW203 were recognized by 2C3 and 2G3, respectively. In this study, three monoclonal antibodies against cOmpT were successfully developed and the antigenic epitopes recognized by the antibodies were identified. The cOmpT specific monoclonal antibodies obtained in this study are potentially useful tools for both the functional study of cOmpT and the development of APEC epitope vaccines.
Key words: APEC    cOmpT    monoclonal antibody    antigenic epitope    

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)是一种寄生在禽类肠道及黏膜表面、可引起局部或全身性感染的病原菌[1]，属于肠道外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)，是禽大肠杆菌病的主要病原菌[2]。APEC分布较广，给养禽业带来了较大经济损失[3]，同时，也给食品安全造成威胁[4-5]。外膜蛋白T(outer membrane protease T, OmpT)属大肠杆菌外膜蛋白，是APEC的毒力因子之一，在细菌表面发挥黏附素和侵袭素的功能[6]，它具有很好的免疫原性，更容易被抗原提呈细胞识别，具有一定的研究价值[7]。APEC E058株的OmpT由位于染色体的compT基因和位于质粒的pompT基因分别编码，两者相似性高于70%[8]。

目前，禽大肠杆菌病严重制约了养禽业的发展，而以抗生素为主的传统预防和治疗手段效果不佳[9]，因而疫苗免疫成为控制禽大肠杆菌病的有效手段之一。Wiertz等[10]研究发现，大肠杆菌外膜蛋白疫苗能激活机体淋巴细胞的增殖，从而促进巨噬细胞对抗原的摄取和吞噬，并刺激机体免疫应答。上述疫苗不但对同源菌株具有免疫保护作用，而且对异源菌株具有交叉免疫保护作用[11]。因此，禽大肠杆菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制具有一定的应用前景。外膜蛋白在禽大肠杆菌病的致病、免疫中均有作用，针对该蛋白的单克隆抗体对研究其功能不可或缺，同时也为开发禽大肠杆菌外膜蛋白亚单位疫苗提供了标准的检测试剂。

本研究通过对重组表达菌pET-28a-compT进行诱导表达、纯化后免疫小鼠，制备出APEC cOmpT的单克隆抗体，并对其抗原表位进行了鉴定，为cOmpT蛋白生物学功能的研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及细胞 　　原核表达载体pET-28a、骨髓瘤细胞系SP2/0均由扬州大学农业部禽用生物制剂创制重点实验室保存；重组表达菌株pET-28a-compT、APEC E058株、缺失株E058Δ100%compT::cat、缺失株E058Δ100%pompT::cat、回复株ReE058Δ100%compT::cat-compT、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌均由本实验室保存。

1.1.2 实验动物 　　6~8周龄BALB/c雌鼠、ICR小鼠均购自扬州大学比较医学中心。

1.1.3 主要试剂 　　Tryptone(胰蛋白胨)、Yeast extract(酵母提取物)均购自OXOID公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、考马斯亮蓝染色液、TMB显色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG均购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100× HT培养基、50× HAT培养基均购自Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、DMSO、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒均为Sigma公司产品；T4 DNA连接酶、XhoⅠ限制性内切酶、NcoⅠ限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化 　　将实验室保存的含pET-28a-compT重组表达菌涂布在(Kan)LB琼脂平板上培养，挑单菌落接入(Kan)LB液体培养基中过夜培养，以1%的接种量转接到500 mL(Kan)LB液体培养基中，待OD600 nm达到0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，37 ℃继续培养6 h后收集菌液。使用超声波裂解仪对诱导表达的菌液进行冰浴超声裂解，12 000 r·min-1离心15 min，分别取其菌体以及离心后的上清与沉淀进行蛋白表达形式分析。若为包涵体表达，则采用尿素梯度透析复性法[12]对其进行纯化，通过SDS-PAGE电泳法检测蛋白纯度，再用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，分装，置-70 ℃冰箱保存。

1.2.2 动物免疫 　　取重组蛋白，对6~8周龄BALB/c雌鼠进行背部皮下免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂，并用生物组织匀质器充分乳化蛋白；后续两次加强免疫用弗氏不完全佐剂；细胞融合前3 d加强免疫，不加佐剂，采用生理盐水混合抗原腹腔注射同体积的蛋白溶液。

1.2.3 间接ELISA检测方法的建立 　　采用方阵滴定法，将纯化后的cOmpT蛋白分别稀释至5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL-1的浓度包被，小鼠血清以1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400、1:12 800稀释，酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP作1:8 000稀释。其他步骤按常规ELISA程序[13]进行，以此确定最适抗原包被浓度和血清最适稀释度。

1.2.4 细胞融合及筛选 　　将SP2/0细胞和脾细胞按比例进行融合，3次间接ELISA筛选后，选择只与重组蛋白cOmpT反应而不与载体蛋白反应的阳性孔进行2~3次亚克隆，对效价高、生长状态好的阳性单克隆孔进行扩增，获得能稳定分泌cOmpT抗体的杂交瘤细胞株。

1.2.5 单抗亚类鉴定 　　按照Sigma公司单抗亚类鉴定试剂盒说明书操作，鉴定单抗亚类。

1.2.6 Western blot鉴定 　　以cOmpT作为待检抗原，以PBS稀释的杂交瘤细胞培养上清(1:3 000)作为一抗，以封闭液稀释的HRP标记羊抗鼠IgG(1:5 000)作为二抗，进行Western blot鉴定[13]。

1.2.7 单抗特异性鉴定 　　将亲本株APEC E058、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌进行复苏鉴定，采用间接ELISA法检测单克隆抗体与受检菌的反应性。获得的裂解全菌经灭活后包被酶标板，以3株单克隆抗体作为一抗，进行间接ELISA，读取OD450 nm值。

1.2.8 交叉反应性鉴定 　　将亲本株APEC E058、缺失株E058Δ100%compT::cat、缺失株E058Δ100%pompT::cat和回复株ReE058Δ100%compT::cat-compT进行复苏鉴定，上述裂解全菌进行SDS-PAGE检测，通过Western blot测定单克隆抗体的交叉反应性。

1.2.9 抗原表位的初步定位 　　以去信号肽的compT基因为模板，按照不同细胞外环对应的氨基酸序列，分别设计引物，每对引物上下游插入XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点，PCR扩增片段分别命名为compT A (1-156 bp)、compT B (157-375 bp)、compT C (376-570 bp)、compT D (571-729 bp)和compT E (571-894 bp)。经酶切后分别连接至原核表达载体pET-28a，将鉴定正确的阳性质粒进行诱导表达。以截短表达蛋白作为抗原，以单克隆抗体1G8、2C3和2G3作为一抗，根据抗原抗体在Western blot中的结合反应对cOmpT抗原表位进行定位。

1.2.10 抗原表位的精确定位 　　初步确定3株单克隆抗体各自针对的抗原表位区域后，采用相同的方法将片段compT B和compT D继续截短(图 1)，并进行原核表达以及Western blot分析。

图 1 compT B和compT D截短片段示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the truncated fragments of compT B and compT D

1.2.11 抗原表位分析 　　利用CLC Sequence Viewer 8软件对重组蛋白cOmpT和pOmpT的氨基酸序列进行比对分析。

2 结果 2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化

2.1.1 重组质粒的鉴定 　　对重组菌株pET-28a- compT进行PCR扩增鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果(图 2)显示片段大小与预期大小一致。基因测序结果表明构建的pET-28a-compT中compT基因序列与NCBI公布的序列相同。

M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1. pET-28a-compT M. DL5000 DNA marker; 1. pET-28a-compT 图 2 pET-28a-compT的PCR鉴定结果 Fig. 2 PCR identification of pET-28a-compT

2.1.2 重组蛋白的诱导表达 　　对诱导表达并超声裂解后的全菌以及离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果显示重组蛋白cOmpT以包涵体形式存在，蛋白质相对分子质量大小与理论值一致，约为36 ku(图 3)。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.裂解全菌；2.裂解上清；3.裂解沉淀 M. Protein marker; 1. Lyse of whole bacteria; 2. Cleavage supernatant; 3.Cleavage precipitation 图 3 cOmpT表达形式的鉴定 Fig. 3 Identification of the expression form of cOmpT

2.1.3 重组蛋白的纯化 　　利用尿素梯度透析法复性后的cOmpT只出现一条清晰的条带，如图 4。用BCA蛋白浓度测定试剂盒对cOmpT蛋白浓度进行测定，蛋白质量浓度为1 mg·mL-1，-70 ℃冰箱保存备用。

M.蛋白质相对分子质量标准；1. cOmpT M. Protein marker; 1. cOmpT 图 4 cOmpT的纯化结果 Fig. 4 Purification of cOmpT
2.2 间接ELISA方法的建立

方阵试验结果表明，当抗原质量浓度为0.625 μg·mL-1、血清稀释度为1:6 400时，阳性血清OD450 nm最接近1.0(表 1)，并且P/N的值最大。因此，最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL-1，最适血清稀释度为1:6 400。

表 1 最适抗原包被浓度及最适血清稀释度的确定(OD450 nm) Table 1 Determination of optimal antigen concentration and optimal serum dilution (OD450 nm)
2.3 小鼠血清效价的检测

以确定的cOmpT蛋白浓度包被酶标板，用间接ELISA方法检测小鼠4次免疫后血清效价。检测结果表明3只免疫鼠均能够达到细胞融合的要求(图 5)，选择血清效价最高的小鼠，对其加强免疫后进行细胞融合。

图 5 4次免疫后的小鼠血清效价 Fig. 5 Serum titer of cOmpT specific antibody in mice after the fourth immunization
2.4 细胞融合与筛选

取杂交瘤细胞上清进行间接ELISA检测，多次筛选排除假阳性孔，得到3个生长良好的细胞孔，分别命名为1G8、2C3和2G3，均与cOmpT蛋白反应而不与pET-28a载体蛋白反应(表 2)。

表 2 杂交瘤细胞筛选的OD450 nm值 Table 2 The OD450 nm value screened by hybridoma cells
2.5 抗体效价鉴定

将这3株杂交瘤细胞连续传15代，用间接ELISA法检测其分泌抗体的效价。结果显示3株杂交瘤细胞仍能稳定分泌抗体，但是1G8的细胞上清抗体效价偏低，为1:200；而2C3和2G3的细胞上清抗体效价均为1:3 200(表 3)。

表 3 杂交瘤细胞上清的抗体效价 Table 3 The antibody titers in the supernatant of the hybridoma cells
2.6 单抗亚类鉴定

按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒方法进行亚类鉴定，3株杂交瘤细胞上清为一抗。间接ELISA结果显示，3株杂交瘤细胞分泌的单抗亚类均为IgG2b。

2.7 Western blot鉴定

Western blot鉴定(图 6)显示，3株杂交瘤细胞分泌的抗体均能与重组蛋白cOmpT发生特异性反应，不与pET-28a载体蛋白反应。

M.蛋白质相对分子质量标准；1. cOmpT; 2. pET-28a M. Protein marker; 1. cOmpT; 2. pET-28a 图 6 3株单抗的反应性鉴定 Fig. 6 Reactivity of 3 monoclonal antibodies in Western blot
2.8 单抗特异性鉴定

以亲本株APEC E058、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门菌的裂解全菌包被酶标板，采用间接ELISA法检测cOmpT单抗的特异性。结果显示，3株单克隆抗体的特异性较好，均不与其他受检菌发生反应(图 7)。

图 7 单抗特异性鉴定 Fig. 7 Specificity of monoclonal antibodies
2.9 交叉反应性鉴定

Western blot结果显示，亲本株APEC E058、回复株ReE058Δ100%compT::cat-compT的反应均有两条带，与缺失株E058Δ100%compT::cat的反应只出现了pOmpT蛋白大小的唯一条带，与缺失株E058Δ100%pompT::cat的反应也只出现了cOmpT蛋白大小的唯一条带(图 8)。这3株单克隆抗体不仅能识别cOmpT，也能识别pOmpT，具有良好的交叉反应性。

M.蛋白质相对分子质量标准；1. APEC E058; 2. E058Δ100%compT::cat; 3. E058Δ100%pompT::cat; 4. ReE058Δ100%compT::cat-compT M. Protein marker; 1. APEC E058; 2. E058Δ100%compT::cat; 3. E058Δ100%pompT::cat; 4. ReE058Δ100%compT::cat-compT 图 8 Western blot分析 Fig. 8 Western blot analysis
2.10 抗原表位鉴定

2.10.1 抗原表位的初步定位 　　由图 9可见：1G8、2C3与cOmpT B发生反应，2G3与cOmpT D、cOmpT E均反应。由于重组蛋白cOmpT E针对的基因序列包含cOmpT D针对的基因序列，可缩小范围，2G3的抗原表位初步定位在cOmpT D。另外，1G8、2C3的抗原表位初步定位在cOmpT B上。

M.蛋白质相对分子质量标准; 1. cOmpT A; 2. cOmpT B; 3. cOmpT C; 4. cOmpT D; 5. cOmpT E M. Protein marker; 1. cOmpT A; 2. cOmpT B; 3. cOmpT C; 4. cOmpT D; 5. cOmpT E 图 9 抗原表位的初步定位 Fig. 9 Preliminary identification of the antigenic epitope recognized by three monoclonal antibodies

2.10.2 抗原表位的精确定位 　　根据抗原表位的初步定位结果分析，将compT B和compT D基因作进一步地截短表达，Western blot结果显示，单抗1G8与cOmpT B1、cOmpT B2、cOmpT B3均反应，而不与cOmpT B4发生特异性结合反应(图 10A)，可推断1G8针对的抗原表位位于compT B3、compT B4基因片段之间差异的21 bp，对应表位为83DQDWMDS89；单抗2C3仅与cOmpT B4发生特异性结合，与cOmpT B5、cOmpT B6、cOmpT B7均不反应(图 10B)，推断2C3针对的抗原表位位于compT B4、compT B5基因片段之间差异的18 bp，对应表位为90SNPGTW95；单抗2G3与cOmpT D、cOmpT D1发生阳性反应，不与cOmpT D2、cOmpT D3反应(图 10C)，推断2G3针对的抗原表位位于compT D1、compT D2基因片段之间差异的21 bp编码肽段，即197TFKYSGW203。

M.蛋白质相对分子质量标准；1. cOmpT B1; 2. cOmpT B2; 3. cOmpT B3; 4、5. cOmpT B4; 6. cOmpT B5; 7. cOmpT B6; 8. cOmpT B7; 9. cOmpT D; 10. cOmpT D1; 11. cOmpT D2; 12. cOmpT D3 M. Protein marker; 1. cOmpT B1; 2. cOmpT B2; 3. cOmpT B3; 4, 5. cOmpT B4; 6. cOmpT B5; 7. cOmpT B6; 8. cOmpT B7; 9. cOmpT D; 10. cOmpT D1; 11. cOmpT D2; 12. cOmpT D3 图 10 1G8(A)、2C3(B)、2G3(C)抗原表位的精确定位 Fig. 10 Exact identification of antigenic epitope recognized by monoclonal antibody 1G8 (A), 2C3 (B) and 2G3 (C)
2.11 抗原表位分析

为了分析cOmpT单克隆抗体所识别抗原表位的保守性，将重组蛋白cOmpT和pOmpT氨基酸序列进行比对分析。结果表明，本研究鉴定的cOmpT蛋白表位90SNPGTW95和pOmpT的90SNPGTW95完全一致，具有高度保守性；而83DQDWMDS89和197TFKYSGW203两个表位基序具有相对保守性(图 11)。

图 11 cOmpT表位序列比对分析 Fig. 11 Analysis of the antigenic epitopes of cOmpT
3 讨论

禽大肠杆菌病是目前最为严重的家禽细菌性疾病之一，世界各地的养禽业均受到严重危害。APEC属于ExPEC，而大多数ExPEC菌株也是人类病原体[14]。已有研究表明，人类和禽类ExPEC有一定的相似性，APEC与ExPEC具有部分共有毒力基因，可通过禽类及其产品传播给人类[15]。因此，APEC是一种潜在的人兽共患病原[16-17]。外膜蛋白酶T(OmpT)位于大肠杆菌外膜，已有多篇报道证明其具有较高的免疫原性，可以诱导机体产生抗体，并且具有免疫保护作用[18-19]。根据流行病学分析，发现compT和pompT两个基因在APEC分离株有着较高的检出率。陈娟[8]推测compT和pompT与APEC致病性有关，采用动物感染模型，对致病性大肠杆菌的致病因子进行直观评价，与野生株相比，compT和pompT基因缺失突变株对鸡的毒力均下降[20]。俱雄[21]发现大肠杆菌外膜蛋白OmpC具有很好的免疫保护作用，能够有效抵抗大肠杆菌对机体的感染，因此，设计了大肠杆菌OmpC蛋白表位疫苗，但是其免疫学功能仍待进一步验证[22]；佟春玉等[18]发现大肠杆菌外膜蛋白rOmpT具有较好的免疫原性，表明rOmpT可作为大肠杆菌亚单位疫苗候选蛋白。本实验室将APEC E058菌株的compT插入原核表达载体pET-28a，导入宿主菌E. coli BL21 (DE3)，成功构建出重组表达菌株pET-28a-compT。前期对蛋白最佳诱导条件进行了摸索，但多次试验结果显示均以包涵体形式进行表达。采用尿素梯度透析法进行纯化，获得了纯度较高的重组蛋白cOmpT，并以此作为免疫原。

单克隆抗体只针对单一抗原决定簇，单抗具备纯度高、特异性好的优势[23-25]，包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与克隆化以及单克隆抗体的大量生产。虽然单克隆技术已经非常成熟，但是整个制备过程较长，影响因素较多，稍有不慎可能就会导致实验失败。首先，抗原纯度越高越有可能制备出特异性强、效价高的抗体[26]。其次，选择合适的免疫方案十分关键，免疫剂量、免疫方法均可能影响单克隆抗体的质量[27]。细胞融合是最重要的环节，每一步操作都可能影响到细胞的融合率和阳性率，需格外谨慎。本研究用杂交瘤细胞技术成功筛选出3株单克隆抗体，均能特异性识别cOmpT，并且不与其他受检菌反应。最常用的免疫检测法是间接ELISA，简单、易操作且特异性强。

多项研究表明，禽大肠杆菌外膜蛋白亚单位疫苗具有研究前景。表位疫苗作为亚单位疫苗的一种，是以抗原表位为基础设计并制备的疫苗，既能够有效地被免疫系统识别、递呈并诱发免疫，又能减少存在于灭活疫苗中与免疫无关的成分[28]。抗原表位又称抗原决定簇，是指抗原分子上能够刺激机体产生抗体并且能够被识别的区域[20]。与传统疫苗相比，表位疫苗具有很多优点：安全性高、稳定性强、产量高、免疫效果好等[29]。随着抗原表位研究方法的日益完善，表位疫苗的研究得到了一定的发展，已经成为疾病防治的热点，具有很大的开发应用前景[30]。为了研究已制备的单克隆抗体针对的抗原表位是否存在差异，本研究通过原核表达系统对compT基因进行多次截短表达，采用间接ELISA和Western blot法检测单克隆抗体与不同截短表达蛋白的反应，以此对cOmpT抗原表位进行鉴定。由结果可知3株单克隆抗体针对cOmpT不同表位。将pOmpT的氨基酸序列与cOmpT的表位序列进行比对，发现表位90SNPGTW95具有高度保守性；而83DQDWMDS89和197TFKYSGW203这两个表位基序具有相对保守性。上述结果进一步地证实了单抗交叉反应性鉴定结果的可靠性。

4 结论

获得重组蛋白cOmpT，成功制备出3株具有良好特异性的单克隆抗体，并对其抗原表位进行了鉴定，所得单克隆抗体为cOmpT蛋白生物学功能的研究和APEC新型表位疫苗的研发奠定了基础。

参考文献
[1] CROXEN M A, FINLAY B B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(1): 26–38.
[2] WANG X R, WEI L Y, WANG B, et al. Complete genome sequence and characterization of avian pathogenic Escherichia coli field isolate ACN001[J]. Stand Genomic Sci, 2016, 11: 13.
[3] LANDMAN W J M, VAN ECK J H H. The incidence and economic impact of the Escherichia coli peritonitis syndrome in Dutch poultry farming[J]. Avian Pathol, 2015, 44(5): 370–378.
[4] CORDONI G, WOODWARD M J, WU H H, et al. Comparative genomics of European avian pathogenic E. Coli (APEC)[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 960.
[5] MITCHELL N M, JOHNSON J R, JOHNSTON B, et al. Zoonotic potential of Escherichia coli isolates from retail chicken meat products and eggs[J]. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(3): 1177–1187.
[6] ZHU Z M, DONG C F, WENG S P, et al. Identification of outer membrane protein TolC as the major adhesin and potential vaccine candidate for Vibrio harveyi in hybrid grouper, Epinephelus fuscoguttatus (♀)×E. lanceolatus (♂)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 86: 143–151.
[7] VAN GOOR A, STROMBERG Z R, MELLATA M. A recombinant multi-antigen vaccine with broad protection potential against avian pathogenic Escherichia coli[J]. PLoS One, 2017, 12(8): e0183929.
[8] 陈娟.禽致病性大肠杆菌E058株compT、pompT基因突变株的构建及其致病性评价[D].扬州: 扬州大学, 2016.
CHEN J. Construction of compT, pompT knockout mutants of in avian pathogenic E. coli E058 and evaluation their pathogenicity[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2016. (in Chinese)
[9] GYLES C L. Antimicrobial resistance in selected bacteria from poultry[J]. Anim Health Res Rev, 2008, 9(2): 149–158.
[10] WOOLEY R E, SPEARS K R, BROWN J, et al. Relationship of complement resistance and selected virulence factors in pathogenic avian Escherichia coli[J]. Avian Dis, 1992, 36(3): 679–684.
[11] 高崧, 吴晓东, 张扬, 等. 禽大肠杆菌外膜蛋白、脂多糖疫苗的免疫保护试验[J]. 中国兽医学报, 2002, 22(5): 457–459.
GAO S, WU X D, ZHANG Y, et al. Immunogenicity of oil-emusified outer membrane proteins and lipopolysaccharides of Escherichia coli against homologous challenge[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2002, 22(5): 457–459. (in Chinese)
[12] 俱雄, 陈春琳, 刘祥, 等. 重组大肠埃希菌外膜蛋白C的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 陕西理工学院学报:自然科学版, 2015, 31(3): 52–57.
JU X, CHEN C L, LIU X, et al. Expression, purification and polyclonal antibody preparation of recombinant E. coli outer membrane protein OmpC[J]. Journal of Shaanxi University of Technology: Natural Science Edition, 2015, 31(3): 52–57. (in Chinese)
[13] 赵冬.猪圆环病毒3型回顾性调查与cap蛋白单克隆抗体的研制[D].扬州: 扬州大学, 2018.
ZHAO D. Retrospective survey of porcine circovirus type 3 in Jiangsu province and development of monoclonal antibodies against cap proteins of PCV3[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2018. (in Chinese)
[14] JOHNSON J R, RUSSO T A. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli:"The other bad E.coli"[J]. J Lab Clin Med, 2002, 139(3): 155–162.
[15] STOKHOLM N M, PERMIN A, BISGAARD M, et al. Causes of mortality in commercial organic layers in Denmark[J]. Avian Dis, 2010, 54(4): 1241–1250.
[16] TIVENDALE K A, LOGUE C M, KARIYAWASAM S, et al. Avian-pathogenic Escherichia coli strains are similar to neonatal meningitis E. coli strains and are able to cause meningitis in the rat model of human disease[J]. Infect Immun, 2010, 78(8): 3412–3419.
[17] EWERS C, LI G, WILKING H, et al. Avian pathogenic, uropathogenic, and newborn meningitis-causing Escherichia coli:how closely related are they?[J]. Int J Med Microbiol, 2007, 297(3): 163–176.
[18] 佟春玉, 李润婷, 呼瑞, 等. 重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究[J]. 中国预防兽医学报, 2013, 35(8): 658–662.
TONG C Y, LI R T, HU R, et al. Evaluation of the imunoprotection induced by recombinant OmpT protein of Escherichia coli in mice[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2013, 35(8): 658–662. (in Chinese)
[19] 赵铁.尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T致病相关的功能研究[D].广州: 南方医科大学, 2012.
ZHAO T. Function of the pathopoiesia about outer membrane protein T of Uropathogenic Escherichia coli[D]. Guangzhou: Southern Medical University, 2012. (in Chinese)
[20] 孙娟, 王愉涵, 刘艳, 等. 抗原表位鉴定方法的研究进展[J]. 国外医学(医学地理分册), 2017, 38(3): 291–295.
SUN J, WANG Y H, LIU Y, et al. Research advances in the identification methods of antigen epitope[J]. Foreign Medical Sciences (Section of Medgeography), 2017, 38(3): 291–295. (in Chinese)
[21] 俱雄.大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析[D].汉中: 陕西理工学院, 2016.
JU X. Prokaryotic expression and immunogenicity analysis of E. coli outer membrane protein OmpC[D]. Hanzhong: Shaanxi University of Technology, 2016. (in Chinese)
[22] 俱雄, 党亚锋, 刘祥, 等. 大肠杆菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位多肽疫苗的重组预测[J]. 河南农业大学学报, 2017, 51(1): 94–100.
JU X, DANG Y F, LIU X, et al. Bioinformatic analysis of E. coli OmpC and recombinant prediction of epitope peptide vaccine[J]. Journal of Henan Agricultural University, 2017, 51(1): 94–100. (in Chinese)
[23] SKOWICKI M, LIPIŃSKI T. The development of methods for obtaining monoclonal antibody-producing cells[J]. Postepy Hig Med Dosw (Online), 2016, 70: 367–379.
[24] LITTLE M, KIPRIYANOV S M, LE GALL F, et al. Of mice and men:hybridoma and recombinant antibodies[J]. Immunol Today, 2000, 21(8): 364–370.
[25] GAO Y L, HUANG X X, ZHU Y B, et al. A brief review of monoclonal antibody technology and its representative applications in immunoassays[J]. J Immunoassay Immunochem, 2018, 39(4): 351–364.
[26] 闫慧丽, 席俊, 高学梅, 等. 抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性[J]. 浙江农业学报, 2016, 28(5): 748–752.
YAN H L, XI J, GAO X M, et al. Preparation of monoclonal antibodies against Gly m Bd 28K and identification of their immunological properties[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2016, 28(5): 748–752. (in Chinese)
[27] 曹智刚, 易立, 程悦宁, 等. 抗犬瘟热病毒核蛋白单克隆抗体的制备及其线性抗原表位鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2017, 39(7): 578–582.
CAO Z G, YI L, CHEN Y N, et al. Preparation and identification of linear epitope of monoclonal antibodies against Canine distemper virus N protein[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2017, 39(7): 578–582. (in Chinese)
[28] 李健, 余传信. 表位疫苗的研究进展[J]. 中国热带医学, 2007, 7(9): 1681–1684.
LI J, YU C X. Advance in the research of epitope vaccine[J]. China Tropical Medicine, 2007, 7(9): 1681–1684. (in Chinese)
[29] MOISE L, MCMURRY J, RIVERA D S, et al. Progress towards a genome-derived, epitope-driven vaccine for latent TB infection[J]. Med Health R I, 2007, 90(10): 301–303.
[30] 王新军, 张兆松. 表位疫苗:疫苗研制新策略[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2004, 22(6): 365–367.
WANG X J, ZHANG Z S. Epitope vaccine:a new strategy for vaccine development[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2004, 22(6): 365–367. (in Chinese)