2. 中国农业科学院上海兽医研究所, 农业农村部动物寄生虫学重点实验室, 上海 200241
2. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture/Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China
鸡球虫病是由多种艾美耳球虫(Eimeria)寄生于鸡肠道不同部位引起的一种细胞内原虫病，主要损害鸡的肠道，并在全球范围内造成了严重的经济损失[1]，其中，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是致病最为严重和流行最广泛的一种[2]。为了减少球虫病对养鸡业的危害，自20世纪50年代起, 用抗球虫复合药物防治球虫病普遍流行起来[3]，但是由于球虫的耐药性频现，加上研制新药周期长、药物残留和环境污染等原因，寻求新的防治球虫病方法迫在眉睫。实现新方法的途径包括疫苗、生物技术、遗传等[4]，其关键之一就是要找到一个良好的疫苗候选分子靶标。
延伸因子(elongation factor，EF)是在真核生物和原核生物mRNA翻译时促进多肽链延伸的蛋白质因子。原核细胞延伸因子有3种，分别为热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable，EF-Tu)、热稳定延伸因子(elongation factor thermo stable，EF-Ts)以及延伸因子G(elongation factor G，EF-G)；真核细胞的延伸因子也有3种，分别称为eEF1α、eEF1β和eEF2。其中，eEF1α是主要的一种与真核生物mRNA翻译相关的因子，EF1α·GTP复合物可以催化氨酰tRNA结合到核糖体的A位点。EF1α不仅参与蛋白翻译过程，而且还具有其他功能。EF1α参与许多重要的细胞过程和疾病，包括信号传导、翻译控制、凋亡、细胞骨架组成、病毒复制及癌基因转化等[5]，例如在褐飞虱中延伸因子1α基因在卵巢、卵、血淋巴唾液腺和中肠及脂肪体中高表达，并在其羽化后表达量持续增高，进行干扰后褐飞虱的存活率呈下降趋势[6]。对其他原虫(弓形虫和布氏锥虫)的研究发现延伸因子可能参与了虫体的生长发育[7-8]。作者推测柔嫩艾美耳球虫延伸因子1α(EtEF1α)可能参与调控球虫入侵宿主细胞和在宿主细胞内发育繁殖的过程，因此本文对EtEF1α的特性进行了初步研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物、虫株与细胞上海三黄鸡用于球虫繁殖扩增，接种用球虫株为柔嫩艾美耳球虫上海株(资源号：CAAS2111160721)，该虫株由中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病创新团队球虫病学实验室分离保存；免疫试验所用的新西兰大白兔(雄兔)购自上海甲干生物科技有限公司；实验动物均在上海兽医研究所所属上海松江动物房清洁级动物饲养房饲养。试验中所用到的鸡胚成纤维细胞(DF-1)由上海兽医研究所水禽病毒病团队丁铲研究员馈赠。
1.2 试剂TRIzol、RNase-free DNase I(TaKaRa)；2×Taq PCR Master Mix(康为世纪)；M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)；RNA easy Mini Kit、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)；限制性内切酶：EcoRⅠ和XhoⅠ(美国NEB)；T4 DNA连接酶、pGEM®-T easy Vector(Promega)；DNA相对分子质量标准Marker D(100~2 000 bp)、X-Gal、Top10感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞(上海生工生物工程股份有限公司)、Vybrant TM CFDA SE Cell Tracer Kit(CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂)(Invitrogen)。
1.3 柔嫩艾美耳球虫4个阶段虫体的收集、纯化以及cDNA的获得根据韩红玉等[9]的方法纯化卵囊。用新鲜收集的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(SO)4×104个·只-1经口嗉囊接种2~3周龄的三黄鸡，收集接种后6~8 d的粪便和盲肠，初步进行卵囊收集后，一部分经饱和盐水漂浮和次氯酸钠氧化纯化获得干净的未孢子化卵囊(UO)，另一部分在28 ℃有氧条件下培养孢子化，当孢子化率达到90%后，收集孢子化卵囊(SO)。子孢子(Spz)是利用纯化后的孢子化卵囊消化脱囊后通过体外砂芯漏斗过滤获得[9-10]。14日龄鸡接种孢子化卵囊，感染115 h后收集盲肠，利用percoll试剂通过差速离心法收集纯化第二代裂殖子(Mrz)[11]。
虫体发育4个阶段(UO、SO、Spz、Mrz)总RNA的提取采用TRIzol法并根据说明书的步骤进行操作；通过SuperScript Ⅲ RT试剂盒反转录总RNA获得互补DNA第一链(cDNA)。
1.4 EtEF1α基因扩增与生物信息学分析根据EtEF1α(GenBank登录号：NW_013544198.1)的cDNA全长序列，用Primer Premier 5引物设计软件根据EtEF1α(1 353 bp)开放阅读框设计相应的含酶切位点并能扩增完整ORF序列的引物，根据后续试验所需，上、下游引物选用限制性内切酶EcoRⅠ(UP)和XhoⅠ(LP)，根据设计结果选择如下引物用于扩增，UP: 5′-GCGAATTCGGGCCACCATGGCAGCGTCTTTGGTTGT-GGAG-3′(EcoRⅠ)和LP: 5′- GCCCTCGAGATGAACACTCTGACAAAGACGCC -3′(XhoⅠ)进行扩增，扩增后的产物作为目的片段，连接pGEM-T easy载体；16 ℃连接5 h后，转到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并将其均匀涂到含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，同时加入4 μL的IPTG溶液以及40 μL的X-gal溶液进行蓝白斑筛选。培养16 h后，挑取白色的单菌落，扩大培养后进行PCR鉴定，鉴定正确后送去公司进行测序。
利用ExPASy网站上的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)预测EtEF1α的相对分子质量和理论等电点；根据NCBI上的BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对蛋白序列，推测其功能；使用计算工具SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测编码蛋白有无信号肽，使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测编码蛋白有无跨膜结构。采用Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析蛋白质基序[12]。
1.5 构建原核重组表达质粒及表达重组蛋白选用pGEX-4T-1为表达载体，使用EcoRⅠ和XhoⅠ分别对目的基因及表达载体在37 ℃条件下双酶切40 min，之后用1%的琼脂糖凝胶电泳观测其双酶切程度，用胶回收试剂盒对产物进行纯化。连接后转入大肠杆菌感受态细胞Top10，挑取单菌落培养后测序；测序正确后，将重组表达质粒pGEM-4T-EtEF1α转到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中扩大培养，在LB液体培养基中培养，当OD值为0.6~1.0时加入1‰的IPTG，分别在0、4、8和24 h取出等体积菌液，SDS-PAGE观察蛋白是否表达，并通过超声分析蛋白表达形式，最后根据文献[13]中提供的方法进行蛋白纯化。
1.6 兔抗rEtEF1α多克隆抗体的制备取经弗氏完全佐剂乳化的rEtEF1α蛋白200 μg皮下注射新西兰大白兔(雄兔)；1周后，向兔皮下注射经弗氏不完全佐剂乳化的rEtEF1α蛋白进行第二次免疫；之后每隔1周对实验动物进行免疫，方法与二免相同，总共进行3次加强免疫；最后一次免疫1周后，收集动物的血液，37 ℃孵育2 h，然后在4 ℃放置4 h；将血液在3 500 r·min-1离心12 min，小心收集上清，加入终浓度为0.01%的叠氮化钠后分装，即为获得的多克隆抗体；将其置于-40 ℃保存。
1.7 rEtEF1α反应原性分析将rEtEF1α进行SDS-PAGE后，使用Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统进行半干转；转膜结束后，将PVDF膜放置于2.5%的脱脂乳-PBS溶液中进行封闭，条件为37 ℃孵育2 h；封闭结束后，孵育一抗，分别加入兔抗子孢子全蛋白多克隆抗体以及鼠抗GST标签单克隆抗体，兔阴性血清作为阴性对照，在37 ℃条件下孵育2 h；按照1:10 000的比例稀释二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)或HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，室温条件下在摇床上缓慢振荡孵育1 h；PBS洗涤后，使用蛋白电泳免疫印迹系统进行成像。
1.8 EtEF1α在柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段转录、翻译水平的分析基因转录水平分析选用荧光定量PCR方法，以18S rRNA为参照，检测EtEF1α在虫体UO、SO、Spz、Mrz 4个阶段的mRNA转录水平。以该4个阶段的虫体cDNA第一链为模板，利用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒对EtEF1α在虫体4个阶段的转录水平进行检测。使用ABI 7500荧光定量PCR以对样本进行扩增。反应程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，进行40个循环；添加熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。扩增结束后对数据进行处理，得出结论。
对EtEF1α的翻译水平的分析选用Western blot方法，首先提取4个阶段虫体的全蛋白:吸取适量体积纯化后的UO、SO、Spz、Mrz于1.5 mL离心管中，加入300 μL RIPA强裂解液和3 μL蛋白酶抑制剂，其中，在UO、SO的离心管中加入等体积的玻璃珠(710-1, 180 μm)，于涡旋振荡器振荡加好试剂的离心管2 min，然后在冰盒上放置30 s，重复该操作40 min；12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，上清液即为4个阶段虫体全蛋白；最后取少量虫体蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白的质量，同时用BCA试剂盒检测蛋白的浓度。根据蛋白的浓度，调整4个阶段蛋白的上样量，使终浓度保持一致；转膜、封闭，一抗分别孵育鼠抗α-Tubulin单克隆抗体、兔抗rEtEF1α的多克隆抗体，α-Tubulin作为参照，然后孵育相应抗性的二抗，照膜，并对条带进行灰度分析。
1.9 EtEF1α在虫体不同发育阶段的分布定位间接免疫荧光技术用于研究EtEF1α蛋白在虫体Spz、Mrz以及细胞内不同时期虫体的分布情况。收集Spz、Mrz的虫体，将虫体均匀地涂在飞片上，在通风橱内风干；为了观察蛋白在细胞内虫体不同时期的分布，以每孔20万的数量将DF-1细胞分至放有细胞飞片的6孔板内，37 ℃无菌培养；细胞培养1 d后，取新鲜提取的Spz，按照每孔60万的数量计数，然后将Spz放在15 mL离心管中，加入CM完全培养基孵育2 h，离心，按照计数的体积加入到6孔板内；6孔板内提前换为含有5%的双抗的培养基，之后于30 min、24 h、48 h、72 h取出六孔板。将飞片中加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，室温固定30 min；加入1% Triton®X-100通透25 min；加入1 mL 2% BSA/PBS溶液，4 ℃封闭2 h；加入1 mL兔抗rEtEF1α多克隆抗体(1:100比例稀释)，37 ℃孵育2 h；将Alexa FluorTM 488鸡抗家兔IgG绿色荧光标记抗体用稀释液按照1:200的比例稀释，加入1 mL，37 ℃下避光孵育1 h；避光操作，将DAPI染料按照1:200稀释，加入1 mL，室温条件下孵育16 min；封片：滴一滴抗荧光淬灭剂在载玻片上，抠出飞片倒扣于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察并拍照。
1.10 分泌试验参考Péroval等[14]提出的分泌试验方法，验证EtEF1α是否是分泌型的蛋白，并验证是否是由微线体分泌的。首先将新鲜提取的柔嫩艾美耳球虫子孢子(4×106)重悬于100 μL完全培养基(CM)中，加入5、10、20 μmol·L-1的十字胞碱或相应体积的DMSO[12]，并在41 ℃ 5% CO2培养箱中孵育至少2 h；在2 800 r·min-1下离心10 min沉淀子孢子，收集上清液。利用Western blot分析蛋白质分泌情况，一抗分别孵育兔抗rEtEF1α或兔抗rEtMIC2多克隆抗体。微线体分泌型蛋白——柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(EtMIC2)作为阳性对照[15]。
1.11 兔抗rEtEF1α多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响按照本实验室前期建立的体外入侵方法[16]检测兔抗rEtEF1α多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响。试验前1 d按照每孔2×105的DF-1细胞放入24孔板中，37 ℃培养；提取新鲜子孢子，用CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂对子孢子进行荧光标记；之后加入10 mL含有10%胎牛血清和5%双抗的DMEM培养基悬浮子孢子，并按照50、100、200、300和400 μg·mL-1的质量浓度加入兔抗rEtEF1α多克隆抗体IgG，以健康兔IgG作为阴性对照，不加任何IgG的子孢子用作空白对照，37 ℃孵育2 h；孵育后，换用含有2%胎牛血清和5%双抗的DMEM培养基重悬子孢子，然后加入到细胞中，培养9 h；收集细胞，加入200 μL PBS悬浮，然后使用流式细胞检测仪来计数子孢子的入侵率；入侵率的计算公式：
入侵抑制率=(1-孵育重组蛋白抗体虫体的入侵率/空白对照入侵率)×100%
2 结果 2.1 生物信息学分析将PCR扩增产物连接至pGEM-T easy载体、转化后，经菌液PCR鉴定正确后送公司测序，将测序正确的序列与已知序列利用BLAST工具进行比对，结果与已知基因序列ETH_00010290(Eimeria tenella elongation factor 1-alpha, related)(GenBank: XM_013379330.1)的比对结果为100%一致，表示该基因被成功克隆，我们将其命名为EtEF1α。使用相关软件分析，结果显示：该基因的ORF序列为1 353 bp，编码450个氨基酸，预测相对分子质量为49.1 ku，等电点为4.7；该基因编码的蛋白质无信号肽和跨膜结构域；结构分析发现其含有1个N-糖基化位点(位点位置：303—306)，1个ATP/GTP A基序结合位点(P环)(位点位置：14—21)，6个酪蛋白激酶II磷酸化位点(位点位置：88—91、107—110、158—161、216—219、305—308和318—321)，6个N-肉豆蔻酰化位点(位点位置：105—110、121—126、246—251、264—269、425—430和436—441)，7个蛋白激酶C磷酸化位点(位点位置：18—21、53—55、305—307、358—360、372—374、379—381和382—384)，1个硫酸腺苷酸转移酶亚基1(位点位置：1—450)，1个延伸因子Tu(位点位置：2—433)，另一个延伸因子Tu(位点位置：1—432)，1个翻译起始因子2亚单位γ(位点位置：1—428)，1个结合GTP的延伸因子信号区(位点位置：61—76)，1个延伸因子Tu的GTP结合位点(位点位置：5—227)，1个延伸因子Tu结构域2(位点位置：249—316)，1个延伸因子Tu的C-末端结构域(位点位置：323—431)，1个GTPase未知功能区(位点位置：8—156)(图 1)。
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灰色背景: N-糖基化位点; 双下划线: ATP/GTPA基序结合位点; 波浪线:酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点; 黄色背景: N-肉豆蔻酰化位点; 方框:蛋白激酶C磷酸化位点; 引号:硫酸腺苷酸转移酶亚基1;红色字体:延伸因子Tu; 加粗:另一个延伸因子Tu; 括号:翻译起始因子2亚单位γ; 虚线方框:结合GTP的延伸因子信号区; 方括号:延伸因子Tu的GTP结合位点; 斜体：延伸因子Tu结构域2；下划线:延伸因子Tu的C-末端结构域; 大括号：GTPase未知功能区；星号:终止子 Gray background: N-glycosylation site; Double underline: ATP/GTP-binding site motif A (P-loop); Wavy line: Casein kinase II phosphorylation site; Yellow background: N-myristoylation site; Box: Protein kinase C phosphorylation site; Quotation mark: Sulfate adenylyltransferase subunit 1; Red font: Elongation factor Tu; Bold: Another elongation factor Tu; Brackets: Translation initiation factor 2 subunit γ; Dotted box: GTP-binding elongation factors signature; Square brackets: Elongation factor Tu GTP binding domain; Italics: Elongation factor Tu domain 2; Underlined: Elongation factor Tu C-terminal domain; Brace: GTPase of unknown function; Asterisk: Terminator 图 1 EtEF1α基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatic analysis of EtEF1α cDNA and deduced amino acids |
BLAST比对结果显示，该基因编码的氨基酸序列与毒害艾美耳球虫延伸因子1α(XP_013440853.1)具有98%(432/440)的相似性；与堆型艾美耳球虫延伸因子1α(XP_013247767.1)具有96%(423/440)的相似性；与巨型艾美耳球虫延伸因子1α(XP_013336300.1)具有95%(417/440)的相似性；与圆孢子球虫延伸因子蛋白(OEH74529.1)具有95%(418/440)的相似性；以及与刚地弓形虫ME49延伸因子1α(XP_002369268.1)具有85%(374/442)的相似性。
2.2 重组蛋白rEtEF1α的时相、条件表达及蛋白纯化当原核表达重组质粒pGEX-4T-EtEF1α构建成功后，提取重组质粒转染大肠杆菌BL21感受态细胞后进行诱导表达重组蛋白。将菌液扩大培养到目标OD值后，加入IPTG进行诱导表达，并收集4个时间段的菌液对蛋白表达情况进行分析。图 2A为rEtEF1α时相表达结果，其中1~4泳道分别为重组蛋白在0、4、8以及24 h蛋白表达情况，可以看出成功表达出大小约为75 ku的rEtEF1α蛋白(与预测蛋白加上GST标签后大小一致)。为了进一步分析重组蛋白的表达形式，根据时相表达结果，我们选择4 h这个时间点进行表达，通过改变温度或IPTG的浓度来摸索蛋白最佳表达的形式，图 2B结果表明，rEtEF1α主要以包涵体形式存在。对蛋白进行切胶纯化，纯化后的蛋白见图 2C。
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A. rEtEF1α的时相表达; B. rEtEF1α的条件表达; C. rEtEF1α的纯化; M.蛋白质相对分子质量标准; 1~4. 0、4、8以及24 h蛋白表达情况; 5.上清; 6.沉淀; 7.纯化后的rEtEF1α A. Time course analysis of rEtEF1α; B. Conditional expression of rEtEF1α; C. Purification of rEtEF1α; M. Protein marker; 1-4. Prorein expressed in 0, 4, 8 and 24 h; 5. Supernatant; 6. Precipitation; 7. Purified protein of rEtEF1α 图 2 重组蛋白rEtEF1α的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein rEtEF1α |
将重组蛋白rEtEF1α进行SDS-PAGE，转膜后分别使用稀释100倍的兔阴性血清、稀释1 000倍的鼠抗GST单克隆抗体以及稀释100倍的兔抗子孢子全蛋白多克隆抗体一抗孵育，分别使用HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)相应二抗孵育后，用Bio-rad凝胶成像系统拍照(图 3)。结果显示，阴性对照中无条带(图 3泳道1)，而在用GST单克隆抗体以及兔抗子孢子全蛋白多克隆抗体作为一抗的膜上出现了75 ku大小以及其他小于75 ku的条带，可能是该蛋白在纯化过程中发生了降解(图 3泳道2、3)，说明重组蛋白rEtEF1α的反应原性良好，可以用于后续多克隆抗体的制备及相关试验的展开。
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M.蛋白质相对分子质量标准; 1.一抗为阴性血清; 2.一抗为GST标签单抗; 3.一抗为兔抗子孢子多克隆抗体 M. Protein marker; 1. rEtEF1α was probed with the naive rabbit serum; 2. rEtEF1α was probed with the monoclonal anti-GST antibody; 3. rEtEF1α was probed with the anti-sporozoite rabbit serum 图 3 rEtEF1α的反应原性分析 Fig. 3 Reactogenicity of rEtEF1α |
为了分析柔嫩艾美耳球虫EtEF1α mRNA在虫体不同发育阶段的转录水平，以管家基因18S rRNA为标准，以纯化后的柔嫩艾美耳球虫4个阶段(UO、SO、Spz、Mrz)的cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR技术，采用2-ΔΔCt公式计算了4个基因在虫体不同发育阶段的相对表达量，结果显示，EtEF1α的mRNA转录水平在4个发育阶段存在较为明显的差异，并且该基因mRNA在感染期Spz阶段转录水平最高，Mrz阶段次之，在UO和SO阶段都比较低(图 4)。
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UO.未孢子化卵囊；SO.孢子化卵囊；Spz.子孢子；Mrz.裂殖子。柱上不同字母表示差异显著，P < 0.05 UO. Unsporulated oocyst; SO. Sporulated oocyst; Spz. Sporozoite; Mrz. Merozoite. Different letters above the columns mean significant difference, P < 0.05 图 4 EtEF1α基因在虫体4个发育阶段的转录水平 Fig. 4 Transcriptional levels of EtEF1α in four developmental stages of E. tenella |
为了分析柔嫩艾美耳球虫EtEF1α在虫体不同发育阶段的翻译水平，使用管家基因α-Tubulin作为试验内参，以纯化后的柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段(UO、SO、Spz、Mrz)的蛋白为模板，利用Western blot技术进行检测，凝胶成像系统观察结果并拍照，利用Image J软件对结果进行灰度分析，结果显示，EtEF1α在翻译水平的4个阶段存在较为明显的差异，并且该基因在UO阶段翻译水平最高，Mrz阶段次之，在SO和Spz阶段都比较低(图 5)。
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UO.未孢子化卵囊；SO.孢子化卵囊；Spz.子孢子；Mrz.裂殖子; 柱上不同字母表示差异显著，P < 0.05 UO. Unsporulated oocyst; SO. Sporulated oocyst; Spz. Sporozoite; Mrz. Merozoite. Different letters above the columns mean significant difference, P < 0.05 图 5 EtEF1α基因在虫体4个发育阶段的翻译水平 Fig. 5 Translation levels of EtEF1α in four developmental stages of E. tenella |
首先收集柔嫩艾美耳球虫Spz及Mrz在PBS缓冲液，子孢子在完全培养基中孵育2 h，以及子孢子入侵DF-1细胞30 min、24 h、48 h、72 h阶段的细胞飞片，通过固定、通透、封闭后，分别用兔抗rEtEF1α的多克隆抗体稀释100倍后作为一抗，使用Alexa FluorTM 488鸡抗家兔IgG绿色荧光二抗定位，DAPI进行细胞核染色，最后使用激光共聚焦显微镜成像，通过荧光强度来判断EtEF1α蛋白在虫体不同发育阶段的分布和蛋白表达量。结果显示(图 6)，EtEF1α主要定位于Spz的顶端和表面(图 6A)，并分布于Mrz整个虫体(图 6G)；当Spz在完全培养基中孵育2 h和入侵DF-1细胞30 min后，荧光强度变化不明显(图 6B、C)；当Spz入侵DF-1细胞24 h后，EtEF1α主要定位于未成熟裂殖体表面，该阶段绿色荧光强度较30 min时增强(图 6D)；随着虫体在细胞内的发育，EtEF1α定位更倾向于成熟裂殖体的膜上，并且荧光强度增加(图 6E)；在入侵后72 h时，EtEF1α蛋白的荧光大多数集中于成熟裂殖体和Mrz的膜上，且荧光强度增强(图 6F)。
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A.重悬于PBS的子孢子; B.子孢子在培养基中孵育2 h; C.子孢子入侵DF-1细胞30 min; D.子孢子入侵DF-1细胞24 h; E.子孢子入侵DF-1细胞48 h; F.子孢子入侵DF-1细胞72 h; G.重悬于PBS的裂殖子 A. Sporozoites in PBS; B. Sporozoites cultured in CM for 2 h; C. DF-1 cells invaded by sporozoites for 30 min; D. DF-1 cells invaded by sporozoites for 24 h; E. DF-1 cells invaded by sporozoites for 48 h; F. DF-1 cells invaded by sporozoites for 72 h; G. Second generation merozoites in PBS 图 6 EtEF1α的分布定位 Fig. 6 Distribution of EtEF1α |
根据荧光定位该蛋白的分布情况，推测EtEF1α可能是分泌性蛋白质，因此通过试验进行验证。将新鲜纯化的子孢子在添加5、10、20 μmol·L-1 DMSO和5、10、20 μmol·L-1十字孢碱的培养基中孵育2 h，并通过兔抗rEtMIC2多克隆抗体以及兔抗rEtEF1α多克隆抗体进行Western blot。结果表明，使用不同浓度的DMSO，EtEF1α的条带大小相同，表明该试剂对EtEF1α的分泌没有影响(图 7)。在添加不同浓度的十字孢碱的情况下EtEF1α的分泌未受影响，结果证明rEtEF1α是一种分泌蛋白, 但不是由微线体分泌的。
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图 7 EtEF1α分泌试验 Fig. 7 Secretion of EtEF1α |
结果显示(图 8)，与正常的兔IgG相比，兔抗rEtEF1α多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有一定的抑制作用，入侵抑制率在22%左右；而且随着IgG浓度的升高，EtEF1α对子孢子入侵DF-1细胞的抑制没有明显的变化。结果说明EtEF1α蛋白与子孢子入侵DF-1细胞有关，在入侵过程中可能发挥着一定的作用。
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***.P < 0.001 图 8 兔抗rEtEF1α多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响 Fig. 8 Effect of sporozoite invasion in vitro by rabbit anti-rEtEF1α |
延伸因子在多种生物的行为中起着关键性作用。例如转录延伸因子GreA是一种毒力因子，在小鼠感染模型中，GreA的失活降低了土拉弗朗西斯菌对宿主细胞的侵袭和生长，进而影响了其毒力，从而降低发生人畜共患病的概率[17]；在烟草花叶病毒中，沉默真核细胞翻译延伸因子1A(eEF1A)或1b(eEF1B)后，病毒外壳蛋白的积累和病毒的传播大大减少[18]。同时，延伸因子在生物体中也存在表达差异性，Pokalsky等[19]研究表明，eEF1A在番茄果实在根尖和生长点等部位的mRNA表达水平最高，在老的或成熟的组织中mRNA表达量比在嫩的、正生长发育的组织中低，同时发现eEF1A在成熟的番茄果实中高水平表达很稳定；在刚地弓形虫中，rTgEF1α多克隆抗体免疫小鼠后感染弓形虫速殖子，能显著延长小鼠的的存活率，细胞内速殖子明显减少[7]；布氏锥虫中，敲除TFIIS2-1和TFIIS2-2时，细胞的生长受到明显抑制[8]。
本研究扩增获得了柔嫩艾美耳球虫延伸因子1α(elongation factor 1-alpha)的ORF序列，并对基因进行了生物信息学分析。通过分析发现EtEF1α氨基酸序列中含有许多延伸因子位点以及相关结构域，并且有1个翻译起始因子亚单位，而有文献证明翻译延伸因子可以受翻译起始因子调控从而完成翻译过程[20]，该结构可能是用于与翻译起始因子相互作用的区域；ATP/GTP A基序结合位点(P环)和结合GTP的延伸因子信号区可能是其起催化作用的位点[21]。
qRT-PCR结果显示，EtEF1α的mRNA转录水平在虫体不同发育阶段存在较为明显的差异，并且该基因的mRNA在感染期Spz阶段转录水平最高，在翻译水平的4个阶段中UO阶段翻译水平最高，可能原因是EtEF1α作为一种延伸因子，参与了同翻译调控有关的信号传导、细胞生长、应激反应等[5]。有文献表明延伸因子在翻译过程中，可以与翻译起始因子作用，而翻译起始因子有翻译后修饰的功能，这可能是造成EtEF1α翻译和转录水平不一致的原因[22]。定位结果表明，EtEF1α主要位于Spz一端和Mrz整个虫体，随着虫体在细胞内的发育，荧光强度逐渐增强，可能是由于EF1α是细胞内含量较高的蛋白, 其基因有一个最强的启动子，该强启动子可以用于细胞内表达[23]。EF1α的mRNA有一个特殊的序列用来控制mRNA的有效翻译，从而使其高表达[24]。EtEF1α在细胞内的表达量增加，荧光强度增强，说明该蛋白可能参与了虫体在细胞内的生长发育。
本研究发现EtEF1α是分泌蛋白，但不是由微线体分泌的，故其在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞的具体机制尚不明确，推测EtEF1α可能与宿主细胞存在一定的相互作用，或者在一定程度上对细胞的生长繁殖产生影响，从而控制虫体入侵。EtEF1α在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中发挥的具体功能还有待于进一步的验证。这些结果为进一步研究EtEF1α在柔嫩艾美耳球虫生活史过程中发挥的功能奠定了基础。
4 结论EtEF1α在Spz和Mrz阶段mRNA转录水平高于其他两个阶段，而翻译水平在UO和Mrz阶段高表达；间接免疫荧光定位显示，该蛋白随着虫体在细胞内发育，荧光强度增强，说明其可能参与了虫体在细胞内的生长发育。入侵抑制试验表明，兔抗rEtEF1α多克隆抗体对虫体入侵宿主细胞有一定的抑制作用，说明其在一定程度上参与了子孢子入侵宿主细胞的过程。
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