2. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070;
3. 中牧实业股份有限公司兰州生物药厂, 兰州 730046
, WANG Meng2, SUN Ying2, RUI Xian3, WANG Jinglei2, FU Yan2, YU Sijiu1,2, WANG Libin2, CUI Yan2, PAN Yangyang1,2
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
3. Lanzhou Biological Pharmaceutical Factory, China Animal Husbandry Co., Ltd, Lanzhou 730046, China
哺乳动物细胞生长受到威胁时，胞内可形成大量双层膜结构的自噬小体，它们会与溶酶体结合，清除代谢过程中多余物质，以维持正常的生理活动及细胞稳态，此过程称为细胞自噬。细胞受到应激时这种胞内代谢活动迅速启动，可批量降解胞内大量异源物种，是细胞抵抗恶劣环境生存威胁的重要途径[1-3]。自噬涉及细胞多种应激反应，包括营养匮乏、低氧、肿瘤、免疫以及抗衰老等[4-7]，除对细胞的调控外，相关研究发现，自噬在胚胎发育过程中也具有重要的调控作用[8]。
自噬在早期胚胎发育中发挥至关重要的作用[9-10]。在哺乳动物发育过程中，自噬首先在受精后的卵母细胞中发生，受精后卵母细胞从以前的高度分化的配子状态转变为未分化的胚胎状态，细胞中储存的大量母体蛋白质和mRNA在2细胞阶段降解，最终，合子基因组启动了新的蛋白质合成。一旦达到4细胞和8细胞的阶段，细胞内的蛋白质就会全部从母体更新为新生[11]。研究发现，未受精卵母细胞的自噬水平相对较低且胞内自噬活性没有快速变化，而在受精后4 h内自噬活性迅速增加[12]，说明，自噬活性的增加不是由于排卵后卵母细胞饥饿引起的，另外，在孤雌生殖卵母细胞中有类似的自噬激活现象，因此，可以认为这种自噬活性的增加可能与卵母细胞中的钙振荡有关[9, 13]。以上证据进一步说明，自噬在受精卵和孤雌胚胎发育过程中均发挥了重要调控作用。
自噬相关基因5(autophagyrelated gene 5，Atg5)和Bcl-2同源结构域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein，Beclin1)是自噬体形成的关键诱导因子[14-15]。Atg5蛋白可与Atg12蛋白结合介导自噬过程中泛素化系统的形成[16]；Beclin1蛋白与ClassⅢPI-3K形成复合体促进自噬体的延伸，另外，还可与Bcl-2结合参与调节细胞凋亡[17]。研究表明，来源于Atg5-/-精子和Atg5-/-卵母细胞的Atg5敲除胚胎阻滞在4~8细胞阶段，并最终导致胚胎死亡，同时，在这些自噬缺陷型小鼠胚胎中，蛋白质合成率比对照组降低了30%，这表明，自噬很可能激活了降解母体蛋白质的作用，从而为新形成的胚胎提供了营养[9, 18-19]。另有研究表明，纯合的Beclin1基因敲除小鼠具有胚胎致死性，杂合的Beclin1基因敲除小鼠表现出过早死亡、肿瘤发生率增加和自噬减少的特性[20]；并且Beclin1缺失的胚胎发育严重延迟，体积异常缩小，胚胎出现缺陷，且在发育过程中积累了大量的活性氧和炎症因子，自噬功能的丧失使其无法有效消除体内的有害物质，最终导致细胞凋亡[21]。
本试验分别在小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎的不同发育阶段收集2细胞、4~8细胞、桑葚胚和囊胚期胚胎，利用实时荧光定量PCR、Wes-tern blot等方法分析自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达动态，间接免疫荧光法对小鼠囊胚中Atg5和Beclin1的表达定位进行观察。旨在探索自噬在小鼠胚胎早期发育过程中的作用以及细胞自噬与胚胎生产方式的相关性，为细胞自噬在哺乳动物胚胎早期发育过程中的作用机制研究提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要材料试验动物为购于中国农业科学院兰州兽医研究所的SPF级昆明小鼠(许可证编号为SCXK(甘)2015-0001)。
1.2 主要试剂孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)、SrCl2、细胞松弛素B、透明质酸酶、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)、杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS)均购自Sigma公司；KSOM培养液为国产分析纯试剂配制；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Thermo Fisher Scientific公司；胚胎RNA提取试剂盒购自Omega公司；蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)所用的试剂均购自南京碧云天公司。
1.3 主要方法1.3.1 小鼠受精卵的采集和培养 选取健康状况良好的6~8周龄SPF级雌性昆明(KM)小鼠100只(每组5只，共20组)用于小鼠受精卵的收集，在18:00给每只小鼠腹腔注射PMSG 8 IU，间隔48 h后注射HCG 10 IU，随后将雄性和雌性小鼠1:1合笼过夜。次日8:00，分别对雌性小鼠进行检查，存在阴栓的小鼠被认为交配成功；处死雌性小鼠取出两侧卵巢及输卵管，放入含生理盐水的培养皿中；在体视显微镜下撕开输卵管壶腹部膨大处，将流出的受精卵细胞团吸入含透明质酸酶的KSOM培养液中，吹打去除颗粒细胞，再用PBST清洗2~3次，直到没有颗粒细胞为止。清洗完成后，将受精卵转移到KSOM培养基中(每100 μL的微滴含有20个卵母细胞)，覆盖一层矿物油，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度(95%)的培养箱中培养。分别在注射HCG后的第36、48、72、84 h收集2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期、囊胚期的胚胎。
1.3.2 小鼠卵母细胞获取和孤雌激活胚胎的培养 选取健康状况良好的6~8周龄SPF级雌性昆明(KM)小鼠100只(每组5只，共20组)用于小鼠卵母细胞的获取及孤雌激活，于18:00给每只小鼠腹腔注射PMSG 8 IU，间隔48 h后注射HCG 10 IU。注射HCG 12 h后，处死小鼠，取出卵巢和输卵管放入生理盐水中，在体式显微镜下用钟表摄撕开输卵管膨大部，轻轻挤出卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes，COCs)，挑选质量良好的COCs，使用D-PBS将COCs清洗3次后将其移入0.1%透明质酸酶中消化3~5 min；用玻璃吸管反复吹打COCs，使其很快地脱去周围颗粒细胞形成裸卵，用含有血清的D-PBS将挑选出的卵母细胞清洗2~3次，再将卵母细胞移到温度为37 ℃的SrCl2+CB液中进行4~5 h孤雌激活。将激活后的卵母细胞移入KSOM培养液中(每100 μL的微滴含有20个卵母细胞)，放置在37 ℃、5% CO2、饱和湿度(95%)的培养箱中进行培养，分别在注射HCG后的第36、48、72、84 h收集2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期、囊胚期的胚胎。
1.3.3 小鼠胚胎RNA的提取和反转录 严格按照胚胎微量RNA提取试剂盒(Omega，美国)及Go ScriptTM Reverse Transcription System反转录试剂盒(Promega，美国)的操作说明，对不同来源及不同发育时期的小鼠胚胎(各50枚)进行反转录合成cDNA，－20 ℃保存备用。
1.3.4 qRT-PCR技术检测Atg5和Beclin1基因的相对表达量 根据GenBank公布的小鼠Atg5、Beclin1、β-actin基因序列设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息详见表 1。使用实时荧光PCR仪检测Atg5和Beclin1基因的相对表达量，以β-actin作为内参基因。反应体系(20 μL)：待检cDNA(100 ng·μL-1)2 μL，上、下游引物(0.2 μmol·mL-1)各0.8 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，Nuclease-Free Water 6.4 μL。反应参数：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性10 s，退火10 s(退火温度见表 1)，72 ℃延伸10 s，循环40次。每个样品重复4次，采用相对定量分析法评估基因相对表达水平。
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表 1 qRT-PCR引物信息 Table 1 Information of primers for qRT-PCR |
1.3.5 Western blot检测Atg5、Beclin1蛋白的相对表达量 分别收集不同来源及不同发育时期的小鼠胚胎，PBS清洗两次后加入蛋白裂解缓冲液裂解1.5 h，反复吹打使其裂解充分；在4 ℃、13 000 r·min-1的条件下离心15 min后收集上清，放置在-80 ℃冰箱保存备用。对蛋白样品变性、跑胶，并对待检目的蛋白进行湿转至PVDF膜上；利用5%脱脂奶粉进行封闭，37 ℃孵育3 h；分别加入Atg5、Beclin1和β-actin一抗(稀释比例分别为1:500，1:500，1:1 000)，4 ℃孵育过夜，PBST清洗5 min×6次；二抗(稀释比例为1:1 000)37 ℃孵育1 h，PBST清洗3遍，使用电化学发光试剂盒发光2~5 min后曝光，待蛋白条带清晰时拍照并检测IOD值(蛋白相对表达量=目的IOD/内参IOD)。
1.3.6 Atg5、Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位检测 不同来源的小鼠囊胚在免疫荧光固定液中37 ℃固定0.5~1 h，D-PBS洗3次(每次5 min)；加免疫封闭液4 ℃孵育过夜，37 ℃孵育1 h，D-PBS洗3遍(每次5 min)；分别加入待检蛋白一抗(稀释比例分别为1:500，1:500)，4 ℃孵育过夜，D-PBS清洗3遍(每次5 min)；加入二抗(稀释比例为1:400)，37 ℃避光孵育1 h，D-PBS清洗3遍(每次5 min)；使用1 μg·mL-1 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′-6-diamidino-2-phenylin-dole, DAPI)染色3 min，D-PBS清洗3遍(每次5 min)后使用抗荧光猝灭剂封片，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。
1.3.7 数据分析 利用SPSS 19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，每组数据差异值计算至少重复3次，结果均以“Mean±SEM”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。使用Graphpad prism 5.0软件绘图。
2 结果 2.1 小鼠胚胎体外培养在体式显微镜下观察小鼠体外培养胚胎在不同发育阶段的生长情况，结果表明，小鼠胚胎发育状况良好(图 1)，可以进行后续试验。
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A.2细胞期；B. 4~8细胞期；C.桑葚胚期；D.囊胚期 A. 2 cell stage; B. 4-8 cell stage; C. Morula embryo stage; D. Blastocyst stage 图 1 不同发育阶段的体外培养小鼠胚胎(100×) Fig. 1 The mouse embryos cultured in vitro at different developmental stages(100×) |
提取胚胎RNA样品，逆转录形成模板DNA，加入引物进行普通PCR扩增。核酸电泳分析结果如图 2所示，Atg5、Beclin1、β-actin产物大小分别为177、173、117 bp，与预期基本一致，条带单一清晰，说明模板质量和引物特异性良好，可用于实时荧光定量PCR检测。
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A1~A3.不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎中Atg5、Beclin1和β-actin基因的扩增结果；B1~B3.不同发育时期小鼠自然受精胚胎中Atg5、Beclin1和β-actin基因的扩增结果。M. DNA相对分子质量标准；1.2细胞期；2.4~8细胞期；3.桑葚胚期；4.囊胚期 A1-A3. Amplification results of Atg5, Beclin1 and β-actin genes in mouse parthenogenetic activated embryos at different development stages; B1-B3. Amplification results of Atg5, Beclin1 and β-actin genes in mouse naturally fertilized embryos at different developmental stages. M.2000 Marker; 1.2 cell stage; 2.4-8 cell stage; 3. Morula embryo stage; 4. Blastocyst stage 图 2 PCR产物核酸电泳结果 Fig. 2 The electrophoresis results of PCR products |
如图 3所示，Atg5和Beclin1在各发育时期的小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎中均有表达。在孤雌激活胚胎中，Atg5和Beclin1相对表达量随胚胎发育先升高后下降，在4~8细胞阶段的相对表达量最高；而在自然受精胚胎中，Atg5和Beclin1相对表达量随胚胎发育逐渐下降，在2细胞期的相对表达水平最高；并且在4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期Atg5和Beclin1在孤雌激活胚胎中的表达量高于对应发育时期的自然受精胚胎，差异极显著(P＜0.01)。
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*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P < 0.01)。下同 * indicate significant differences (P < 0.05), ** indicate extremely significant differences (P < 0.01). The same as below 图 3 自噬基因Atg5和Beclin1在两种来源小鼠胚胎发育不同时期的相对表达水平 Fig. 3 Relative expression levels of autophagy gene Atg5 and Beclin1 at different developmental stages of mouse embryos from two sources |
Western blot检测结果与基因检测结果基本一致，Atg5和Beclin1在各发育时期的孤雌激活胚胎和自然受精胚胎中均有表达(图 4)。在孤雌激活胚胎中，Atg5和Beclin1相对表达量在小鼠胚胎早期发育过程中先升高后下降，4~8细胞阶段相对表达量最高；而在自然受精胚胎中，Atg5和Beclin1相对表达量在2细胞期的相对表达水平最高，2细胞期后逐渐下降；并且从4~8细胞期开始，Atg5和Beclin1在孤雌激活胚胎中的表达量始终高于对应发育时期的自然受精胚胎，差异极显著(P＜0.01，图 5)。
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A.孤雌激活胚胎；B.自然受精胚胎。1.2细胞期；2.4~8细胞期；3.桑葚胚期；4.囊胚期 A. Parthenogenetic activated embryo; B. Naturally fertilized embryo. 1.2 cell stage; 2.4-8 cell stage; 3.Morula embryo stage; 4. Blastocyst stage 图 4 自噬蛋白Atg5和Beclin1在两种来源小鼠胚胎发育不同时期的表达 Fig. 4 The expression of autophagy protein Atg5 and Beclin1 at different developmental stages of mouse embryonic from two sources |
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图 5 自噬蛋白Atg5和Beclin1在两种来源小鼠胚胎发育不同时期的相对表达水平 Fig. 5 Relative expression levels of autophagy protein Atg5 and Beclin1 at different developmental stages of mouse embryos from two sources |
对不同生产方式获得的小鼠囊胚进行免疫荧光染色。自噬蛋白Atg5的分布如图 6所示，其在孤雌激活胚胎(图 6-A1、A2、A3)和自然受精胚胎(图 6-B1、B2、B3)中的分布特点基本一致，均主要分布于胚胎滋养层细胞和内细胞团胞浆中，且内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞；由图 7可知，Beclin1蛋白同样主要表达于胚胎滋养层细胞和内细胞团胞浆，但在孤雌激活胚胎(图 7-A1、A2、A3)内细胞团中红色荧光点数量更多、聚集明显，其表达高于自然受精胚胎(图 7-B1、B2、B3)的内细胞团。
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A1~A3. Atg5蛋白在小鼠孤雌激活胚胎中的表达分布；B1~B3. Atg5蛋白在小鼠自然受精胚胎中的表达分布。DAPI.细胞核标记；红色荧光为目的蛋白标记，下同 A1-A3. Expression and distribution of Atg5 protein in mouse parthenogenetic activated embryos; B1-B3. Expression and distribution of Atg5 protein in mouse naturally fertilized embryos. DAPI.Nuclear label; Red fluorescence show target protein label, the same as below 图 6 自噬蛋白Atg5在不同来源小鼠囊胚中的分布 Fig. 6 Distribution of autophagy protein Atg5 in mouse blastocysts from two sources |
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A1~A3. Beclin1蛋白在小鼠孤雌激活胚胎中的表达分布；B1~B3. Beclin1蛋白在小鼠自然受精胚胎中的表达分布 A1-A3. Expression and distribution of Beclin1 protein in mouse parthenogenetic activated embryos; B1-B3. Expression and distribution of Beclin1 protein in mouse naturally fertilized embryos 图 7 自噬蛋白Beclin1在不同来源小鼠囊胚中的分布 Fig. 7 Distribution of autophagy protein Beclin1 in mouse blastocysts from two sources |
自噬与哺乳动物生殖联系紧密，可通过在生殖过程中降解过量的蛋白质和细胞器来促进细胞存活，调节细胞间相互作用，自噬活性的急剧变化参与调节许多哺乳动物的繁殖事件，这种降解和翻新在整个生殖过程中都发挥着极其重要的作用[22-23]。近期研究发现，自噬在胚胎发育早期可参与细胞重构过程中的胞内信号传导并调控细胞活性[24]。
研究表明，从卵母细胞到胚胎发育过渡过程中，胚胎基因组被激活，卵母细胞胞浆中原有的母体mRNA、蛋白和细胞器会迅速降解并被合子mRNA和蛋白取代，称为母体-胚胎转换(maternal-to-embryo transition)，该降解过程从减数分裂成熟开始，2细胞期胚胎最显著[9, 25-26]。本研究利用qRT-PCR和Western blot分别对孤雌激活和自然受精小鼠胚胎发育不同时期Atg5和Beclin1的相对表达量进行检测，结果显示，着床前胚胎发育不同时期均有Atg5和Beclin1的表达，根据Atg5和Beclin1在自噬性结构演变过程中发挥的关键作用[16-17]，可以推断，着床前胚胎的正常发育离不开完整的自噬过程。另有研究表明，一旦出现自噬缺陷，胚胎发育则不能超过4~8细胞期阶段，导致所有胚胎死亡[9, 18]。本试验发现，两种来源的胚胎中Atg5和Beclin1均在胚胎2~8细胞期的相对表达量较高，8细胞期后相对表达量逐渐降低，至囊胚的相对表达量最低，该结果与Tsukamoto等[9]的研究结果一致，说明，在小鼠胚胎发育过程中，2~8细胞期的胚胎胞浆物质更替与细胞重构效应最为旺盛，自噬水平被激活上调，通过对胚胎胞浆内容物的降解，为新生胚胎提供所必须的氨基酸及能量，维持胚胎胞浆的内环境稳态。
孤雌激活胚胎由卵母细胞单独发育而成，发生过程中无精子参与[27-28]，因此，与自然受精胚胎相比，孤雌激活胚胎的蛋白合成及涉及的生理程序均具有一定的特殊性，胡婕等[29]研究发现，在性别决定、早期胚胎发育、神经发育等许多方面发挥重要作用的SOX基因仅在自然受精胚胎中表达，在孤雌激活胚胎中不表达；比较Stein等[30]和罗婵[31]的研究发现，孤雌激活胚胎不同时期的乙酰化水平与自然受精胚胎也存在差异。研究表明，自噬在孤雌激活和自然受精胚胎的早期发育过程中均有重要作用[32]，但目前自噬对两种来源胚胎早期发育的调控机制以及对胚胎发育能力的影响尚不清楚。本研究通过对孤雌激活和自然交配小鼠胚胎发育不同时期Atg5和Beclin1的相对表达量进行比较发现，从4细胞期起孤雌激活小鼠胚胎各细胞时期Atg5和Beclin1的相对表达均高于自然受精，说明孤雌激活胚胎发育过程中具有较高的自噬水平。由于已有研究表明，虽然在小鼠受精卵中检测到自噬相关蛋白定位于精子线粒体附近，但实际上自噬并不参与早期胚胎中精子线粒体和mtDNA的降解[33-34]，故孤雌胚胎中高自噬水平的出现可能是由于孤雌激活胚胎的遗传物质均为母源，细胞分裂过程中需要降解大量的母源DNA，胚胎自噬水平升高从而加快物质更新。
另外，本试验发现，自然受精小鼠胚胎的自噬水平从2细胞期起逐渐降低，而孤雌激活胚胎在4~8细胞期Atg5和Beclin1表达量最高，高于2细胞期，有研究表明，孤雌激活和自然受精胚胎的活化过程不同[35]，提示，自噬对两种来源胚胎早期发育的调控机制可能也不同。研究表明，孤雌激活和自然受精胚胎均具有发育潜能，但孤雌激活胚胎葡萄糖、氨基酸代谢能力以及囊胚率等较自然受精胚胎表现差[36-38]；本试验中，孤雌激活胚胎的自噬水平更高、强自噬作用的维持时间更长、自噬相关基因及蛋白表达量达到最高的时间较为推后，推断自噬可能是导致孤雌激活胚胎发育潜能低的原因之一，具体机制需进一步研究。
研究表明，囊胚中的滋养层细胞和内细胞团分别为胚胎植入和胎儿发育提供重要的营养物质[39-41]。本研究分别对小鼠孤雌激活和自然受精囊胚中自噬关键蛋白Atg5和Beclin1的表达定位进行间接免疫荧光检测，发现Atg5和Beclin1均主要定位于胚胎滋养层细胞和内细胞团胞浆中，但在内细胞团中的表达明显高于滋养层细胞，说明内细胞团细胞通过自噬维护囊胚质量的作用优于滋养层细胞，提示，细胞自噬可能在小鼠胚胎着床后的发育及分化中发挥重要调控作用。Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎内细胞团中红色荧光点数量更多且聚集明显，其表达高于自然受精胚胎的内细胞团，由此推测，小鼠胚胎发育过程中Beclin1蛋白的表达及调控可能受胚胎激活方式的影响，具体机制有待进一步验证。
4 结论在小鼠自然受精胚胎和孤雌激活胚胎早期发育各时期均可检测到不同水平的细胞自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达，揭示细胞自噬参与小鼠早期胚胎发育调控，其在小鼠胚胎发育过程中的生理作用与胚胎生产方式、发育时期及囊胚中细胞类型存在一定关联。本研究以小鼠为模型，为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。
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