2. 太仓市畜牧兽医站, 太仓 215400
, WANG Changjian1, WEI Zongyou2, LU Hanxi1, YAO Xiaolei1, YANG Hua1, WANG Feng1, ZHANG Yanli1
2. Taicang Animal Husbandry and Veterinary Station, Taicang 215400, China
精液冷冻保存技术可以打破时间和空间的障碍长期保存精液，提高优良种公羊的利用率，加快品种改良的进程，是人工授精技术的关键环节之一。近年来，国内外学者从不同角度对绵羊精液冷冻保存技术进行了研究，丰富了这一领域的数据，但冻精技术在羊领域研究起步晚，目前，绵羊冷冻精液解冻后精子活率较其他家畜(如牛、猪)而言仍处于较低水平，且使用冻精进行人工授精的受胎率也低于自然交配的受胎率[1]。羊的精子质膜薄，在超低温环境中易脆、破裂，容易造成精子质膜的结构损伤，易受到冷休克、细胞内冰晶、氧化应激、高渗损伤等[2]冷冻损伤。另外，羊精液中含有一种酶，会与稀释液中蛋黄发生反应，降低精子存活率，从而影响受胎率。因此，改善稀释液成分、优化冷冻保存程序可以减少冷冻损伤，对提高绵羊冻精解冻后精液的品质至关重要。
精子的能量代谢对于维持精子正常的结构与功能至关重要。真核细胞内主要的能量状态感受器就是腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)。研究表明，AMPK在精子能量代谢稳态的调节中起着核心作用。AMPK可以影响精子运动[3]、维持线粒体膜电位[4]、调节精液保存时精子质膜的流动性[5]，并参与精子获能过程[4]。近年的一些研究结果显示，在家禽稀释液中添加AMPK激活剂Met或AICAR可以提高冷冻精液解冻后的精子质量[6]；在山羊体外受精前精子孵育过程中添加AMPK激活剂可以显著改善精子活力、膜完整性和顶体反应[7]；AMPK的间接激活剂白藜芦醇可以显著提高人冻融精子中的线粒体膜电位[8]；添加AMPK激活剂Met有助于提高常温液态保存猪精液的质量，延长保存时间[9]。然而，目前关于AMPK激活剂在绵羊精液冷冻保存中的作用还鲜见报道，其是否对绵羊精子具有保护作用还不清楚。
本研究以绵羊精子为试验对象，探究Met或AICAR对精子冷冻保存效果的影响，并且探究Met或AICAR是否通过AMPK的介导而影响精子的能量代谢。通过检测冷冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、ATP含量、AMPK磷酸化水平和顶体酶活性，探究AMPK激活剂对绵羊精子体外冷冻保存效果的影响及其机理。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 试验动物 试验所用羊只由江苏省太仓市金仓湖生态养殖基地提供。在采精期间，选取5只性欲良好、体型适中、训练有素的成年健康种公羊，采用单栏舍饲，每日饲喂2次。日粮配方：预混料0.33%，玉米粉2.64%，玉米粕3.96%，花生秧3.17%，稻草21.11%，豆渣66%，大豆皮2.51%，小苏打0.15%，盐0.13%。采精前补饲玉米。
1.1.2 主要试剂 精液稀释液(AndroMed，13503/0200)、Met(MCE，HY-17471A)、AICAR(MCE，HY-13417A)、快速姬姆萨染液(南京建成，Do11-1)、BCA试剂盒(Beyotime，P0012)、AMPK(Proteintech，10929-2-AP)、p-AMPK(Affinity，AF3423)、GAPDH(Proteintech，60004-1-lg)、Cy3标记山羊抗兔IgG(Servicebio，GB21303)。
1.1.3 主要溶液配制1.1.3.1 AndroMed稀释液 将双蒸水提前加热至30~35 ℃后，与200 mL AndroMed无卵黄稀释浓缩液按体积比4:1充分混合。混合后的稀释液4 ℃保存，使用前需30~32 ℃预热。
1.1.3.2 Met浓储液(1 mmol·L-1) 0.42 mg Met溶于25.359 mL DPBS，－20 ℃保存。
1.1.3.3 AICAR浓储液(1 mmol·L-1) 0.12 mg AICAR溶于3.93 mL DPBS，－20 ℃保存。
1.1.3.4 低渗溶液 4.9 g柠檬酸三钠和9.0 g果糖溶于1 000 mL蒸馏水。
1.2 试验方法1.2.1 精液处理 将采集后的精液置于恒温箱中(37 ℃)带回实验室，立即进行处理。精液冷冻保存试验技术路线见图 1。
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图 1 精液冷冻保存试验技术路线图 Fig. 1 Technical roadmap of semen cryopreservation |
1.2.2.1 精子活力及运动性能 使用CASA系统(Andro Vision)分析精子运动特征。吸取10 μL解冻后精液置于预热载玻片上，盖上盖玻片置于显微镜恒温台上，检测精子总活力(TM)、快速运动精子比例(rapid)、平均路径速率(VAP)、直线速率(VSL)和曲线速率(VCL)。每个样本至少观察5个视野，每个视野不少于400个精子，每个视野平均在5 s内读数。
1.2.2.2 顶体完整率 使用姬姆萨染色法，吸取10 μL解冻后精液置于载玻片上抹片，固定，姬姆萨染色4 h，背面冲洗后晾干待用。显微镜下观察精子，每个视野不少于200个精子，至少观察3个视野，顶体完整率/%=(总精子数－顶体不完整精子数)/总精子数×100。
1.2.2.3 质膜完整率 使用低渗膨胀法，将10 μL解冻后精液与100 μL低渗溶液混合均匀，37 ℃孵育30 min，吸取10 μL混合液置于载玻片抹片，自然风干后待用。显微镜下观察精子，每个视野不少于200个精子，至少观察3个视野。质膜完整率/%=弯尾精子数/总精子数×100。
1.2.2.4 其他指标测定 顶体酶活性、精子能量代谢指标(丙酮酸、乳酸脱氢酶、乳酸、ATP含量)、线粒体膜电位、ATP酶活性、精子抗氧化酶指标(谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性)均使用上海卡迈舒生物科技有限公司提供的试剂盒进行测定，具体操作参照试剂盒使用说明。
1.2.3 精子免疫荧光检测 4%多聚甲醛固定精子涂片30 min；PBS清洗涂片3次，每次5 min；0.25% Triton-100溶液覆盖于涂片处，通透20 min；PBS清洗涂片3次，每次5 min；5%BSA溶液在室温封闭1 h；4 ℃孵育一抗，过夜；孵育结束后，将涂片放置于室温；PBS清洗精子涂片3次，每次5 min；室温避光孵育二抗1 h；使用PBS溶液避光清洗精子涂片3次，每次5 min；使用DAPI避光染核5 min；PBS清洗涂片3次，每次5 min；滴加抗荧光猝灭剂后封片；使用激光共聚焦显微镜进行观察与拍照。
1.2.4 精子蛋白免疫印迹检测 提取解冻后绵羊精子总蛋白，根据BCA试剂盒(碧云天)说明书进行蛋白浓度测定后进行蛋白变性，蛋白变性条件为：70 ℃，10 min。SDS-PAGE电泳：蛋白上样量10 μL(20 μg)，200 V 35 min；转膜：100 V 1 h；封闭：5%脱脂奶粉封闭2 h；TBST洗3次孵一抗，4 ℃过夜；TBST洗3次孵二抗，室温1 h；TBST洗3次，使用ECL显影液孵育，显影拍照，使用Image J软件对条带进行灰度分析。
1.2.5 数据分析 每个试验至少重复3次，所有结果均表示为“平均值±标准差(mean±SD)”，利用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用邓肯多重比较(DunCan)进行事后比较。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子活力及运动性能的影响通过向精液冷冻稀释液中添加终浓度为0、100、200、300、400、500 μmol·L-1 Met或AICAR来探究AMPK激活剂对冷冻精液解冻后精子活力及运动性能的影响，结果见表 1和表 2。
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表 1 不同浓度Met对冷冻解冻后精子活力及运动性能的影响 Table 1 Effects of different concentrations of Met on sperm motility and motion performance after freezing and thawing |
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表 2 不同浓度AICAR对冷冻解冻后精子活力及运动性能的影响 Table 2 Effects of different concentrations of AICAR on sperm motility and motion performance after freezing and thawing |
与对照组相比，400 μmol·L-1 Met使精子总活力提高了8%(P < 0.05)，并且能显著提高精子的运动性能(rapid、VAP、VSL和VCL，P < 0.05)；与对照组相比，200 μmol·L-1 AICAR使精子总活力提高14%(P < 0.05)，并且能显著提高精子的运动性能(rapid、VAP、VSL和VCL，P < 0.05)。
2.2 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子结构完整性的影响通过向精液冷冻稀释液中添加终浓度为0、100、200、300、400、500 μmol·L-1 Met或AICAR来探究AMPK激活剂对冷冻精液解冻后精子结构完整性的影响，显微镜下观察精子，如图 2A所示，黄色箭头所指为顶体完整精子，背景为浅蓝色，核为深蓝色；红色箭头所指为顶体不完整精子，整个精子头部呈深蓝色。如图 2B所示，黄色箭头所指为质膜完整精子，尾部呈弯曲状；红色箭头所指为质膜不完整精子。
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图 2 显微镜观察精子顶体完整性和质膜完整性 Fig. 2 Microscope observation of acrosomal integrity and membrane integrity of sperm |
冷冻精液解冻后精子结构完整性的统计结果见表 3和表 4，与对照组相比，300和400 μmol·L-1Met均能显著提高解冻后精子顶体完整率和质膜完整率(P < 0.05)，综合上述结果，选择添加400 μmol·L-1 Met进行后续试验。
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表 3 不同浓度Met对冷冻解冻后精子结构完整性的影响 Table 3 Effect of different concentrations of Met on the structural integrity of sperm after freezing and thawing |
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表 4 不同浓度AICAR对冷冻解冻后精子结构完整性的影响 Table 4 Effect of different concentrations of AICAR on the structural integrity of sperm after freezing and thawing |
与对照组相比，100和200 μmol·L-1AICAR均能显著提高解冻后精子质膜完整率(P < 0.05)，综合上述结果，选择添加200 μmol·L-1 AICAR精液稀释液进行后续试验。
2.3 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK蛋白表达的影响如图 3所示，绵羊鲜精中AMPK定位于精子的顶体和颈部，p-AMPK定位于精子赤道环及尾部。
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A/a. AMPK定位图；B/b.精子头部染色；C/c.荧光叠加图；D/d. p-AMPK定位图；E/e.精子头部染色；F/f.荧光叠加图 A/a. AMPK location map; B/b. Sperm head staining; C/c. Fluorescence overlay image; D/d. p-AMPK location image; E/e. Sperm head staining; F/f. Fluorescence overlay image 图 3 AMPK及p-AMPK在绵羊精子上的表达定位 Fig. 3 Expression and location of AMPK and p-AMPK on sheep sperm |
AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK及p-AMPK的蛋白表达的影响见图 4。与对照组相比，解冻后Met组精子中的AMPK和p-AMPK蛋白表达量显著升高(P < 0.05，图 4B、4C)，AICAR组精子中的AMPK和p-AMPK蛋白表达量无显著变化(P>0.05，图 4B、4C)，Met组和AICAR组精子中的p-AMPK/AMPK比值均显著高于对照组(P < 0.05)。经分析，Met组和AICAR组之间无显著差异(P>0.05)。
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A.AMPK和p-AMPK的蛋白表达条带：1、2、3分别表示Control、Met、AICAR组；B. AMPK蛋白表达；C. p-AMPK蛋白表达；D. p-AMPK/AMPK比率。对照组使用AndroMed稀释液冷冻精液，试验组分别使用含终浓度为400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR的AndroMed稀释液冷冻精液。不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，下同 A. AMPK and p-AMPK protein expression bands:1, 2, 3 represent Control, Met, AICAR group, respectively; B. AMPK protein expression; C. p-AMPK protein expression; D. p-AMPK/AMPK ratio. The control group used AndroMed diluted frozen semen, the test groups used AndroMed diluted frozen semen with final concentrations of 400 μmol·L-1 metformin and 200 μmol·L-1 acadesine, respectively. The different letters indicate significant differences between groups (P < 0.05), the same as below 图 4 AMPK激活剂对冷冻保存后精子中AMPK和p-AMPK蛋白表达的影响 Fig. 4 Effect of AMPK activator on the expression of AMPK and p-AMPK proteins in sperm after cryopreservation |
如图 5所示，与对照组相比，Met组和AICAR组均能显著提高冷冻解冻后精子的顶体酶活性(P < 0.05)。经分析，400 μmol·L-1Met能极显著提高冷冻解冻后精子顶体酶活性(P < 0.01)。
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顶体酶活性(Control：(21.18±0.96) U·L-1；Met：(40.33± 0.65) U·L-1；AICAR：(32.79±0.27) U·L-1) Acrosome enzyme activity (Control: (21.18±0.96) U·L-1; Met: (40.33±0.65) U·L-1; AICAR: (32.79±0.27) U·L-1) 图 5 AMPK激活剂对冷冻保存后精子顶体酶活性的影响 Fig. 5 Effect of AMPK activator on acrosome enzyme activity of sperm after cryopreservation |
如图 6所示，与对照组相比，Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中的丙酮酸含量显著降低(P < 0.05，图 6A)，其中Met组中精子丙酮酸含量最低；Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性显著升高(P < 0.05，图 6B)，其中Met组中精子LDH活性最高；Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中乳酸含量显著高于对照组(P < 0.05，图 6C)，Met组中精子乳酸含量最高；与对照组相比，试验组显著提高了ATP的含量(P < 0.05，图 6D)，其中Met组中精子ATP含量最高。
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A.丙酮酸含量(Control：(21.49±0.19) mg·L-1；Met：(12.58±0.31) mg·L-1；AICAR：(14.90±0.27) mg·L-1)；B.乳酸脱氢酶活性(Control：(6.84±0.15) IU·L-1；Met：(9.48±0.13) IU·L-1；AICAR：(8.84±0.12) IU·L-1)；C.乳酸含量(Control：(1 419.43±40.18) μmol·L-1；Met：(2 442.90±79.89) μmol·L-1；AICAR：(2 204.20±69.21) μmol·L-1)；D. ATP含量(Control：(76.43±0.88) pg·mL-1；Met：(144.75±2.19) pg·mL-1；AICAR：(126.42±0.70) pg·mL-1) A. Pyruvate content (Control: (21.49±0.19) mg·L-1; Met: (12.58±0.31) mg·L-1; AICAR: (14.90±0.27) mg·L-1); B. Lactate dehydrogenase activity (Control: (6.84±0.15) IU·L-1; Met: (9.48±0.13) IU·L-1; AICAR:(8.84±0.12) IU·L-1); C. Lactic acid content (Control: (1 419.43±40.18) μmol·L-1; Met: (2 442.90±79.89) μmol·L-1; AICAR: (2 204.20±69.21) μmol·L-1); D. ATP content (Control: (76.43±0.88) pg·mL-1; Met: (144.75±2.19) pg·mL-1; AICAR:(126.42±0.70) pg·mL-1) 图 6 AMPK激活剂对冷冻保存后精子代谢的影响 Fig. 6 Effect of AMPK activator on sperm metabolism after cryopreservation |
如图 7所示，与对照组相比，Met组和AICAR组冷冻解冻后的精子能够维持更高的线粒体膜电位(P < 0.05，图 7A)，并能显著提高精子中ATP酶活性(P < 0.05，图 7B)，其中400 μmol·L-1 Met作用更显著。
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A.线粒体膜电位(Control：(140.78±0.72)；Met：(215.73±1.15)；AICAR：(197.91±1.45))；B. ATP酶活性(Control：(7.82±0.07) U·mL-1；Met：(13.98±0.27) U·mL-1；AICAR：(12.67±0.22) U·mL-1) A. Mitochondrial membrane potential (Control: (140.78±0.72); Met: (215.73±1.15); AICAR: (197.91±1.45)); B. ATPase activity (Control: (7.82±0.07) U·mL-1; Met: (13.98±0.27) U·mL-1; AICAR: (12.67±0.22) U·mL-1) 图 7 AMPK激活剂对冷冻保存后精子线粒体膜电位及ATP酶活性的影响 Fig. 7 Effect of AMPK activator on sperm mitochondrial membrane potential and ATPase activity after cryopreservation |
如图 8所示，与对照组相比，Met组和AICAR组能显著提高冷冻解冻后精子中谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性(P < 0.05，图 8A、8B、8C)，其中Met组活性最高。
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A.谷胱甘肽还原酶活性(Control：(73.53±3.14) U·L-1；Met：(132.64±1.89) U·L-1；AICAR：(125.28±4.56) U·L-1)；B.谷胱甘肽过氧化物酶活性(Control：(133.10±2.98) U·mL-1；Met：(256.49±11.20) U·mL-1；AICAR：(227.26±7.10) U·mL-1)；C.过氧化氢酶活性(Control：(36.10±0.73) U·mL-1；Met：(64.08±1.19) U·mL-1；AICAR：(46.52± 1.21) U·mL-1) A. GR activity (Control:(73.53±3.14) U·L-1; Met:(132.64±1.89) U·L-1; AICAR:(125.28±4.56) U·L-1); B. GSH-Px activity (Control:(133.10±2.98) U·mL-1; Met:(256.49±11.20) U·mL-1; AICAR:(227.26±7.10) U·mL-1); C. CAT activity(Control:(36.10±0.73) U·mL-1; Met:(64.08±1.19) U·mL-1; AICAR:(46.52±1.21) U·mL-1) 图 8 AMPK激活剂对冷冻保存后精子抗氧化酶活性的影响 Fig. 8 Effect of AMPK activator on sperm antioxidant enzyme activity after cryopreservation |
精子活力是最常用的评价精子质量和受精能力的指标。研究表明，冷冻保存处理后，精子活力显著下降[10]。研究发现，在小鼠、山羊和鸡的精液冷冻保存稀释液中添加一定浓度的Met或AICAR，可以不同程度地改善精子的活率、活力和直线运动等运动性能[6-7]。在本试验中，添加100~400 μmol·L-1 Met或100~300 μmol·L-1 AICAR的冷冻保存稀释液均能不同程度地提高冷冻保存后精子的总活力，其中以400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR作用效果最佳，解冻后的精子活力分别为43.2%和49.47%，与姜珊[11](40.29%)、乌兰托娅[12](43%)、哈福和赵有璋[13](40%)等添加其他冷冻保护剂的研究结果相似，此浓度还可显著提高精子解冻后快速运动精子比例，精子平均路径速率等运动性能。以上结果说明，在精液冷冻保存稀释液中添加一定浓度的AMPK激活剂Met或AICAR能够改善解冻后绵羊精子的活力和运动性能。
3.2 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子结构完整性及顶体酶活性的影响顶体反应对于精卵融合以及受精过程至关重要，完整的精子结构是精卵结合的重要前提，也是卵子成功受精的必要条件[11]，所以精子的顶体完整率和质膜完整性成为检测精液品质的重要指标。研究表明，冷冻解冻后，80%绵羊精子发生质膜肿胀并且还会发生顶体外膜肿胀，导致内容物外泄[14]。
精子头部的顶体由细胞核周围的高尔基体同源性膜形成，含有多种与精卵结合相关的水解酶，其中，顶体酶是一种特殊的丝氨酸蛋白水解酶，主要参与调控顶体中其他酶的释放[15]。大部分的顶体酶分布于顶体内膜和赤道膜上，而精子的冷冻保存处理会使顶体膜受到结构和功能的损伤，因此，不可避免地会造成顶体酶的失活或损失[16]。研究表明，精子顶体酶的活性与顶体完整率具有相关性，它与正常形态的精子比例呈显著正相关[17]；同时，AMPK在正常精子顶体中的磷酸化水平较高[4]。在本试验中，适当浓度的Met和AICAR可保护冷冻解冻后精子的顶体和质膜完整性。在冷冻稀释液中分别添加400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR，解冻后精子的顶体完整率和质膜完整率可达91%、46%和83%、44%，与宏伟等[18](64.89%、34.84%)和郑云胜[19](65.67%、42.84%)等添加其他冷冻保护剂的研究结果相似。此外，400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR均能显著提高绵羊精液冷冻保存后精子的顶体酶活性，有利于精子存活。与在猪和牛上的研究一致，在稀释液中添加AMPK激活剂白藜芦醇可提高精子顶体完整率和质膜完整率[20-21]，200 μmol·L-1 Met能够维持常温保存猪精子的质膜完整性[9]。以上结果说明，使用AMPK激活剂Met和AICAR能够通过激活AMPK提高绵羊精液冷冻保存后精子的结构完整性和顶体酶活性。
3.3 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK蛋白表达的影响AMPK可能参与冷冻保存过程中精子的功能调节[22]。研究表明，AMPK蛋白定位于许多哺乳动物的精子中，如猪[23]、小鼠[3]、马[24-25]、大鼠[26]、山羊[7]和人[8, 27]，但分布的部位由于物种差异不尽相同。本试验发现，AMPK定位绵羊鲜精的顶体前部和精子颈部，而其活化形式定位于精子赤道环及整个尾部，与猪精子中AMPK及p-AMPK定位类似[9]。根据AMPK和p-AMPK蛋白在精子中的定位，我们推测分布在绵羊精子顶体前部的AMPK可能参与顶体反应的调控，颈部分布的AMPK与赤道环和尾部分布的p-AMPK可能与精子活率、运动性能和结构完整性的调控有关。通过检测冷冻解冻后精子中AMPK和p-AMPK蛋白的表达水平发现，400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR的添加可显著提高精子中AMPK的磷酸化水平。已有研究报道，在常温保存的猪精液中添加Met能够提高AMPK的磷酸化水平[9]，在鸡的鲜精和冻精中添加Met可显著增加AMPK的磷酸化[6]，这与本试验结果一致。
3.4 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子能量代谢的影响在精液冷冻保存过程中，低温减缓精子代谢，而冷冻解冻后精子的复苏需要大量ATP。磷酸化的AMPK通过增加分解代谢相关的蛋白质的活性(如葡萄糖摄取、糖酵解、脂肪酸氧化和线粒体生物合成)来促进ATP的产生，同时会抑制生物合成途径(如脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、葡萄糖或糖原的合成)保证ATP水平[28]，从而维持能量平衡。糖酵解作为精子代谢的主要方式之一，能够在相关酶的作用下将葡萄糖分解为丙酮酸和ATP，LDH可将丙酮酸转化为乳酸[29]。在本试验中，向绵羊精液冷冻保存稀释液中添加400 μmol·L-1 Met或200 μmol·L-1 AICAR可以显著提高解冻后精子中LDH的活性，降低丙酮酸含量，并提高乳酸以及ATP的含量。有研究表明，同为AMPK间接激活剂的罗格列酮通过增强线粒体代谢和种马精子糖酵解来增加细胞内ATP水平[24]，鸡精液中加入药物(Met或AICAR)激活AMPK后，精子细胞中ATP和乳酸量增加[30]，这与本试验结果类似。以上结果均表明，AMPK激活剂可以加快精子中丙酮酸向乳酸的转化过程，促进糖酵解，提高精子内ATP的含量。
3.5 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子线粒体膜电位和ATP酶活性的影响有研究表明，AMPK可定位于线粒体膜上[31]，并且在猪[4]、小鼠[3]和鸡[6]的精子中参与调节线粒体膜电位。线粒体鞘中产生的能量主要用于维持精子活率[32]，因此，线粒体膜电位的降低会导致精子活率降低[33]。ATP酶存在于线粒体的内膜上，可催化ATP水解并释放出大量能量用于细胞活动[34]。研究表明，冷冻损伤会导致线粒体膜电位降低[35]，ATP酶活性降低[36]，影响精子活率。本试验中，400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR可显著提高冷冻保存后精子中线粒体膜电位，并维持较高的ATP酶活性和ATP含量，这与Swegen等[24]通过另一种AMPK激活剂罗格列酮增强线粒体代谢，增加细胞内ATP水平维持精子运动性能的研究结果类似。
3.6 AMPK激活剂对冷冻解冻后精子抗氧化酶活性的影响低温对精子造成损伤的机制可能与ROS过量[37]和抗氧化系统的改变[38]有关，GR是这个系统中的关键酶，它可以将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，从而消除精子中的ROS，阻止脂质过氧化的发生，保护细胞膜结构和功能的完整性[39]，同时，GSH-Px与CAT能够特异性清除超氧阴离子基团[40]，共同抵抗氧化应激。徐振军等[41-43]研究表明，冷冻处理会显著降低精子中的GR、GSH-Px和CAT的活性，因此，本试验采用GR、GSH-P和CAT来评价冻后精子的抗氧化能力。一项在禽类精子中的研究表明，在稀释液中添加AICAR或Met，冷冻解冻后的鸡精子通过恢复部分GSH-Px和GR的活性，刺激精子的抗氧化体系来提高精子冷冻保存质量[6]。在本试验中，400 μmol·L-1 Met和200 μmol·L-1 AICAR的添加显著增加了GSH-Px、GR和CAT的活性，与之类似的是，在小鼠精子冷冻保存液中添加Met(5~5 000 μmol·L-1)同样也可以有效减少氧化应激[44]，物种上的差异可能是导致添加浓度差异的主要原因。
4 结论绵羊精液冷冻保存稀释液中添加适当浓度的AMPK激活剂Met或AICAR能够通过激活AMPK来提高精子解冻后的活力、运动性能以及结构完整性，并通过保持顶体酶活性，提高抗氧化酶活性，促进精子代谢，维持线粒体功能来提高精液品质。
| [1] | CIRIT U, BAǦIŞ H, DEMIR K, et al. Comparison of cryoprotective effects of iodixanol, trehalose and cysteamine on ram semen[J]. Anim Reprod Sci, 2013, 139(1-4): 38–44. |
| [2] | YESTE M. Sperm cryopreservation update:Cryodamage, markers, and factors affecting the sperm freezability in pigs[J]. Theriogenology, 2016, 85(1): 47–64. |
| [3] | TARTARIN P, GUIBERT E, TOURÉ A, et al. Inactivation of AMPKα1 induces asthenozoospermia and alters spermatozoa morphology[J]. Endocrinology, 2012, 153(7): 3468–3481. |
| [4] | DE LLERA A H, MARTIN-HIDALGO D, RODRIGUEZ-GIL J E, et al. AMP-activated kinase, AMPK, is involved in the maintenance of plasma membrane organization in boar spermatozoa[J]. Biochim Biophys Acta Biomembr, 2013, 1828(9): 2143–2151. |
| [5] | MARTIN-HIDALGO D, DE LLERA A H, YESTE M, et al. Adenosine monophosphate-activated kinase, AMPK, is involved in the maintenance of the quality of extended boar semen during long-term storage[J]. Theriogenology, 2013, 80(4): 285–294. |
| [6] | NGUYEN T M D, SEIGNEURIN F, FROMENT P, et al. The 5'-AMP-activated protein Kinase (AMPK) is involved in the augmentation of antioxidant defenses in cryopreserved chicken sperm[J]. PLoS One, 2015, 10(7): e0134420. |
| [7] | ZHU Z D, LI R N, MA G Z, et al. 5'-AMP-activated protein kinase regulates goat sperm functions via energy metabolism in vitro[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 47(6): 2420–2431. |
| [8] | SHABANI NASHTAEI M, AMIDI F, SEDIGHI GILANI M A, et al. Protective features of resveratrol on human spermatozoa cryopreservation may be mediated through 5'AMP-activated protein kinase activation[J]. Andrology, 2017, 5(2): 313–326. |
| [9] |
李榕楠.二甲双胍对猪精子在常温保存期间的作用及其机理研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2018.
LI R N.Effects of metformin on boar sperm at room temperature storage and its mechanism[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2018.(in Chinese) |
| [10] |
王红.冻后牛精子活力与相关蛋白、基因表达关系的研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2012.
WANG H.The research of the relationship about the express of related protein/gene and bull sperm vitality after freezing[D].Yangling: Northwest A&F University, 2012.(in Chinese) |
| [11] |
姜珊.冷冻处理对牛、绵羊、山羊精子形态及受精能力的影响[D].呼和浩特: 内蒙古大学, 2019.
JIANG S.Effects of cryopreservation on sperm morphology and fertilization ability in cattle, sheep and goat[D].Hohhot: Inner Mongolia University, 2019.(in Chinese) |
| [12] |
乌兰托娅.绵羊细管冷冻精液稀释液的研究[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2010.
WU L T Y.The experiment on straw frozen semen of sheep in Diluent[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2010.(in Chinese) |
| [13] |
哈福, 赵有璋. 在绵羊冷冻精液解冻液中添加复合VB提高冻精解冻后品质的研究[J]. 中国草食动物, 2003, 23(5): 19–20.
HA F, ZHAO Y Z. Vitamin B complex as a complements in the thawing dilutions of the ram semen[J]. China Herbivore Science, 2003, 23(5): 19–20. (in Chinese) |
| [14] |
吕春荣, 吴国权, 梁家充, 等.冷冻解冻过程对绵羊精子超微结构的影响[C]//2018年全国养羊生产与学术研讨会.蚌埠, 2018.
LV C R, WU G Q, LIANG J C, et al.Effect of freezing and thawing process on ultrastructure of sheep sperm[C]//Proceedings of the 2018 National Sheep Breeding and Symposium.Bengbu, 2018.(in Chinese) |
| [15] | FUKAMI K, YOSHIDA M, INOUE T, et al. Phospholipase Cδ4 is required for Ca2+ mobilization essential for acrosome reaction in sperm[J]. J Cell Biol, 2003, 161(1): 79–88. |
| [16] |
朱伟杰, 姚汝华. 冷冻保存对人类精子顶体蛋白酶的影响[J]. 暨南大学学报:自然科学版, 1998, 19(3): 105–108.
ZHU W J, YAO R H. Effect of crypreservation on human sperm acrosomal proteinase[J]. Journal of Jinan University: Natural Science, 1998, 19(3): 105–108. (in Chinese) |
| [17] |
侯毅, 刘媛, 刘睿智, 等. 形态正常精子百分率与顶体酶活性的关系[J]. 中国妇幼保健, 2005, 20(23): 3153–3154.
HOU Y, LIU Y, LIU R Z, et al. To explore the relationship between sperm morphology and sperm acrosin activity[J]. Maternal and Child Health Care of China, 2005, 20(23): 3153–3154. (in Chinese) |
| [18] |
宏伟, 倪利平, 田东海, 等. LDL对绵羊精子冷冻保存效果的研究[J]. 畜牧与饲料科学, 2008, 29(4): 29–31.
HONG W, NI L P, TIAN D H, et al. Effects of LDL on cryopreservation of sheep spermatozoa[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2008, 29(4): 29–31. (in Chinese) |
| [19] |
郑云胜.LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2008.
ZHENG Y S.Effects of LDL and cholesterol sulphate on cryopreservation and lipid contents of goat and sheep spermatozoa[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2008.(in Chinese) |
| [20] |
刘程, 方乾, 杨瑞, 等. 白藜芦醇对牛精液冷冻保存的抗氧化作用研究[J]. 畜牧兽医杂志, 2017, 36(3): 4–6.
LIU C, FANG Q, YANG R, et al. Anti-oxidation of resveratrolon cryopreservation of bovine semen[J]. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 2017, 36(3): 4–6. (in Chinese) |
| [21] |
范晓腾.白藜芦醇对猪精子在常温保存和冷打击过程中的保护作用[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2016.
FAN X T.Protective Effect of resveratrol on boar spermatozoa quality during the process of ambient temperature storage and cold shock[D].Yangling: Northwest A&F University, 2016.(in Chinese) |
| [22] | NGUYEN T M D. Impact of 5'-amp-activated protein kinase on male gonad and spermatozoa functions[J]. Front Cell Dev Biol, 2017, 5: 25. |
| [23] | DE LLERA A H, MARTIN-HIDALGO D, GIL M C, et al. AMP-activated kinase AMPK is expressed in boar spermatozoa and regulates motility[J]. PLoS One, 2012, 7(6): e38840. |
| [24] | SWEGEN A, LAMBOURNE S R, AITKEN R J, et al. Rosiglitazone improves stallion sperm motility, ATP content, and mitochondrial function[J]. Biol Reprod, 2016, 95(5): 107. |
| [25] | CÓRDOVA A, STROBEL P, VALLEJO A, et al. Use of hypometabolic TRIS extenders and high cooling rate refrigeration for cryopreservation of stallion sperm:presence and sensitivity of 5'AMP-activated protein kinase (AMPK)[J]. Cryobiology, 2014, 69(3): 473–481. |
| [26] | KUMAR L, YADAV S K, KUSHWAHA B, et al. Energy utilization for survival and fertilization-parsimonious quiescent sperm turn extravagant on motility activation in rat[J]. Biol Reprod, 2016, 94(4): 96. |
| [27] | CALLE-GUISADO V, DE LLERA A H, MARTIN-HIDALGO D, et al. AMP-activated kinase in human spermatozoa:identification, intracellular localization, and key function in the regulation of sperm motility[J]. Asian J Androl, 2017, 19(6): 707–714. |
| [28] | HARDIE D G. AMP-activated protein kinase:an energy sensor that regulates all aspects of cell function[J]. Genes Dev, 2011, 25(18): 1895–1908. |
| [29] | HIROHASHI N, TAMURA-NAKANO M, NAKAYA F, et al. Sneaker male squid produce long-lived spermatozoa by modulating their energy metabolism[J]. J Biol Chem, 2016, 291(37): 19324–19334. |
| [30] | NGUYEN T M D, ALVES S, GRASSEAU I, et al. Central role of 5'-AMP-activated protein kinase in chicken sperm functions[J]. Biol Reprod, 2014, 91(5): 121. |
| [31] | MIYAMOTO T, RHO E, SAMPLE V, et al. Compartmentalized AMPK signaling illuminated by genetically encoded molecular sensors and actuators[J]. Cell Rep, 2015, 11(4): 657–670. |
| [32] | FREITAS M J, VIJAYARAGHAVAN S, FARDILHA M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility[J]. Biol Reprod, 2017, 96(1): 2–12. |
| [33] |
栗瑞兰.内蒙古绒山羊精液冷冻保存方法优化及精液稀释液主要成份的作用机制研究[D].呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2018.
LI R L.Optimization of cryopreservation of inner mongolian cashmere goats semen and study on the action mechanism of the main components of semen extender[D].Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2018.(in Chinese) |
| [34] |
刘睿智, 郭航, 孙妍, 等. 冷冻保存对人精子顶体酶活性影响[J]. 中国实验诊断学, 2004, 8(6): 647–648.
LIU R Z, GUO H, SUN Y, et al. Effects of freezing on acrosin activities of human spermatozoa[J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2004, 8(6): 647–648. (in Chinese) |
| [35] | TCHIR J, ACKER J P. Mitochondria and membrane cryoinjury in micropatterned cells:effects of cell-cell interactions[J]. Cryobiology, 2010, 61(1): 100–107. |
| [36] |
徐振军, 赵力新, 刘冰, 等. 冻融过程对绵羊精子ATP酶活性的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2016(7): 82–84.
XU Z J, ZHAO L X, LIU B, et al. Effect of Freeze-thaw process on sheep sperm ATPase activity[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2016(7): 82–84. (in Chinese) |
| [37] | CHATTERJEE S, GAGNON C. Production of reactive oxygen species by spermatozoa undergoing cooling, freezing, and thawing[J]. Mol Reprod Dev, 2001, 59(4): 451–458. |
| [38] | BILODEAU J F, CHATTERJEE S, SIRARD M A, et al. Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing[J]. Mol Reprod Dev, 2000, 55(3): 282–288. |
| [39] |
孙虎山, 王海娜, 王宜艳. 栉孔扇贝血淋巴中谷胱甘肽还原酶的活性研究[J]. 海洋通报, 2007, 26(6): 108–112.
SUN H S, WANG H N, WANG Y Y. Study on activities of glutathione reductase in the haemolymph of chlamys farreri[J]. Marine Science Bulletin, 2007, 26(6): 108–112. (in Chinese) |
| [40] |
段东升. 氧自由基与精子功能[J]. 男性学杂志, 1990(2): 121–122.
DUAN D S. Oxygen free radicals and sperm function[J]. Andrology Journal, 1990(2): 121–122. (in Chinese) |
| [41] |
徐振军, 郭瑞侠, 刘冰, 等. 绵羊冻融精子过氧化氢酶活性变化的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2016(5): 62–63.
XU Z J, GUO R X, LIU B, et al. Study on the change of catalase activity of sheep freeze-thaw sperm[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2016(5): 62–63. (in Chinese) |
| [42] |
徐振军, 高星海, 刘冰, 等. 冷冻保存对绵羊精子谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2014(2): 68–70.
XU Z J, GAO H X, LIU B, et al. Effect of Cryopreservation on Sheep Sperm Glutathione Peroxidase Activity[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2014(2): 68–70. (in Chinese) |
| [43] |
徐振军, 段超凡, 刘冰, 等. 冻融过程对绵羊精子GR活性的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2017(10): 84–87.
XU Z J, DUAN C F, LIU B, et al. Effect of freeze-thaw process on GR activity of sheep sperm[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2017(10): 84–87. (in Chinese) |
| [44] | BERTOLDO M J, GUIBERT E, TARTARIN P, et al. Effect of metformin on the fertilizing ability of mouse spermatozoa[J]. Cryobiology, 2014, 68(2): 262–268. |