牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是牛的重要致病性支原体之一，可引起牛的肺炎、乳房炎、关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症，给世界养牛业造成了巨大的经济损失[1]。1961年，美国人Hale首次从患乳腺炎病牛的乳汁中分离并鉴定出Mb[2]，但直到1976年才根据16S rRNA序列将其命名为Mb[3]。不同品种的牛对Mb易感性不同，以圈养牛、北美野牛和水牛最为易感[1, 4]。2008年，我国湖北首次暴发了由Mb引起的肺炎重大疫情，其发病率达50%~100%，病死率为10%~50%，给我国养牛业造成了惨重经济损失，并已成为我国犊牛和育肥牛发病和死亡的重要病原之一[5-7]。因此，开展Mb相关研究，将为其相关疾病诊断方法及防控措施的建立提供技术支持，也可为深入研究其致病机制奠定基础。
研究表明，多种酶在支原体的细胞膜有分布，并参与其对宿主的感染和免疫应答，如烯醇化酶[8-13]，鸡毒支原体和肺炎支原体的丙酮酸脱氢酶[14-15]，Mb的果糖二磷酸醛缩酶、亚甲基四氢叶酸-tRNA-(尿嘧啶-5)-甲基转移酶等[16-18]。NADH氧化酶(NADH oxidase, NOX)是一类催化NADH氧化为NAD+的氧化还原酶，其在O2存在条件下，催化NADH氧化为NAD+，同时将O2还原为H2O2或H2O，前者为产H2O2型NADH氧化酶(NOX1)，主要存在于需氧菌，后者为产H2O型NADH氧化酶(NOX2)，存在于厌氧菌或兼性厌氧菌[19-21]。大多数生物NADH氧化酶基本上都是同型二聚体分子，单体相对分子质量约为45~55 ku，亚基大多以1分子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基[22]。研究证实，除催化作用外，某些生物NADH氧化酶尚具有其他功能，如鼠肝中NADH氧化酶参与铜的吸收[23]，链球菌NADH氧化酶与其生物被膜的形成和对宿主的感染有关[24-26]，甲烷杆菌的NOX2有控制其定植的作用[27]，Mb NADH氧化酶(NOX1)参与其对宿主细胞的黏附[28]。但尚无Mb NOX2相关的研究报道。因此，本研究在Mb临洮株nox2基因扩增及原核表达的基础上，对表达产物rMbNOX2的酶促活性、抗原性、rMbNOX2抗体补体依赖的杀支原体活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制作用进行了分析，为深入研究Mb NOX2生物学功能奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株、载体及实验动物 Mb临洮株为本实验室分离保存；Mb兔抗血清为本实验室制备；大肠杆菌感受态细胞购自全式金生物公司；pET-32a(+)购自Novagen公司；新西兰兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。
1.1.2 主要试剂 支原体培养基购自青岛海博生物公司；DNA聚合酶、限制性内切酶与T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生物公司；DNA Marker购自北京康为世纪公司；预染蛋白分子量标准、蛋白定量试剂盒购自碧云天公司；Ni-NAT His Bind购自Novagen公司；NADH购自Roche公司，FAD购自TCI公司，弗氏佐剂购自Sigma公司，羊抗兔IgG-HRP购自Solarbio公司，Bovine plasminogen(PLG)购自Innovative Research公司，NADH oxidase (H2O-forming)购自Creative Enzymes公司，酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司，马血清购自兰州民海生物公司。
1.1.3 主要仪器 洁净工作台为苏州安泰产品；CO2培养箱购自Thermo Fisher Scientific公司；PCR仪购自Eppendorf公司，电泳系统、凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。
1.2 引物的设计参照Mb Hubei-1株nox2基因序列(GenBank No. CP002513.1)设计引物对nox2-F1/nox2-R1与nox2-F2/nox2-R2(表 1)，且nox2-F1和nox2-R2 5′端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，由金唯智生物公司合成。
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表 1 Overlap PCR引物 Table 1 Primers used for overlap PCR |
取Mb培养物5 mL，12 000 r·min-1离心10 min，200 μL PBS重悬并置沸水中10 min后, 迅速冰浴5 min，12 000 r·min-1离心10 min，上清即为Mb基因组粗提物。
nox2-F1/nox2-R1与nox2-F2/nox2-R2引物对分别扩增nox2基因上、下游片段，进而以nox2-F1/nox2-R2，经overlap PCR扩增nox2基因全长。反应体系40 μL：Mb基因组DNA 2 μL，上、下游引物(10 nmol·mL-1)各1 μL，2×PrimeSTAR® Max DNA聚合酶20 μL，ddH2O 16 μL。扩增条件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 25 s, 56 ℃ 25 s, 72 ℃ 50 s, 30个循环；72 ℃延伸5 min，产物回收备用。
1.4 nox2原核表达载体的构建及原核表达nox2扩增产物与pET-32a(+)分别用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，鉴定正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 并经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表达结果。
经SDS-PAGE分离的表达产物转印至NC膜后于5%脱脂乳中，4 ℃过夜封闭，进而浸入1:5 000稀释的Mb兔抗血清中室温孵育2 h，PBST洗涤3次后，于1:8 000稀释的羊抗兔IgG-HRP中室温孵育1.5 h，PBST洗涤后，DAB显色并观察结果。
1.5 表达产物酶促活性的分析200 mL诱导菌液12 000 r·min-1离心10 min，菌体沉淀参照高翔等[29]所述方法纯化重组蛋白，并利用BCA法定量后分析酶活性。
酶促反应体系为2 mL：0.1 mol·L-1，pH 7.5的磷酸钾缓冲液[含1 mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)]1.5 μL，rMbNOX2终质量浓度5 μg·mL-1，FAD终浓度10 μmol·L-1，混匀于25 ℃，孵育5 min后, 加入NADH至终质量浓度为500 μmol·L-1，补充缓冲液至2 mL，混匀后，测定不同时间点反应体系在340 nm处的吸光值。同时设无NADH空白对照组、无rMbNOX2阴性对照组和NADH oxidase阳性对照组。计算公式：
| $ \begin{aligned} &\text { 比活力 }\left(\mathrm{u} \cdot \mathrm{mg}^{-1}\right)=\\ &\frac{\Delta \mathrm{A} \cdot \min ^{-1} \times \text {测试体积 } \times \text { 稀释倍数 }}{\text { 吸收系数 } \times \text { 酶体积 } \times \text { 蛋白质 }\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{mL}^{-1}\right)} \end{aligned} $ |
取纯化的rMbNOX2适量，参照高翔等[29]所述方法免疫2只新西兰白兔，制备rMbNOX2抗血清并测定抗体效价。
1.7 Mb细胞膜与胞质中NOX2的Western blot检测参照高翔等[29]所述方法，提取Mb膜蛋白，并应用Western blot检测Mb细胞膜与胞质中的NOX2。
1.8 补体介导的体外杀支原体试验取5 mL对数生长中后期的Mb液体培养物，4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，无菌PBS洗涤3次，重悬至1.5×109CFU·mL-1。试验用血清56 ℃灭活30 min。试验体系300 μL：Mb悬液180 μL、rMbNOX2抗血清60 μL，于1.5 mL离心管混匀后，37 ℃孵育，期间轻轻振荡2次，30 min后，加入60 μL补体，混匀于37 ℃，孵育1 h后，10倍比稀释，选择103、104、105稀释度的悬液各取100 μL涂布60 mm培养皿，每个稀释度平行3个重复。37 ℃，5% CO2培养箱中培养5~7 d计数菌落。试验重复3次，并设Mb菌体抗血清对照组、免疫前血清对照组、补体对照组和空白组。杀菌率计算公式：
| $ \text { 杀菌率 }(\%)=\frac{\mid \text { 试验组 } \mathrm{CFU}-\text { 阴性组 } \mathrm{CFU} \mid}{\text { 补体组 } \mathrm{CFU}} \times 100 \% $ |
EBL细胞于6孔细胞板长至单层后，随机取2孔胰酶消化并计数细胞，其余细胞孔用终浓度2.5 U·mL-1PLG处理2 h。期间，取5 mL对数生长中后期的Mb菌液，12 000 r·min-1离心5 min，无菌PBS洗涤3次，用37 ℃预热的无菌DMEM悬浮后，按MOI为200取样，无菌DMEM定容至980 μL后，加入20 μL灭活rMbNOX2抗血清(1:50)，混匀，并37 ℃水浴1 h后离心，用1 mL无菌DMEM重悬后感染预处理的细胞(感染前用无抗生素无血清DMEM洗3次)，37 ℃孵育2 h。无菌PBS充分洗涤后，加1 mL 0.25%胰酶消化裂解，10 min后，加1 mL预热的Mb培养基，混匀后，室温静置10 min，取100 μL细胞裂解物加入到400 μL预热Mb液体培养基中，依次10倍比稀释，选择103、104、105稀释度悬液各取100 μL涂布固体培养基。5% CO2，37 ℃培养5~7 d后，计数菌落，并计算黏附抑制率。分别设免疫前兔血清对照组、无血清空白组及Mb抗血清对照组。试验重复3次，每次分别设3个重复。
| $\begin{aligned} &\text { 黏附抑制率(%) = }\\ &\frac{\mid \text { 试验组 } \mathrm{CFU}-\text { 阴性组 } \mathrm{CFU} \mid}{\text { 空 白组 } \mathrm{CFU}} \times 100 \% \end{aligned} $ |
Overlap PCR扩增产物与pET-32a(+)分别经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接并转化大肠杆菌Trans5α，涂布氨苄抗性LB平板后长出的单菌落扩增培养后提取质粒酶切，目的条带约1 350 bp(图 1)。测序正确的质粒命名为pET-nox2。比较Mb临洮株与GenBank中其他菌株nox2基因序列，结果表明，除与Mb JF4278 株相似性为98%外，与其余Mb菌株相似性均为99.93%，而与无乳支原体的相关基因，相似性仅为81%~82%。因此，nox2基因可作为建立基于核酸的Mb检测或相关疾病诊断方法的候选靶标。
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M. DNA相对分子质量标准; 1、2. pET-nox2经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切的产物 M. DNA marker; 1, 2. Products from pET-nox2 digested with BamHⅠ and XhoⅠ 图 1 pET-nox2的双酶切鉴定 Fig. 1 Identification of pET-nox2 by double endonucleases digestion |
pET-nox2转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞经IPTG诱导后，应用SDS-PAGE检测，结果显示，重组蛋白rMbNOX2呈可溶性表达，其大小约为67 ku(图 2A)。Western blot结果显示，重组蛋白rMbNOX2可被Mb兔抗血清有效识别(图 2B)。
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A. SDS-PAGE分析；B. Western blot分析。M.蛋白质分子质量标准；1.诱导的pET-32a(+)转化E.coli (DE3); 2.诱导的pET-nox2转化E. coli (DE3); 3.诱导的pET-nox2转化E. coli (DE3)裂解上清；4.诱导的pET-nox2转化E.coli (DE3)裂解沉淀；5.纯化的重组蛋白rMbNOX2 A. SDS-PAGE analysis; B. Western blot analysis. M. Protein molecular weight marker; 1. Induced pET-32a(+)/DE3; 2. Induced pET-nox2/DE3; 3. Supernatant of pET-nox2/DE3; 4. Sediment of pET-nox2/DE3; 5. Purified recombinant protein rMbNOX2 图 2 重组蛋白rMbNOX2的SDS-PAGE与Western blot分析 Fig. 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the recombinant protein rMbNOX2 |
酶促活性检测结果显示，重组蛋白rMbNOX2具有良好的酶促活性(图 3)，且其比活力为194.9 U·mg-1。
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图 3 rMbNOX2的酶促活性分析 Fig. 3 Analysis of enzymatic activity of rMbNOX2 |
Mb胞质蛋白和膜蛋白等体积上样后, 应用Western blot分析NOX2在Mb细胞膜及细胞质中的分布，结果显示，Mb NOX2在其细胞膜和细胞质中均有分布，但在细胞质中的分布量多于细胞膜(图 4)。
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M.蛋白质分子质量标准；1~2.牛支原体菌体蛋白；3.牛支原体膜蛋白；4.牛支原体胞质蛋白 A. Western blot analysis. M. Protein molecular weight marker; 1-2. Total cellular proteins of Mb; 3. The membrane proteins of Mb; 4. The cytosolic proteins of Mb 图 4 Mb细胞中NOX2定位的Western blot检测 Fig. 4 Determination of the localization of Mb NOX2 by Western blot |
补体介导的杀支原体试验中，计数菌落并计算出各组CFU值，结果表明，rMbNOX2兔抗血清具有明显的补体介导杀支原体作用，且杀菌率高达57.86%(表 3)。
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表 3 兔抗rMbNOX2抗血清的杀菌率 Table 3 Bactericidal rate of rabbit anti-rMbNOX2 serum |
根据菌落生长情况选择适当培养皿计数菌落并计算黏附抑制率。结果显示，rMbNOX2抗血清可抑制Mb对EBL细胞的黏附，且抑制率高达84.20%(表 4)，提示NOX2可能参与Mb对宿主细胞的黏附，进而与Mb对宿主的感染相关。
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表 4 不同处理组CFU值 Table 4 CFU values of different treatment groups |
目前，Mb感染呈世界性流行，其感染牛所致病情复杂，难于防控[30-32]，给全球养牛业造成了巨大经济损失[33-38]。因此，Mb相关的研究，必将为相关疫情的预防和控制奠定理论和技术基础。
研究发现，某些微生物的NADH氧化酶与其致病性相关[25, 39-40]，Mb NOX1亦参与其对宿主细胞的黏附[28]，但尚无Mb NOX2的研究报道。因此，本研究基于Mb临洮分离株nox2基因的原核表达，对NOX2在其细胞内的分布和其免疫原及感染相关特性进行了研究。
序列分析表明，Mb nox2基因具有1个编码色氨酸的密码子TGA，但TGA密码子在大肠杆菌中的作用是终止密码子[18]。因此，为在大肠杆菌中有效表达nox2基因，本研究采用overlap PCR技术将密码子TGA突变为同义密码子TGG，从而使该基因在大肠杆菌中获得有效表达，所获得的重组蛋白相对分子质量约为67 ku，从而为相关研究工作的顺利开展和完成奠定了基础。
rMbNOX2的酶促活性检测证实该蛋白具有良好的酶促活性，能够有效催化NADH的氧化脱氢，为试验研究的可靠性提供了保障。动物免疫试验及间接ELISA和Western blot结果表明，重组蛋白rMbNOX2具有良好的免疫原性与反应原性，可作为Mb新型疫苗的候选抗原。而图 3B中的一些杂带，可能是大肠杆菌与Mb的某些蛋白具有相关的抗原表位所致，或免疫兔体内本身存在一定水平的大肠杆菌抗体效价。Western blot检测结果证实，NOX2在Mb细胞膜上亦有分布，因而可能参与Mb对宿主细胞的感染及其免疫应答。抗体介导的补体杀菌试验表明，rMbNOX2抗体与支原体特异性结合后有效激活补体，从而发挥细胞毒性作用，导致Mb的崩解，进一步证实了Mb NOX2与宿主对其免疫应答有关。黏附和黏附抑制试验结果显示，NOX2抗体可抑制Mb对宿主细胞EBL的黏附，因此可能参与该病原对宿主的感染过程。而已有研究亦证实，不同动物源性支原体的多种酶都参与支原体对宿主细胞的黏附[10-15, 18, 28]。
4 结论本研究在nox2基因的克隆和原核表达的基础上，证实Mb NOX2蛋白是一种膜蛋白抗原，其抗体可介导补体依赖性的细胞毒性杀支原体作用，并可抑制Mb对宿主细胞的黏附，从而可能与Mb的免疫应答和感染相关。研究结果为该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。
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