葛根芩连汤属《伤寒论》中治疗“下利”的代表方剂，由葛根、黄连、黄芩和炙甘草4味药组成，方剂中葛根为君药，入脾胃经，具有解表退热，升阳止泻之功，臣药黄芩和黄连，清热燥湿，厚肠止利，佐使甘草甘缓和中[1]。葛根芩连汤具有解表清里、升清止利、治疗协热下利证的功效，正好切中大肠湿热证的病机。脾胃湿热下注大肠则成为大肠湿热证，以发热、大便溏而不爽或有黏液等为主要临床症状[2]，如湿热之邪导致的猪流行性腹泻、仔猪腹泻，均属于大肠湿热证。研究表明，葛根芩连汤对仔猪腹泻和猪流行性腹泻疗效突出[3-5]，但治疗机制未见报道，葛根芩连汤治疗猪腹泻的作用机制仍是需要进一步研究的关键科学问题。网络药理学是一种基于受体理论和生物网络技术，其“多成分网络靶点作用”的研究模式，为中药及其复方治疗机制，新用途等方面的研究提供了新的研究思路和研究方法，近几年，也被用于中兽医治疗机制的研究[6-7]。本研究基于中药多成分、多靶点作用的研究思路，应用网络药理学技术，通过对葛根芩连汤成分、靶点、生物功能及通路分析，探讨葛根芩连汤治疗猪腹泻的机制，为猪病临床新应用寻找方向。
1 材料与方法 1.1 葛根芩连汤活性化合物-靶点网络的构建借助中药系统药理学分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/index.php)检索并筛选葛根芩连汤组方药物葛根、黄连、黄芩和甘草中符合口服利用度(OB)≥50%和类药性(DL)≥0.18的化学成分。通过查阅文献，补充四味药中不符合筛选条件，但为组方药物主要功效成分或已报道具有明确止泻作用的化合物，作为最终活性化合物及相关靶标蛋白。将化合物-靶点通过Cytoscape 3.7.1软件构建葛根芩连汤化合物-靶点网络，分析化合物和靶点间的度(degree)值。
1.2 葛根芩连汤与猪腹泻疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建将葛根芩连汤相关靶点基因与猪腹泻疾病相关基因(表 1)带入在线网站STRING 11.0(https://string-db.org)，物种选择为“Sus scrofa”，打分值设置>0.7，获取葛根芩连汤作用于猪腹泻疾病的PPI网络信息，删去无关联蛋白，通过Cytoscape 3.7.1软件构建葛根芩连汤与猪腹泻疾病靶点PPI网络图，分析葛根芩连汤治疗猪腹泻的相关靶点。
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表 1 猪腹泻的相关靶点 Table 1 Swine diarrhea-related targets |
将葛根芩连汤作用于猪系统水平上的靶点蛋白基因上传在线数据库DAVID (https://david.ncifcrf.gov)，物种限定为“Sus scrofa”，设定阈值P < 0.05，进行GO(gene ontology)生物学过程富集分析。对葛根芩连汤作用于猪腹泻的关键蛋白进行KEGG(KEGG pathway analysis)代谢通路富集分析，并通过Cytoscape 3.7.1软件构建靶点-信号通路网络图，分析葛根芩连汤治疗猪腹泻的作用机制。
2 结果 2.1 化合物-靶点相互作用网络利用TCMSP平台筛选出55个(葛根1个，黄连5个，黄芩7个，甘草42个)符合条件的化合物，根据文献报道合并四味药未筛选出的主要功效成分和明确止泻作用的化合物(葛根2个，黄芩3个，黄连3个)，共计63个化合物。并通过化合物有无靶点筛选后，筛选出61个(葛根3个，黄连7个，黄芩9个，甘草42个)化合物，去除单味药之间的重复成分后共获得60个活性成分。如图 1所示，化合物-靶点网络共包括266个节点(60个化合物，206个靶点)和1 187条边，葛根、黄芩、黄连和甘草的化合物分子分别由黄色、绿色、蓝色、紫色节点代表，其中，橙色节点代表葛根与甘草的共同化合物，节点大小与Degree值相关，红色节点代表靶点，内圈红色节点为连接化合物>20个的靶点，该网络说明葛根芩连汤治疗腹泻可能是多成分、多靶点作用的结果。在葛根芩连汤治疗腹泻网络中，平均每个化合物有平均靶点数19.8个，每个靶点平均与3.4个化合物相互作用，度排名前4的成分是葛根的大豆苷元(daidzein)、葛根素(puerarin)，黄芩的汉黄芩苷(oroxindin)，葛根、甘草共有成分芒柄花素(formononetin)，靶点>30的化合物为葛根芩连汤的关键成分(表 2)。从靶点的角度来看，连接化合物>10个的靶点有34个，连接化合物>30个的靶点有14个。其中，前列腺素合酶G/H-2(prostaglandin G/H synthase 2)连接55个靶点，其次是雌激素受体(estrogen receptor)和钙调蛋白(calmodulin)连接47个靶点，连接化合物>30个的靶点为葛根芩连汤治疗疾病的关键靶点(表 3)。
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黄色、紫色、蓝色和绿色三角形节点分别代表葛根、甘草、黄连和黄芩的化合物，橙色三角形节点为甘草与葛根共同化合物，红色圆形节点代表靶点，节点大小与degree值成正比，内圈红色圆形节点为degree值>20的靶点 The yellow, purple, green and blue triangle nodes represent the compounds of Radix Puerariae, Licorice, Coptidis Rhizoma and Scutellariae Radix, respectively. The orange triangle nodes are the common compound of Radix Puerariae and Licorice.The red circle nodes represent targets. The node size is proportional to the node degree. The central nodes of red circle are targets that the degree value is up to twenty 图 1 化合物-靶点网络图 Fig. 1 Compound-target network |
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表 2 葛根芩连汤度>30的活性化合物基本信息 Table 2 Basic information for degree>30 of active compounds in Gegen Qinlian decoction |
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表 3 葛根芩连汤度>30的靶点基本信息 Table 3 Basic information for degree>30 of targets in Gegen Qinlian decoction |
为了更好地理解葛根芩连汤作用于猪病的作用机制，利用STRING数据库(https://string-db.org)构建了葛根芩连汤的PPI网络，打分值>0.7，显示PPI网络包括149个节点，344条相互关系，去掉无相互关系的节点37个，其余112个节点利用Cytoscape 3.7.1软件绘制葛根芩连汤作用于猪腹泻靶点的PPI网络图(图 2)。直接与猪腹泻相关靶点连接的化合物靶点55个，其中，TP53、TNFB1、TNFA1、MAPK1、MAPK3为化合物与猪腹泻共同靶点。根据节点的degree值，绘制前20个关键蛋白质节点的条形图(图 3)，其中，TP53、TNF、IL6、IL8、JUN、STAT3等出现频率较高，前20个关键蛋白质包含2个猪腹泻靶点，除NOS3外均与猪腹泻靶点直接相关，这些靶点蛋白在葛根芩连汤治疗猪腹泻中起关键作用。
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红色节点为猪腹泻相关靶点，橙色节点为化合物与猪腹泻共同靶点，黄色节点为直接与猪腹泻相关靶点连接的化合物靶点，蓝色节点为不直接与猪腹泻相关靶点连接的化合物靶点，节点大小与degree值成正比 The red nodes are the targets of swine diarrhea, orange nodes are the common targets of compounds and swine diarrhea, yellow nodes are the direct correlation targets of compounds and swine diarrhea, blue nodes are the indirect connect targets of compounds and swine diarrhea. The node size is proportional to the node degree 图 2 葛根芩连汤与猪腹泻靶点PPI网络图 Fig. 2 The PPI network of Gegen Qinlian decoction and swine diarrhea |
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图 3 PPI网络图中关键靶点的度 Fig. 3 The degree of key targets in PPI network |
通过DAVID中GO功能富集分析得到GO条目105个(P < 0.05)，其中，生物过程(BP)条目69个，占66%，分子功能(CC)条目11个，占10%，细胞组成(MF)相关条目25个，占24%，主要GO条目见图 4。
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图 4 葛根芩连汤靶标对GO富集分析 Fig. 4 GO analysis results of Gegen Qinlian decoction targets |
通过DAVID对核心靶点进行KEGG通路富集筛选，得到9条信号通路(FDR < 0.05)，涉及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、病毒致癌机制(viral carcinogenesis)、甲状腺癌(thyroid cancer)、前列腺癌(prostate cancer)等信号通路，核心靶点-通路网络图如图 5所示。
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红色方形节点表示通路，蓝色圆形节点表示靶点，线表示通路与靶点的相互关系，节点大小与degree值成正比 Red rectangle nodes are pathways. Blue circle nodes are targets. Line represent the correlationship of pathway and target. The node size is proportional to the node degree 图 5 核心靶点-通路网络 Fig. 5 Core target-pathway network |
葛根芩连汤以清热坚阴止利为主，兼以透表，具有解表清里之功，用以治疗泻热下利证，是中医内科学治疗大肠湿热证泄泻的经典方剂[4-5, 8]，也常用于猪腹泻的治疗。在临床上葛根芩连汤可用于治疗仔猪菌痢、仔猪中毒性肠炎，仔猪白痢以及马、水牛等动物的中毒性痢疾[3, 9-11]。研究表明，葛根芩连汤治疗腹泻主要与解热、抗炎、抑制肠道蠕动、调节肠道菌群有关[1]，但其作用机制尚不明确。本研究采用TCMSP中药系统药理学平台，研究葛根芩连汤4味中药的有效成分，分析化合物、靶点、猪腹泻之间的关系，探讨了葛根芩连汤多成分、多靶点、多途径的协同治疗机制及信号通路。
葛根芩连汤主要通过葛根的大豆苷元、葛根素、芒柄花素，黄芩的汉黄芩苷、黄芩素，黄连的小檗碱，甘草的柚皮素等治疗猪腹泻。现代药理学研究表明，葛根芩连汤中作用最强的前7个化合物在止泻、抗菌、抗炎、解热作用中起到不同程度的作用。葛根素可以抑制肠黏膜脂质过氧化，降低肠黏膜诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性，抑制NO的产生或释放，从而起到保护肠黏膜，发挥抗炎、止泻作用[12]。葛根素和大豆苷元素可通过抑制胃排空和小肠推进率发挥止泻作用[13]，此外，大豆苷元还具有耐缺氧、抗肿瘤、保护心血管、雌激素样作用等药理作用[14-15]。芒柄花素可通过下调结肠组织NLRP3、ASC、IL-lβ蛋白表达，减轻小鼠结肠炎临床症状、结肠黏膜损伤、炎症细胞浸润[16]。汉黄芩苷可通过抑制iNOS基因表达，NO、前列腺素E2、促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的合成与释放发挥抗炎作用[17]。黄芩素不仅对大肠杆菌有较强的抑制作用[18]，还可抑制花生四烯酸的代谢而产生抗炎解热作用[19-20]。小檗碱具有抑菌、抗炎、降低结肠损伤作用，可通过钙通道阻滞作用缓解腹部疼痛、蠕动障碍等腹泻症状，常用于治疗肠道感染及细菌性痢疾[21]。柚皮素具有抗菌、抗炎、抗氧化等药理作用，可通过抑制炎症细胞浸润、炎症介质释放、iNOS活性等发挥抗炎作用[22-23]。综上所述，葛根芩连汤主要通过多种化合物的多靶点多作用通路共同实现治疗猪腹泻的目的。
葛根芩连汤化合物-靶点的关键靶点是前列腺素合成酶G/H-2、雌激素受体、钙调蛋白、iNOS、热休克蛋白HSP90、雄激素受体等。前列腺素合成酶G/H-2可参与调节包括直肠结肠癌、炎症等128种不同的疾病，是前列腺素E2合成的关键酶，前列腺素E2参与机体发热与炎症等的调节[24]。雌激素受体与雄激素受体不仅与生殖相关，还与机体肥胖、糖脂代谢相关。雌激素及其受体还可以通过调节下丘神经肽水平达到调节脂质代谢。雄激素受体具有维持机体内激素平衡，刺激蛋白质合成代谢的作用。钙调蛋白为钙离子感受器，能与Ca2+结合, 通过Ca2+-钙调蛋白-肌球蛋白轻链激酶依赖机制，在胃
肠道基本紧张状态的维持、胃排空以及小肠推动等基本动力方面[25]与肠黏膜上皮屏障功能维持中发挥重要的调节作用[26]。研究表明，猪腹泻的发生与血清NO含量、iNOS活性有关，iNOS可受细菌肠毒素的刺激和肠道的损伤诱导NO持续过量合成，导致内皮细胞损伤，产生炎症导致机体腹泻[27]。通过抑制iNOS活力，可在短期内控制NO含量，调节水分和离子转运，修护维持肠道动态平衡，调节炎症反应的发生，恢复机体组织损伤改善腹泻[27]。HSP90可通过结合激素受体和激酶，参与信号转导及功能的调节[28-30]。上述结果提示了葛根芩连汤作用的靶点目前多是从基因多态性角度与腹泻之间的关联，关联的蛋白及信号通路调控有待进一步分析。
葛根芩连汤的作用靶点网络分析可知，葛根芩连汤直接作用于猪的关键靶点是TP53、TNF、IL-6、JUN、IL-8、STAT3等。TP53是葛根芩连汤与猪腹泻疾病共同靶点，是一个重要的抗癌基因，可以使癌细胞发生凋亡，从而预防癌症，如结肠黏膜恶变，也可以介导细胞信号调节细胞正常生命[31-32]。TNF具有抗肿瘤、抗病毒、激活免疫细胞，诱发炎症反应作用，在机体自稳、防御反应中起到重要作用[33]，TNF还是一个重要的内源性致热原，是不同病因所致发热机制中的一个共同环节[34]。IL-6等促炎症细胞因子是研究腹泻的常用指标，腹泻发生时血清IL-6明显升高[34]，通过抑制IL-6可以促进肠道炎症的改善与肠黏膜的修复。STAT3能够被IL-6以及IL-6共有gp130受体的相关细胞因子活化，IL6/STAS3是溃疡性结肠炎中的一条重要通路[35]，STAT3活化激活T细胞的炎症通路，破坏了肠道黏膜屏障的完整性，导致肠道炎症发生[36]。IL-8可以通过趋化中性粒细胞，促进肠道组织中的炎性细胞浸润[37]。JUN可受TNF等诱导在多种组织器官的损伤、应激、细胞生存与凋亡等方面起着重要调节作用[38]。对这些核心靶点通过GO富集分析和KEGG通路注释分析，葛根芩连汤治疗猪腹泻的核心基因功能主要体现在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路作为经典的抗凋亡信号通路，可参与调控多种肿瘤[39]、肝/肺纤维化[40-41]和缺血性再灌注损伤[42]及糖尿病[43]等病理过程。研究证实，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路一旦被激活，引起Akt磷酸化，进而通过p53非依赖的方式抑制细胞凋亡。该信号通路与葛根芩连汤核心靶点MAPK1、IFNA1、IFNB1、GSK3B、MAPK3、TP53、KDR有关。葛根芩连汤的多个靶点，多种通路与治疗腹泻的机制相吻合，且具有抗癌抗肿瘤的靶点，为后期研究提供参考。
4 结论通过网络药理学方法构建了葛根芩连汤治疗猪腹泻的化合物-靶点-通路网络模型，结果显示，葛根芩连汤可以通过TP53、TNF、IL-6、IL-8、JUN、STAT3等靶点调控腹泻与发热。
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