据可查资料记载，1992年前后，在我国河南省永城县桥和乡^[1]就有关于鹅痛风的报道，此后国内江苏^[2]、山东^[3]、福建^[4]等地的畜牧兽医部门先后各自报道了当地的鹅痛风病，当时的发病率很低，多诊断为饲喂高蛋白日粮引起的营养代谢病。2005年以后，随着我国养鹅业的快速发展，各地有关鹅痛风的报道逐年增多^[5-8]，有些病例在20~30日龄甚至50日龄亦发病，特别是2017年以来，雏鹅痛风病迅速传遍全国^[9]，给我国的养鹅业带来了巨大的经济损失，严重威胁我国养鹅业的发展。近年来的鹅痛风病主要侵害15日龄以内的雏鹅，各品种的鹅均易感，发病高峰在10日龄前后，临床上可致雏鹅死亡或生长发育受阻，死亡率30%~40%，饲养管理条件差的可高达50%左右，耐过鹅因消化吸收障碍而成为僵鹅。剖检死亡雏鹅和僵鹅，主要表现为全身各脏器的严重尿酸盐沉积，尤以心、肝和肾最为严重，造成心肌细胞、肝细胞和肾小管上皮细胞的变性、坏死，肾小管上皮细胞的损伤导致机体尿酸盐排泄障碍，久积体内形成痛风。实践中，通过改变饲料配方降低日粮蛋白水平^[10]、饮用小苏打水通肾^[11]以及注射单一新型鹅星状病毒高免卵黄抗体均无明显改善。因此，加强对雏鹅痛风病的病因研究对于该病的防控及保护我国养鹅业的发展具有重大意义。

目前，大多数研究表明，该病的病原因素是新型鹅星状病毒^{[9, 12]}，但在实验室回归动物结果不稳定，死亡率为20%~25%，且攻毒雏鹅的痛风率明显低于自然感染情况，怀疑与其他可能潜在致病原有关。为进一步确定造成该病的病原因素，本研究对采自全国多个省份的典型鹅痛风样品进行了病原的分离鉴定和系统进化分析，结果表明，造成雏鹅发生痛风病的病原为鹅星状病毒FLX的变异株病毒和新型鹅星状病毒，两种不同基因型的鹅星状病毒协同作用导致了该病的发生和大面积流行，为该病的深入研究和综合防控奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与实验动物

一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa PrimeScript^TMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 RR055A)，RNA提取试剂盒(TIANDZ 71001)，DNA提取试剂盒(TIANDZ 70701)，Premix Taq(TaKaRa RR902A)，dNTPs(10 mmol·L^-1)(TaKaRa 639125)，DNA Marker DL2000(TaKaRa 3427Q)，反转录酶Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H-)(TaKaRa 2641Q)，pMD18-T Vector(TaKaRa 6011)，DNA gel extraction(BioFlux BSC02M1)，E.coli DH5α competent cells(TaKaRa 9057)，DMEM细胞培养液(GBICO 21885108)，新生胎牛血清(GBICO 12662029)，甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)，佐剂(由公司生产技术部提供)，鹅种蛋和1日龄雏鹅购自山东陈氏鹅业有限公司(四川白鹅)，9日龄SPF鸡胚和21日龄SPF鸡均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 病毒分离鉴定

1.2.1 病料来源 　　2017年10月-2019年5月，广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等地送检的5~50日龄病、死雏鹅，雏鹅外观跗、趾、指关节肿胀，白色游离尿酸盐沉积，病鹅喜蹲伏、双蹼不敢着地、闭目嗜睡，全身不自主地震颤。剖检可见全身脏器严重的痛风，白色尿酸盐沉积在心、肝和肾等部位，部分病例在腺胃内表面、皮下和胆囊内亦有尿酸盐沉积。

1.2.2 病原分离 　　无菌取适量病死雏鹅的肝和肾，加入5倍体积的PBS，剪碎、充分匀浆并反复冻融3次，8 000 g离心15 min，取上清, 经0.22 μm滤器过滤除菌后进行病毒分离操作。方法1：经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚和鹅胚，0.2 mL·枚^-1，37 ℃恒温箱中培养，每天照胚2次，连续观察6 d，并记录死胚情况。将死胚和不死胚4 ℃过夜冻胚，收获尿囊液，按上述方法用上述尿囊液连续盲传5代。方法2：接种铺满T25细胞瓶的LMH细胞单层，5%接毒量37 ℃吸附1 h，倒掉吸附液后加入含2%胎牛血清的维持液5 mL，于37 ℃连续培养5~7 d，每天观察细胞状态。待细胞液变黄，将细胞瓶在-20 ℃反复冻融3次，经5 000 g离心后取上清以上述同样的方法连续盲传5代。

1.2.3 病原鉴定

1.2.3.1 血凝特性测定　　用常规方法配制1%鸡、兔、小鼠的红细胞悬液，按微量血凝试验方法^[13-14]测定F1~F5代SPF鸡胚和鹅胚尿囊液的血凝活性。

1.2.3.2 PCR鉴定　　分别用RNA和DNA提取试剂盒提取F1~F5代SPF鸡胚尿囊液、鹅胚尿囊液和LMH细胞液的RNA和DNA，用PCR或RT-PCR的方法对呼肠孤病毒、鹅多瘤病毒、鹅细小病毒、鹅星状病毒、鸭星状病毒、鹅冠状病毒等(表 1)常见鹅病病原进行核酸检测，RT-PCR反应体系(25 μL)：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，上、下游引物(20 μmol·L^-1)各0.5 μL，RNA模板5 μL，ddH₂O补加至25 μL。RT-PCR反应条件：50 ℃反转录30 min；95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存；PCR反应体系(20 μL)：Premix Taq 10 μL，上、下游引物(20 μmol·L^-1)各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。RT-PCR和PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

1.3 回归试验

将100只1日龄雏鹅平均分为4组，于动物隔离器中饲养，进行试验前采集每只雏鹅的泄殖腔拭子，RT-PCR直接检测鹅星状病毒核酸为阴性，并用10日龄鹅胚连续进行5代次盲传，均未分离到鹅星状病毒。第1组雏鹅颈部皮下接种鹅胚传代纯化的F4代无菌鹅胚尿囊液(只有SCCD株)，5×10^5.0EID₅₀·只^-1；2组雏鹅颈部皮下接种LMH细胞传代纯化的F4代LMH细胞液(只有SDPD株)，10^6.0EID₅₀·只^-1；第3组雏鹅颈部皮下接种鹅胚传代纯化的F4代无菌鹅胚尿囊液(只有SCCD株)和LMH细胞传代纯化的F4代LMH细胞液(只有SDPD株)，(2.5×10^5.0EID₅₀+5×10^5.0EID₅)·只^-1；第4组雏鹅为对照，颈部皮下接种无菌PBS，1 mL·只^-1，从攻毒后第2天开始每组随机采集11只雏鹅泄殖腔拭子进行RT-PCR检测排毒情况，直至攻毒后第14天，将PCR条带的亮度用Quantity One软件(Bio-Rad Inc.)转化成灰度值后进行分析。采集攻毒后第5天后死亡的雏鹅肝和肾组织，研磨后，离心、过滤，接种10日龄鹅胚绒毛尿囊膜，收集5 d后的尿囊液进行鹅星状病毒核酸的检测。攻毒后第21天，对以上4组剩余鹅进行称重，用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)程序进行方差分析，显著性检验采用Duncan氏法。

1.4 基因组扩增及测序分析

根据GenBank收录的鹅星状病毒基因组序列，设计特异性引物(表 2)对分离的鹅星状病毒进行基因组扩增，将扩增产物进行胶回收并连接到pMD19-T载体上，挑选阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序，利用MegAlign对测序结果进行序列拼接，得到完整的病毒基因组序列。

1.5 基因组进化分析

用Mega6.0软件，将本研究测得的鹅星状病毒分离株基因序列与GenBank收录的鹅星状病毒基因序列进行系统发育分析，采用Kimura 2参数距离在邻接法Neighbour-joining method NJ分析中以自展法Bootstrap进行程序分析，重复数为1 000。

1.6 高免血清的制备及血清交叉中和试验

1.6.1 高免血清的制备 　　将纯化后的F4代鹅星状病毒SDPD株和SCCD株抗原浓缩至病毒含量为10^6.0EID₅₀·0.1 mL^-1，然后加入终浓度0.1%甲醛溶液，37 ℃灭活20 h，加入兽用白油乳化后制成疫苗。将鹅星状病毒SDPD株和SCCD株疫苗各免疫21日龄SPF鸡5只，0.5 mL·只^-1，每隔7 d免疫1次，连续免疫3次，于三免后14 d采血获得高免血清。

1.6.2 血清交叉中和试验 　　按Reed-Muech法计算EID₅₀，采用固定病毒稀释血清的方法，将SCCD株和SDPD株阳性血清在10日龄鹅胚绒毛尿囊膜和LMH细胞上进行交叉中和效价测定，根据免疫学计算方法$R = \sqrt {r1 \cdot r2} $，计算两个毒株之间的抗原相关性，其中，R为两个毒株间抗原相关指数，r1=异源血清效价1/同源血清效价1，r2=异源血清效价2/同源血清效价2，R值越小，抗原性差异越大。

2 结果 2.1 病原分离、鉴定与纯化

2.1.1 病原分离 　　病料滤液接种10日龄鹅胚绒毛尿囊膜后前几代次鹅胚无明显变化，F4代以后，鹅胚开始出现规律性死亡，死亡时间集中在48~120 h，代次越高，死亡时间越靠前；胚体水肿、通体发红，绒毛尿囊膜增厚、水肿，膜上附有乳白色沉淀物，肝呈现斑驳样坏死(图 1)，将疑似分离物纯化后标记为SCCD；病料滤液接种LMH细胞后经过3代盲传，无CPE产生，将疑似分离物纯化后标记为SDPD。

2.1.2 核酸检测 　　将以上病原分离试验中的鸡胚传代分离物、鹅胚传代分离物和LMH细胞传代分离物进行常见鹅病病原核酸检测，结果表明，鸡胚尿囊液中未检测到疑似病原；F1~F2代鹅胚尿囊液和F4~F5代LMH细胞液检测到了一种鹅星状病毒，暂命名为鹅星状病毒SDPD株；F3~F5代鹅胚尿囊液检测到了另一种鹅星状病毒，暂命名为鹅星状病毒SCCD株。

对采集的67份鹅痛风样品逐一进行病原分离并检测，结果表明(表 3)，所有痛风样品均能够分离和检测到鹅星状病毒，用病原分离的方法确诊94.03%的样品是两种鹅星状病毒混合感染。说明各品种的鹅均易感鹅星状病毒，日龄越小，其发病率和死亡率越高，30~50日龄的鹅感染后一般无明显死亡，多因继发感染细菌而使死亡率升高。经调查取证，混合感染两种鹅星状病毒病例多是15日龄以下的雏鹅，大群发生痛风的比例以及大群死淘率均较高，而单纯感染新型鹅星状病毒的病例多是30~50日龄雏鹅，无论痛风比例还是大群死淘率均较低。

2.1.3 病原纯化 　　LMH细胞接种试验表明，鹅星状病毒SCCD株不能在其上生长，因此，通过LMH细胞传代获得了1株纯净的鹅星状病毒SDPD株，并用其制备成高免血清；鹅星状病毒SCCD株能在鹅胚上稳定传代，通过有限稀释尿囊液结合鹅星状病毒SDPD株高免血清中和的办法多次鹅胚传代获得繁殖稳定且成分单一的鹅星状病毒SCCD株。

2.2 回归试验

将本研究新分离的两株鹅星状病毒以单独、混合方式接种1日龄健康雏鹅，结果表明，单独攻毒组和混合攻毒组雏鹅在攻毒后第2天均出现2~3 d的间断性精神不振现象，并伴随着剧烈的腹泻现象，泄殖腔周围羽毛污秽、糊肛现象严重，其中，以第1组和第3组雏鹅最为严重；第1组雏鹅于攻毒后第2~7天出现死亡，死亡率为32%，第2组雏鹅于攻毒后第3~11天出现死亡，死亡率为20%，但以上两组死亡雏鹅和未死亡雏鹅(试验结束后剖杀)剖检均未见脏器尿酸盐沉积性痛风现象，仅表现为肝损伤、肾肿以及输尿管肿胀等现象，第3组雏鹅于攻毒后第4~9天出现死亡，死亡率为56%(图 2)，且有44%的雏鹅(9只死亡雏鹅和2只未死亡雏鹅)剖检脏器表现为尿酸盐沉积性痛风现象(图 3)，以上各组死亡雏鹅均能从肝、肾组织中检测并分离到鹅星状病毒攻毒株。

对攻毒前和攻毒后的雏鹅泄殖腔拭子用RT-PCR的方法进行排毒检测发现，攻毒前雏鹅星状病毒检测为阴性。第1组雏鹅攻毒后排毒规律不明显，于攻毒后第4天才开始出现个别排毒现象，第8~10天达到排毒高峰，此后持续性的排毒并逐渐减弱；第2组雏鹅攻毒后第2天开始陆续排毒，并于攻毒后6~10 d达到排毒高峰；第3组雏鹅攻毒后第2天开始排SDPD毒，到第8天达到排毒高峰，第10天减弱，第12天又出现了一个排毒高峰，而SCCD毒于攻毒后第6天才被检测到，一直持续到攻毒后第12天，并逐渐减弱(图 4)。

由表 4可知，不同鹅星状病毒株对试验雏鹅末重、平均增重及平均增重率有明显影响，均极显著低于对照组雏鹅(P < 0.01)，3个攻毒组试验雏鹅末重、平均增重及平均增重率之间亦有极显著差异(P < 0.01)。

以上数据分析表明，实验室条件下，单一的鹅星状病毒SCCD株或SDPD株均难以复制出典型的鹅痛风病(脏器尿酸盐沉积)，两株鹅星状病毒联合攻毒能复制出与临床发病一致的雏鹅痛风病(脏器尿酸盐沉积)；不同鹅星状病毒株攻毒后均能使雏鹅发生肠炎和腹泻，尤以第1、3组雏鹅最为严重；雏鹅感染不同鹅星状病毒后，排毒规律不同，但排毒至少持续2周；鹅星状病毒对雏鹅增重有极显著影响，按影响程度由大到小排列为“第3组>第1组>第2组”。

2.3 基因组扩增及测序分析

用表 2鹅星状病毒特异性引物对F4代鹅胚尿囊液和F4代LMH细胞液进行病毒的基因组扩增(图 5)，测序并拼接后获得病毒的基因组序列。结果显示，从鹅胚尿囊液中和LMH细胞液中各得到1株鹅星状病毒，即鹅星状病毒SCCD株和鹅星状病毒SDPD株。其中，鹅星状病毒SDPD株与新型鹅星状病毒SD01株(MF772821)基因组氨基酸相似性高达99.4%，属于新型鹅星状病毒(表 5)。鹅星状病毒SCCD株比较特殊，其与鹅星状病毒SDPD株基因组氨基酸相似性仅为48.3%，与鹅星状病毒FLX株(NC034567)基因组氨基酸相似性为93.6%，ORF2基因氨基酸相似性仅为81.0%，与GenBank中已录入的AHDY株(MH410610)基因组氨基酸相似性高达99.4%，ORF2基因氨基酸相似性高达99.3%(表 6)，以上数据表明，新发现的鹅星状病毒SCCD株与AHDY株(MH410610)可能是同类鹅星状病毒的不同临床分离株。按照国际病毒分类学委员会ICTV星状病毒研究小组对星状病毒分类方法提供的参考意见^[15-17]，规定将不同星状病毒株的ORF2基因氨基酸相似性大于75%作为划分同一星状病毒种的依据，本研究中新分离的鹅星状病毒SDPD株与鹅星状病毒FLX株ORF2基因氨基酸相似性为42.5%，属于不同的星状病毒种，故将其命名为新型鹅星状病毒；新分离的鹅星状病毒SCCD株与鹅星状病毒FLX株ORF2基因氨基酸相似性为81%，属于同一星状病毒种，但两者的ORF2基因平均氨基酸遗传距离为0.189，种内变异度较大，大于规定的变异株上限遗传距离0.05，且两者的ORF2基因核苷酸相似性小于93%，建议将其定义为鹅星状病毒FLX的变异株病毒。

2.4 基因组进化分析

分别将鹅星状病毒SCCD株、SDPD株与GenBank上已发表的星状病毒在基因组核苷酸序列、ORF1b基因和ORF2基因所编码氨基酸序列进行比对分析，并绘制遗传进化树(图 6、7)，结果显示，本研究所分离的两株鹅星状病毒分别处于不同的进化分支上，鹅星状病毒SDPD株与2017年以来在我国流行的肾炎型鹅星状病毒相似性最高，处于同一进化分支，属于新型鹅星状病毒；因与鹅星状病毒FLX株存在一定的遗传距离差异，故鹅星状病毒SCCD株和2017年发现的鹅星状病毒AHDY株与2014年发现的鹅星状病毒FLX株处于同一进化分支的不同亚分支。

2.5 血清交叉中和试验

2株鹅星状病毒的交叉中和试验结果：鹅星状病毒SCCD株抗原与SCCD株阳性血清的中和效价为3.95log2，鹅星状病毒SDPD株抗原与SDPD株阳性血清的中和效价为3.72log2，但彼此之间的中和效价为0，即2株鹅星状病毒抗原相关指数R值为0。可以看出2株鹅星状病毒的阳性血清仅能对本病毒产生一定的中和作用，而2株鹅星状病毒之间无抗原相关性。

3 讨论

禽星状病毒常造成胚胎发育迟缓和孵化率下降^[18-22]，体外培养困难。鹅星状病毒FLX株和新型鹅星状病毒HN1G株均未在体外分离培养成功，缺乏其毒力和致病力的相关研究^[23-24]。2017年, 从福建省的狮头鹅上检测到了2株新型鹅星状病毒，患病鹅不能移动，但剖检无典型痛风病变^[25]。2018年，部分学者^[26-28]从患痛风病的雏鹅体内分离到了一种新型鹅星状病毒，并将该病毒在9~13日龄鹅胚上进行传代。本研究将鹅痛风样品在LMH细胞和10日龄鹅胚传代，各获得了1株鹅星状病毒，即新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒；其中，新型鹅星状病毒能在LMH细胞上稳定传代，但不能在鸡胚和鹅胚上稳定增殖，而鹅星状病毒FLX的变异株病毒能够在鹅胚上稳定增殖，且毒力较强，能引起10日龄鹅胚规律性死亡，说明不同鹅星状病毒种对鹅胚或LMH细胞的适应性和致病力有很大差异。

2018年，姜晓宁等^[9]对全国各地采集的143份鹅痛风样品进行了实验室检测和病原分离，禽星状病毒检出率为96.5%，但缺少对病毒的深入分型研究。本研究中的67份典型鹅痛风样品鹅星状病毒检出率为100%，约有94.03%的样品为两种鹅星状病毒混合感染，单纯感染新型鹅星状病毒的样本不到6%，临床上如此高的混感比例似乎表明两种鹅星状病毒与鹅痛风之间存在某种未知关系。将分离到的新型鹅星状病毒接种1~7日龄健康雏鹅，复制出了与临床发病一致的鹅痛风病例，但雏鹅死亡率和典型痛风(脏器尿酸盐沉积，下同)率均明显低于临床发病情况^[26-27]。本研究利用分离到的新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒接种1日龄健康雏鹅，单一任意一种鹅星状病毒均不能使雏鹅发生典型痛风，而两种鹅星状病毒联合攻毒能够复制出44%的典型鹅痛风病例，说明临床上40%甚至更高比例的雏鹅痛风病是两种鹅星状病毒协同作用的结果，该研究进一步明确了鹅星状病毒在鹅痛风病中的作用。

研究表明，禽星状病毒可以造成动物肠炎和发育迟缓综合征^[29-32]。学者们^[23-24]早在2014年从湖南酃县患肠炎的白鹅上分离到了鹅星状病毒FLX株和新型鹅星状病毒HN1G株，表明鹅星状病毒可能与鹅肠炎有关。本研究中，不同攻毒组雏鹅均有腹泻现象，雏鹅增重受到严重影响，极显著低于对照组雏鹅，这可能与鹅星状病毒感染后引起雏鹅肠炎导致消化吸收障碍有关；感染雏鹅通过泄殖腔不断向外界环境排毒，并通过粪口途径反复感染，使得病情进一步恶化。

2014年，Liu(刘宁)等^[23]首次在我国发现了鹅星状病毒HN1G株，Jin(金美玲)等^[28]在2018年将其命名为新型鹅星状病毒，本研究对新分离的鹅星状病毒SDPD株进行基因组测序，并经遗传进化分析后发现其与新型鹅星状病毒氨基酸序列相似性最高，处于同一进化分支，属于新型鹅星状病毒；新分离的鹅星状病毒SCCD株与2017年发现的鹅星状病毒AHDY株(MH410610)亲缘关系最近，但与Zhang(张宇轩)等^[24]在2014年发现的鹅星状病毒FLX株ORF2基因氨基酸相似性存在部分差异，处于相同进化分支的不同亚分支，故将其命名为鹅星状病毒FLX的变异株病毒。

2017年，鹅痛风病在全国大面积暴发，这期间发生的一个重要变化就是鹅星状病毒FLX的变异株病毒的出现，而该变异株在2017年之前却未见报道，对比2017年前后鹅星状病毒毒株的变化，不难得出，鹅星状病毒FLX的变异株病毒在鹅痛风病中起了关键性的作用，两种鹅星状病毒导致鹅痛风病的发病机制尚需进一步研究。另外，“公司+农户”饲养模式和“南繁北养”现状，养殖水平参差不齐，种蛋的集中孵化，往往造成该病快速水平传播，这可能是造成雏鹅早期发病的关键因素，关于新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒能否垂直传播尚需相关数据论证。

4 结论

67份鹅痛风样本中鹅星状病毒的阳性率为100%，这些鹅星状病毒属于两个不同的基因群，即新型鹅星状病毒(基因Ⅱ群)和鹅星状病毒FLX(基因Ⅰ群)的变异株病毒，临床上绝大多数的鹅痛风病是两种鹅星状病毒协同作用的结果。